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1大学微生物学、医学科学和大师的羊毛阁下医院,印度德里- 110095
2大学医学系医学科学学院和导师的羊毛阁下医院,印度德里- 110095
3生物化学、大学医学科学学院和导师的羊毛阁下医院,印度德里- 110095
收到日期:23/05/2014接受日期:20/06/2014
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宿主防御的重要性对念珠菌病和细胞介导免疫在宿主防御中的作用一直是许多研究的主题。念珠菌分离株毒力因素的增加表达的人类免疫缺陷病毒(HIV)患者血清反应阳性的口咽念珠菌病(OPC)也被报道。我们做了一个实验来研究不同辅助T 2型(Th2)和辅助T 1型(Th1)和中性粒细胞呼吸爆发反应的反应,天真的外周血单核细胞(PBMC)和中性粒细胞分别用念珠菌分离研究和控制组织的刺激。三十艾滋病毒血清反应阳性的患者临床证据的OPC,三十个健康的志愿者进行了研究。il - 10释放均匀低浓度的白色念珠菌抗原与健康对照组相比,当白念珠菌分离HIV血清反应阳性的患者作为抗原刺激。当C意味着IFN-aµ§浓度最高。白色的,隔绝健康携带者是用作PBMCs抗原刺激。观察突出显著的il - 10的主导地位,这可能是一个指标的微调宿主免疫系统对慢性进行性疾病状态,表明选择念珠菌菌株的致病潜力。
念珠菌病、艾滋病病毒的免疫力
念珠菌病是最常见的真菌疾病的人类影响粘膜、皮肤、指甲和身体的内部器官。有超过160种念珠菌,大约二十对人类致病性[1 - 2]。念珠菌属的物种被发现身体的共生体在粘膜表面。然而,在免疫力低下的个人(人类免疫缺陷病毒(HIV)感染,中性粒细胞减少,重症监护患者,器官移植)、糖尿病(DM)患者和那些接受抗生素治疗某种形式的粘膜念珠菌病,最常见的口咽念珠菌病(OPC),似乎明显临床[2]。
C。白色的有几个已知的毒力因素导致其致病性,包括坚持上皮和内皮细胞,表达一些酶的形成,分子拟态和抗原调制的假菌丝的形成。
此外,细胞壁相关的甘露聚糖似乎对宿主细胞免疫调节效果(3、4)。
艾滋病毒感染被认为是与菌株的选择C。白色的和一个增强坚持口腔上皮细胞的能力。
更多的选择附着C。白色的可能导致感染艾滋病毒的易感性个体口腔念珠菌病[3]。
也增加了表达分泌天门冬氨酰蛋白酶(saps)似乎与C。白色的隔绝艾滋病毒血清反应阳性的个体(5、6)。
这些证据表明,念珠菌属物种殖民口腔龋齿的感染艾滋病毒的人受到选择压力可能导致菌株的出现改变了基因型和表型特征和增强表达已知的和公认的致病因素[7]。
t细胞介导免疫对假丝酵母宿主防御殖民是很重要的。念珠菌感染的粘膜表面可以扩散到组织Th2反应而相信Th1反应保护[8]。天真的反应外周血单核细胞(PBMC)抗原的刺激也可能有所不同。
当假丝酵母穿透粘膜效应细胞负责其破坏,就会被激活。巨噬细胞和中性粒细胞有能力杀死两个C。白色的blastoconidia和菌丝通过氧依赖性和独立的机制。氧依赖性杀死由中性粒细胞介导的超氧化物阴离子和myeloperoxidase-hydrogen peroxide-halide系统,增加参与的活性氮中间体[9]。
这个,体外研究旨在检查Candida-specific Th1 / Th2反应的天真的外周血单核细胞(PBMC)健康志愿者通过使用从口腔念珠菌抗原病变艾滋病毒血清反应阳性的病人和健康携带者(控制)兴奋剂,和中性粒细胞呼吸爆发活动从健康的志愿者通过完整的细胞念珠菌分离株HIV血清反应阳性的病例和控制。
病人和控制
这个实验室的基础研究是在美国进行的微生物学和抗逆转录病毒疗法(ART)三级保健医院诊所,德里,印度。12个月的研究是在一段时间内进行包括登记、分析和编译的数据。样本大小是随机选择30科目,包括艾滋病毒血清反应阳性的患者口腔念珠菌病的临床证据,参加艺术诊所,构成学习小组和30年龄匹配的健康志愿者作为控制。患者在研究小组从18岁到60岁,被诊断为HIV血清反应阳性的根据国家艾滋病控制组织(纳科)[10]和展现口腔念珠菌病临床指导方针。
从患者获得知情同意是和伦理间隙得到按机构的指导方针。每个病人有权选择退出研究在任何阶段的研究。身份的病人在研究小组是隐藏的。患者对皮质类固醇、抗真菌或anti-neoplastic药物治疗和人诊断为恶性肿瘤,血液恶液质,口腔干燥或慢性肾脏疾病被排除在研究之外。
两个无菌cotton-tipped湿润口腔拭子或被刮削下钝抹刀被用来收集材料从口腔病变组织研究和控制。3毫升血液样本取自健康志愿者在乙二胺四乙酸(EDTA)瓶,保持适当的无菌预防措施,PBMCs分离和中性粒细胞。
拭子受到直接显微镜和文化Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA)用抗生素(氯霉素5毫克/毫升&庆大霉素2毫克/毫升),使用标准的实验室技术。念珠菌属物种形成是使用传统的表型方法按标准程序[1,2]。
念珠菌抗原制备Rimek协议后et al . [11]。每个真菌隔离种植在SDA盘子一到两天温度在25度。制备的抗原提取物、四到五殖民地的酵母(经显微镜检查)悬浮在2毫升无菌磷酸盐(PBS;HiMedia,孟买,印度;pH值7.2)。真菌悬浮液漩涡,麦克法兰硫酸钡密度标准调整为0.5。整除的标准悬挂在PBS(500μl)转移到1.5毫升管,保存在一个沸水浴5分钟,随后在10000 x g离心10分钟。浮在表面的分布在1.5毫升管和储存在温度-20 C。抗原提取的蛋白质浓度估计由吸光度在280 nm和260 nm)采用公式
浓度(毫克/毫升)=(1.55×吸光度在280海里)-(0.76×吸光度在260海里)(12、13)。
隔离PBMCs
PBMC隔离完成从外围健康志愿者的静脉血,用HiSep (HiMedia,孟买,印度)。血液在HiSep轻轻分层沿管的墙壁的避免和解决方案和混合的血液离心250 x g在室温下30分钟。PBMCs HiSep交界处和等离子吸气。上等离子层小心地吸气用吸管在0.5厘米的不透明的接口,以避免污染与其他细胞类型,并被丢弃。不透明的接口被转移到无菌的锥形管10毫升的汉克斯平衡盐溶液(哈佛商学院;HiMedia,孟买,印度)添加和低速离心去除无关的血小板。上层清液被丢弃和细胞颗粒被洗两次5毫升的哈佛商学院在250 x g十分钟。细胞的生存能力是衡量台盼蓝排斥在纽鲍尔的房间。1毫升的细胞被resuspended罗斯威尔公园纪念研究所介质(RPMI) 1640中10%胎牛血清,100国际单位/毫升青霉素,链霉素100μg /毫升、两性霉素B 25μg /毫升、2毫米L -谷氨酰胺(HiMedia,孟买,印度)在最后一个单元的浓度1×106细胞/毫升[14]。
刺激PBMCs念珠菌抗原
PBMCs (1×106/毫升)分布在24孔板1毫升的RPMI 1640用抗生素和10%胎牛血清和刺激0.05μg / ml, 0.5μg /毫升和5μg /毫升的念珠菌抗原。佛波醇醋酸myristate-12 (PMA;Sigma-Aldrich、印度)100 ng / ml的浓度作为积极的控制。抗原浓度选择基于出版文献和初步滴定实验在我们实验室[15]。盘子在48小时孵化有限公司2孵化器在5%二氧化碳浓度和温度37 C .上层清液在1.5毫升管储存在温度- 70 C细胞因子分析。
人类il - 10和干扰素-ᵧELISA
细胞因子分析使用il - 10和干扰素-ᵧ酶联免疫试剂盒(Diaclone,韦尔登生物科技、印度),固相的夹心ELISA的体外定性和定量测定il - 10和干扰素-ᵧ,浮层。il - 10在每个样本和干扰素-ᵧ抗原刺激PBMCs是量化在96年商用设备使用16井为标准。测试样本一式四份研究和对照组获得il - 10和干扰素-ᵧ峰值浓度,浓度与不同抗原刺激后来自白念珠菌(艾滋病毒血清反应阳性的患者)即0.05μg /毫升,0.5μg /毫升和5μg /毫升。绘制标准曲线是用来精确确定样品中细胞因子的浓度测试。
中性粒细胞分离葡聚糖沉积方法[16]
2毫升5%右旋糖酐(Sigma-Aldrich、印度)的解决方案是在玻璃试管底部。添加了两毫升的全血和两毫升无菌生理盐水稀释。整个悬架是在室温下混合,站了三十分钟。浮在表面的等离子体分离和分层两毫升Hisep (HiMedia,孟买,印度)和离心机在1800转/分钟30分钟。上层的删除和丢弃,细胞颗粒用1毫升哈佛商学院(HiMedia,孟买,印度)。剩余的红细胞被添加0.5毫升的0.2%生理盐水溶解在37°C一分钟。肌肉弹性恢复通过添加0.5毫升的1.6%生理盐水。
产生的悬浮再次离心机在1400年革命/分钟5分钟。
上层清液都被丢弃而沉积物resuspended一毫升的哈佛商学院(HiMedia,孟买,印度)。细胞数在纽鲍尔的室和调整2×106 /毫升的浓度在哈佛商学院(HiMedia,孟买,印度)。
念珠菌的制备分离悬浮[17]
四到五个殖民地的念珠菌分离从SDA板和五毫升的营养肉汤培养以1%葡萄糖,在30°C温度7到8天。暂停念珠菌分离株在1500×g离心10分钟。
上层清液被丢弃,造成颗粒与PBS洗两次(HiMedia,孟买,印度;pH值7.2)。颗粒在gelatin-HBSS resuspended (HiMedia,孟买,印度)的浓度1 - 2×107细胞计数/毫升的纽鲍尔的房间。
氮蓝四唑(电视台)染料还原试验的吞噬作用[17]
三个水平井ELISA板标记为测试,积极的和消极的控制。100 μl of suspended neutrophils (2 × 106/ml ), 100μl of NBT, 100 μl of Candida cells and 50 μl of HBSS (HiMedia, Mumbai, India) was added in test well. 50 μl of PMA (Sigma-Aldrich, India) and 50 μl of HBSS (HiMedia, Mumbai, India) were used as positive control and negative control, respectively. The ELISA plate was covered and incubated at 37°C for 30 min. The amount of formazan produced was measured at 550 nm in an ELISA reader. The results were expressed as absorbance at 550 nm per 2 × 106细胞。
统计分析
标准错误(SE)和95%可信区间(CI)计算。定量差异生产通过PBMCs促有丝分裂的细胞因子和/或抗原刺激和定量差异甲瓒生产电视台染料还原试验,研究和控制组织,被Mann-Whitney U事后考验。定量变量研究和对照组之间被独立t检验测试。在所有情况下,意义被定义为p < 0.05。
艾滋病毒血清反应阳性的患者在检查口腔,舌头或粘膜白斑是主要的病变,在男性(65%)和女性(60%)。混合病变被认为在某些病人的(表1)。
表1:艾滋病毒血清反应阳性的患者口腔病变的分布。
共有30个样本的艾滋病毒血清反应阳性的患者,白念珠菌分离出70%的口腔病变白念珠菌和c . krusie被发现共存于一个样本。在健康对照组,所有(23.33%)显示白念珠菌的生长。il - 10浓度的平均值是68.13 pg / ml, 77.50 pg / ml和93.93 pg / ml,分别高于均值干扰素-ᵧ浓度12.33 pg / ml, 16个pg / ml, 22.5 pg / ml分别在相似的抗原浓度。93.93 pg / ml的il - 10浓度和干扰素-ᵧ22.5 pg / ml被认为是最佳的浓度进行进一步分析。
il - 10释放抗原刺激PBMCs在任何浓度均匀低抗原时来自白念珠菌分离出健康的志愿者。il - 10的水平是19.50 pg / ml, 30.95 pg / ml和49.90 pg / ml抗原浓度0.05μg / ml,分别0.5μg /毫升和5μg /毫升(图1)。干扰素-ᵧ水平40.45 pg / ml, 51.50 pg / ml和61.75 pg / ml分别与抗原浓度,这是更高的抗原浓度(表3)。有丝分裂原(PMA 100 ng / ml) PBMCs刺激,分泌il - 10浓度351.38 pg / ml (表2)和干扰素-ᵧ366.3 pg / ml的浓度(表3)。
表2:il - 10后的PBMCs刺激做出的反应假丝酵母从学习小组获得的抗原
表3:干扰素-γ响应与念珠菌抗原刺激PBMCs后获得学习小组
图1:白介素(IL) -10响应外周血单核细胞(PBMCs)健康志愿者的念珠菌抗原刺激人类免疫缺陷病毒(HIV)血清反应阳性的患者和健康对照组。
图2:干扰素(IFN) -γ回应的外周血单核细胞(PBMCs)健康志愿者的念珠菌抗原刺激人类免疫缺陷病毒(HIV)血清反应阳性的患者和健康对照组。
中性粒细胞反应与C刺激。白色的获得艾滋病毒血清反应阳性的患者显示平均OD 0.8497与中性粒细胞反应没有显著变化刺激与C。白色的获得健康携带者(OD的0.8235)。PMA作为积极的控制,显示平均OD值为0.8233时表示,中性粒细胞的可行的状态。
念珠菌属物种被发现身体的共生体在粘膜表面。免疫力低下的个人,糖尿病人接受抗生素治疗,某种形式的粘膜念珠菌病通常清单,作为OPC最常见。白念珠菌是最常见的物种在这些OPC病人被观察到在我们的研究中。开发OPC的机制涉及的相互作用增加毒性C的属性的表达式。白色的和缺陷在感染组患者的免疫防御机制(3、5、6)。OPC是最常见的机会性真菌感染艾滋病毒感染的患者,据估计,超过90%的艾滋病毒感染患者开发这个虚弱的感染,在一段时间进展的疾病[18]。
CMI主要作用在免疫防御系统在当地和系统性水平这两个组的患者。在急性期反应,中性粒细胞发挥重要作用和缺陷在他们的反应,如艾滋病毒感染患者可以成为有害的主机(19、20)。适应性免疫反应包含口腔念珠菌病也发挥重要的作用。单核细胞产生的细胞因子和Th1 / Th2子集的T辅助细胞决定的发展早期OPC一小块没有治愈慢性黏膜与皮肤的念珠菌病(CMC),或甚至可能负责其分辨率[21]。念珠菌属菌株选择的角色在这些底层压力条件下可能导致毒性的增加表达属性导致更多的慢性和暴发性口腔念珠菌病,是由其他工人建立[-]。
本研究是为了确定不同种类的念珠菌的流行,从艾滋病毒分离血清反应阳性的患者口腔念珠菌病。这项研究还评估急性和适应性差异(慢性)对不同株念珠菌宿主免疫反应物种与艾滋病毒血清反应阳性的病人和健康携带者(控制)。
在我们的研究中Pseudomembranous变体(白片)是最常见的临床表现的OPC如先前的研究[24]所述。三十的艾滋病毒血清反应阳性的患者有65%的男性和60%的女性提出了在舌头或口腔粘膜白斑。白念珠菌是存在于70%的病人出现在舌头和粘膜白斑艾滋病毒血清反应阳性的病人。在一个病人白念珠菌和c . krusie孤立从同一病变,暗示混合感染;在这个病人症状严重和难以治疗。
白念珠菌的马车在健康对照组是23.33%。早期的研究报道运输率从31%到55%不等健康adults25没有任何症状。假丝酵母马车低至20%也被报道在一般人群中,匹配我们的研究的结果。
组织病理学结果显示,只有少数念珠菌菌丝与萎缩性上皮在红斑的念珠菌病,而众多生物入侵被发现的口腔上皮棘细胞层pseudomembranous指示高致病性念珠菌病的潜力在高风险条件下这些隔离。
il - 10和TNF-β抗炎细胞因子,抑制促炎细胞因子的分泌,影响抗真菌效应被吞噬细胞功能。这些细胞因子可能发挥保护作用后感染过程中当解决炎症过程是必要的。因此仔细细胞因子之间的平衡需要维护,影响细胞功能的编排。
在我们的研究中念珠菌抗原与研究和控制组织被用来刺激PBMCs来自健康的志愿者。当PMA (100 ng / ml)用作PBMCs兴奋剂,il - 10浓度是351.38 pg / ml,干扰素-γ浓度是366.3 pg / ml。如此高的细胞因子的浓度表示PBMCs的健康状态。
意味着il - 10 (93.93 pg / ml)峰值浓度最高时C。白色的隔绝HIV阳性患者作为抗原刺激和最低(19.5 pg / ml)与C。白色的隔绝健康航母作为抗原刺激。il - 10浓度的增加学习小组和控制可能表明一个增强的可能性表达毒性因素导致压力选择在艾滋病毒血清反应阳性的病人,和这些菌株的能力克服防护Th1反应让他们生存压力下(22、23)。随后这可能使更重型的口腔念珠菌病导致慢性黏膜与皮肤的念珠菌病的发展由于免疫系统的失衡[21]。另一个不寻常的观察是一个高意味着il - 10水平与C.krusie抗原浓度与艾滋病毒血清反应阳性的病人作为刺激,比控制。在这方面,还需要进一步的实验来研究致病性C.krusie的潜力。
意思是干扰素-ᵧ(61.75 pg / ml)浓度最高时C。白色的,与健康的运营商是用作PBMCs抗原刺激,在浓度不大于5μg /毫升。这将证实这两种细胞因子的经典Th1-Th2范式是负相关的。在健康携带者念珠菌的过度生长,保持在检查各种先天和适应性免疫反应策略,在Th1细胞因子(IFN -γ)有一个占主导地位的作用,和维护一个免疫balance1。同桌的压力,当他们面对一个与理想的免疫微环境守夜,可能表达毒性属性,否则免疫活性的个人。
念珠菌菌株的行为与艾滋病毒血清反应阳性的患者细胞因子的反应突显出一个事实:有一个显著的IL 10的主导地位,这是一个适应宿主免疫系统对慢性进行性疾病条件表明这些念珠菌菌株的致病性可能在运输过程中从一个限制性的环境主管主办的一个障碍自由破坏主机。干扰素-γ的最小剂量反应只表明抑制Th1细胞分化及其反candidicidal作用可以忽略不计当遇到这些病原体[25]。
中性粒细胞呼吸爆发反应测量而言,意味着OD获得减少电视台染料后甲瓒(复合)深蓝色颜色超氧化物阴离子。在这项研究中,我们试图研究宿主-病原体相互作用,通过使用念珠菌菌株的病人学习小组和刺激中性粒细胞来源于健康的捐赠者。念珠菌属菌株分离研究和控制组织刺激中性粒细胞和生成一个类似急性反应。在早期的体外研究中,不正常的急性期反应生成对酵母细胞被归因于有缺陷的趋化性,中性粒细胞和单核细胞的吞噬作用和细胞内杀死能力的艾滋病毒血清反应阳性的患者[日]。我们的研究也与之前的研究结果相一致,无显著差异在急性期反应是观察,通过使用不同株念珠菌作为健康志愿者的中性粒细胞的兴奋剂。它还强调,中性粒细胞并不是唯一的细胞负责但细胞介导免疫也扮演着相当重要的角色。
宿主病原体相互作用的光谱动态事件包括总沉默发出噪音近乎混乱。在这个序列中,决定消除微生物或保留它作为共生体需要微调的免疫反应根据阈值限制。
越过卢比孔河会使平衡;因此升高IFN-gamma表明宿主的免疫决定消除代理是不可取的。相反,升高il - 10表明主人的决定保留代理的病原体。在这些极地结束之间,摇摆不定的主机到达决定之前不过是无助的尝试它的功能操作结果增加干扰素-γ以及il - 10;这是一个暂时的免疫状态等待最后的决定。病原体因素,取决于它是无情或阴险的可以使平衡方式。
支持的工作是校内的格兰特的大学医学科学&大师的羊毛阁下医院,德里,印度。
