不同提取物的体外抑制作用毛壳菌属Cupreumα-葡糖苷酶、α-淀粉酶和Hepg2癌细胞

文摘

摘要目的:本研究调查的影响土壤分离真菌c cupreumα-葡糖苷酶、α-淀粉酶和HepG2癌细胞。

方法:c . cupreum提取物的抗糖尿病的效果是由α-glucosidaseα-amylase抑制化验和抗癌活性是通过MTT试验。

结果:α-glucosidase酶的抑制作用观察c . cupreum提取物的乙酸乙酯提取的值57.88±0.05,其次是正丁醇提取物21.27±0.04,15.19±0.05甲醇提取物和氯仿提取12.34±0.01 100μg /毫升。而对α-amylase酶的抑制作用正丁醇提取值为53.70±0.10,其次是乙酸乙酯提取31.81±0.05,20.51±0.05甲醇提取和氯仿提取16.00±0.05 100μg /毫升浓度。的抗癌活性,正丁醇提取c . cupreum显示重要的对HepG2细胞毒性作用癌细胞IC50值在300μg /毫升。

结论:我们的研究得出结论:c . cupreum提取物具有潜力植物化学物质这将是有用的在治疗糖尿病药和抗癌治疗后纯化和表征

关键字

α-glucosidaseα-amylase,麻省理工,毛壳菌属cupreum,餐后高血糖,糖尿病,癌症活动

介绍

糖尿病是一种复杂的代谢紊乱特点是高血糖引起的缺乏胰岛素激素影响了全世界无数的人。据估计,2011年有3.66亿人患有糖尿病和预计到2030年,被国际糖尿病联合会2030年[5.52亿份报告1]。在印度有4090万人患有糖尿病,预计到2025年将增加到6090万(2]。在2014年,有3.87亿人患有糖尿病和预计为5.92亿到2035年(3- - - - - -5]。据估计,2013年在非洲1980万人患有糖尿病,预计是4140万到2035年(6]。2014年在厄立特里亚,成年人发现4.89%的糖尿病率(7]。在美国,8%的成年人患有糖尿病和事业双重增加年龄相关的死亡率(8]。在沙特阿拉伯糖尿病的一项研究报告称,4004年的16917(23.7%)患有糖尿病组30 - 70岁之间,被发现在城市地区的25.5%相比,农村19.5%的沙特人(9]。一种可能的途径预防糖尿病是通过控制餐后高血糖症的抑制α-glucosidase和α-amylase酶存在于胃肠道(10]。这两种酶的抑制减少碳水化合物水解,葡萄糖的吸收,从而降低餐后血糖上升(11]。

酶的功能α-amylase是淀粉的消化而α-glucosidase有助于葡萄糖的吸收,因此这两个酶参与的控制餐后高血糖症(12- - - - - -15]。α-amylase由胰腺和唾液腺分泌的催化作用的水解α-D - (1 - 4) -glucosidic联系的淀粉生产麦芽糖和葡萄糖,而另一个肠道酶α-glucosidase (isomaltase和蔗糖,麦芽糖酶)从麦芽糖释放葡萄糖和蔗糖(16,17]。因此,抑制α-amylaseα-glucosidase是控制血糖水平的一个方法(18,19]。有许多合成抑制剂如阿卡波糖、voglibose和miglitol用于II型糖尿病20.]。然而,这些抑制剂有一些副作用,如肝脏疾病、肠胃气胀、腹泻等肠道紊乱。

据全球癌症统计,肝细胞癌(HCC)是第三个全球癌症死亡最常见的原因(21),估计有782000人确诊为肝癌,其中746000人死亡(22]。肝癌的发病率在西方国家是4到15每100000人,而亚洲和非洲是120每100000人(23]。肝脏致癌作用是由各种因素引起的,如乙型肝炎病毒、丙型肝炎感染、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、黄曲霉毒素B1,糖尿病、酒精和铁积累(24]。

丝状真菌已经用于生产不同的天然产品,如酶、抗生素、色素、添加剂和其他用于化妆品、食品和制药应用程序(25]。天然产物来自植物和动物源展览一些缺点如低溶解性和不稳定性26]。另一方面,由于环境和合成色素/化合物的毒性问题产业正在寻找替代来源的微生物天然化合物(27- - - - - -31日]。镰刀菌素的真菌成员、红曲霉属真菌,青霉菌和毛壳菌属物种产生高色素胞内和胞外色素生产不同的颜色从红色、黄色和橙色(29日- - - - - -35]。大多数这些真菌菌株(和non-mycotoxigenic给人类。真菌产生不同类型的酶和二次代谢物与各种活动与环境生存和竞争。

由于增加药物毒性和耐药性搜索的另一种选择是很重要的新药从自然资源,如真菌。天然化合物研究的一个替代具有强有力的抑制特性和最小的副作用。毛壳菌属物种产生的一类次生代谢产物称为azaphilones。Azaphilones真菌色素pyrone-quinone结构和高含氧bicyclical核心与手性季中心(36,37]。Azaphilones具有抗菌,抗癌,抗病毒,抗氧化,抗真菌和抗炎活动的生产vinylogousχ-pyridones [38,39]。这项研究的目的是调查不同的提取c . cupreum治疗糖尿病药和抗癌活动。

材料和方法

真菌的分离和鉴定

毛壳菌属cupreum隔绝的垃圾收集土壤样本GKVK校园,班加罗尔,印度卡纳塔克邦。隔离是由连续稀释法对马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。被确认为孤立的真菌c . cupreum-SS02基于形态和显微特征(40]。形态的身份被NFCCI证实,Agharkar研究所、印度浦那。基于分子的物种识别系统发生学的内部转录间隔区(ITS)地区使用通用引物;1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)正向引物和其4 TCCTCCGCTTATTGATATGC)是反向引物进行41]。执行搜索同源序列在创银行使用爆炸(国家生物技术信息中心;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)[42]。爆炸执行搜索的序列分析显示,99%与其他菌株的同源性c . cupreum在创银行可用。序列与加入数字KF668034存入NCBI基因库。文化被存入国家印度真菌培养物保藏(NFCCI),与加入号码NFCCI 3117。孤立的真菌在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)是维护板块和马铃薯葡萄糖琼脂偏在4°C。

剂制备、发酵

剂制备的真菌生长在25°C在PDA上板7天,然后5毫米菌丝体的光盘是无聊从殖民地和转移到250毫升的外围厄伦美厄烧瓶内包含100毫升的马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)和孵化26岁±2°C在120 rpm旋转瓶20天达到最高的颜料生产。

胞外色素的提取

色素的提取是根据先前描述的方法(43]。经过20天的孵化生物质被通过绘画纸1号滤纸过滤和包含细胞外的肉汤颜料/代谢物。文化肉汤获得用于颜料/化合物的提取液-液法在500毫升的分液漏斗使用四种不同的有机溶剂从非极性、极性(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇)在1:1的比例。50毫升的肉汤和50毫升溶剂过滤是在分液漏斗,动摇了20分钟,待水层和有机层分离。有机层收集,透过绘画纸1号滤纸和烧杯转移到250毫升。这个过程重复三次相同的肉汤和相同的溶剂,直到没有更多的色素扩散到溶剂。整个汤被使用类似的过程和氯仿提取,乙酸乙酯,正丁醇和甲醇。然后有机层使用真空旋转蒸发器蒸发在45°C。原油干提取获得和储存在4°C,以供将来使用。

α-Glucosidase抑制试验

的影响c . cupreum提取物的抑制α-glucosidase活动决心根据金(描述的方法44]。真菌提取物是准备作为一个股票通过溶解5毫克/毫升的DMSO浓度。3.0毫米的反应混合物由250名μl 4-nitrophenylα-D-glucopyranoside (PNPG)作为底物溶解在20毫米磷酸盐缓冲剂(pH值6.9),100年μl(100μg /毫升在DMSO)c . cupreum提取(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇提取物)和100μlα-glucosidase解决方案(1.0 u /毫升)0.01磷酸盐缓冲剂(7)pH值和反应混合物在25°C孵化20分钟。孵化后,反应停止通过添加2毫升0.1碳酸钠(Na2CO3)。α-glucosidase活动是由测量黄颜色的对硝基酚释放对硝基酚吡喃葡萄糖苷(PNPG)在420海里。控制样本包括所有试剂和酶,用DMSO溶液代替示例。α-glucosidase的抑制活动是由下列公式计算:

% =((抑制₀——一个₁)/₀)* 100……1

在那里,一个₀控制样品的吸光度和吗₁的吸光度测试提取。

α-Amylase抑制试验

的影响c . cupreum提取物的抑制α-amylase活动确定了根据该方法如前所述[45]。反应混合物由250μl(100μg /毫升DMSO)c . cupreum提取(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇提取物),250μl 0.02钠磷酸盐缓冲剂(pH值6.9)和100μlα-amylase解决方案(0.5毫克/毫升)。这个解决方案在250 c孵化10分钟。孵化后250μl 1%淀粉溶液在0.02钠磷酸盐缓冲剂(pH值6.9)添加和进一步孵化25°C 10分钟。的反应是通过添加500μl终止3 5-dinitrosalicylic酸(DNS)试剂。反应管被孵化在沸水5分钟,冷却到室温。α-amylase活动是由使用分光光度计测量吸光度在540海里。控制样本包括所有与酶试剂,用DMSO溶液代替样品。α-amylase抑制的c . cupreum提取被给定的计算公式:

% =((抑制₀——一个₁)/₀)* 100……2

在那里,一个₀的吸光度控制和一个₁的吸光度测试提取。

抗癌活性

细胞培养和维护

的癌症细胞系HepG2(肝癌)是获得国家细胞培养科学(国立),印度浦那。细胞培养瓶中的细胞培养使用杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)营养混合物F-12汉姆补充10%胎牛血清的边后卫,15毫米玫瑰,NaHCO₃、吡哆醇、谷酰胺。细胞保持在5%的股份有限公司₂孵化器在37ºC。

细胞生存能力分析

的细胞毒性c . cupreum提取物对肝癌HepG2细胞是由麻省理工(3 - (4 5-dimetylthiazol-2-yl) 2、5溴化diphenyltetrazolium)测定如前所述[46]。HepG2镀肝癌细胞(1×10⁴细胞/)通过添加200μl细胞悬液的每个好96 -好微量滴定板(nun96ft - nunclon - 96平透明)。板是孵化在37°C调湿大气中5%的股份有限公司₂24小时保证附件和80%到100%的融合。24小时后,媒体吸气了,取而代之的是新媒体(200μl)包含c . cupreum不同浓度的提取(25μg /毫升,50μg /毫升,100μg /毫升,150μg /毫升,200μg /毫升,250μg /毫升和300μg /毫升)。板是孵化在37°C公司为5%₂为24小时。孵化后,媒体吸气了,取而代之的是新的媒体包含20μl MTT试剂(2毫克/毫升PBS)总量的200年μl被添加到每个在37°C的环境,公司为5%₂2到3个小时。孵化后,MTT包含介质被温柔地和200μl DMSO /溶解甲瓒晶体了。控制样本包括所有试剂HepG2细胞取代DMSO的样本。吸光度测量在585 nm使用680型微型板块读者(Shimadza uv - 1800)。比例的细胞生存能力是根据以下方程来计算(47]。

比例的细胞生存能力= (OD控制细胞的细胞治疗/ OD) * 100………。3

药物的浓度,抑制50%的细胞(IC₅₀对这些样本计算值)。

统计分析

所有的测量都是一式三份,表示为平均值±标准差。统计学意义的数据进行了分析使用单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni多个比较测试。垫棱镜与图6软件(图垫软件公司,美国)。p < 0.05的概率值被视为具有统计学意义。

结果

的识别c . cupreum

真菌是确定形态的基础上,微观和分子系统发生学涉及其- 5.8 - s rDNA和命名的地区c . cupreumSS02。在形态学c . cupreum表现出典型的雪白的菌丝体的殖民地在PDA上。

的影响c . cupreum提取在α-Glucosidase抑制

的c . cupreum提取α-glucosidase抑制特性进行了研究。每一个的抑制百分比显示c . cupreum提出了提取的图1。在四个不同的提取c . cupreum研究,乙酸乙酯提取物显示抑制百分比值为57.88±0.05,其次是正丁醇提取物21.27±0.04,15.19±0.05甲醇提取物和氯仿提取12.34±0.01 100μg /毫升。α-glucosidase抑制活动显示了乙酸乙酯提取与集成电路₅₀价值86.38μg /毫升浓度。α-glucosidase酶抑制百分比最高的是乙酸乙酯提取所示,而甲醇提取显示最低α-glucosidase抑制百分比。的c . cupreum提取物显示出显著性差异(p < 0.0001),其次是Bonferroni的多重比较检验。

的影响c . cupreum提取在α-amylase抑制

每个α-amylase酶的抑制百分比显示c . cupreum提出了提取的图2。不同的提取c . cupreum研究,α-amylase酶的抑制百分比显示了正丁醇提取的值53.70±0.10,其次是乙酸乙酯提取31.81±0.05,20.51±0.05甲醇提取和氯仿提取16.00±0.05 100μg /毫升。最高α-amylase抑制活性的正丁醇提取物c . cupreum与集成电路₅₀价值93.10μg /毫升浓度。α-amylase抑制百分比最高的是正丁醇提取而氯仿提取所示显示最低α-amylase抑制百分比。结果,观察到c . cupreum提取物显示出显著性差异(p < 0.0001),其次是Bonferroni的多重比较检验。

的影响c . cupreum对HepG2细胞提取

的体外效果c . cupreum提取物对HepG2提出了图3。比例显著减少观察细胞生存能力在不同浓度对HepG2癌细胞治疗24小时后。最大百分比减少细胞生存能力c . cupreum提取物在正丁醇提取的值51.68±0.01,其次是乙酸乙酯提取43.45±0.01,30.94±0.01甲醇提取物和氯仿提取24.04±0.07 300μg /毫升浓度后24小时。的集成电路₅₀值的正丁醇提取物c . cupreum被发现在300μg /毫升治疗24小时后。从我们的研究结果表明正丁醇提取的化合物c . cupreum可能是可能对肝细胞癌的治疗目标。有显著性差异(p < 0.0001),其次是Bonferroni测验后的测试。

讨论

在糖尿病治疗方法包括抑制α-amylaseα-glucosidase这将导致延缓碳水化合物的消化和减少葡萄糖的吸收从而降低餐后血糖水平高血糖(48]。因此,碳水化合物消化酶的抑制可能是最有效的方法来控制糖尿病(49]。目前,α-glucosidase抑制剂和α-amylase使用阿卡波糖,miglitol和voglibose50]。碳水化合物消化它们抑制麦芽糖转化为葡萄糖,因此减少葡萄糖进入血液循环的速度(51]。我们的研究表明,所有的c . cupreum提取α-glucosidase和α-amylase活动表现出抑制作用。然而,最大α-glucosidase抑制乙酸乙酯提取的c . cupreum然而,最大α-amylase抑制的正丁醇提取物c . cupreum。在文献中没有信息的α-glucosidase和α-amylase抑制活动真菌c . cupreum。因此,我们的研究评估了体外α-glucosidase和α-amylase抑制土壤分离出真菌的活性c . cupreum。α-glucosidase和α-amylase的抑制c . cupreum提取将导致的缓慢水解碳水化合物从而降低葡萄糖的速率从小肠吸收,从而控制高血糖症的病情可能通过抑制碳水化合物消化的酶(52,53]。

在我们的报告中,我们首次展示了这一点c . cupreum归纳提取作为抗癌剂的剂量依赖HepG2细胞凋亡。这项研究的结果进一步表明在体外和体内研究深度。未来的研究可能是有用的积极成果c . cupreum化合物作为肝细胞癌治疗的新化合物。因此,这些生物的活动c . cupreum提取可能是由于植物化学物质存在于它。未来的研究可能是有用的积极成果c . cupreum化合物作为抗糖尿病的新型化合物和肝细胞癌的治疗。

结论

这些发现表明,c . cupreum提取是有效的抑制剂对α-葡糖苷酶和α-淀粉酶酶,这可能有助于降低餐后血糖水平。同时,c . cupreum已经显示明显抗癌活动对HepG2癌细胞。这项研究的结果表明,在体外和体内研究深度c . cupreum提取并净化和描述的化合物。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢UGC(大学拨款委员会),新德里,印度政府为UGC-MRP赠款资金支持以及头部,微生物学和生物技术(m & BT),班加罗尔大学班加罗尔(婴儿),卡纳塔克邦,印度为实验室设备的使用。

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