铜毛菌不同提取物对α -葡萄糖苷酶、α -淀粉酶及Hepg2癌细胞的体外抑制作用

摘要

摘要目的:本研究研究了土壤分离真菌C. cupreum对-葡萄糖苷酶、-淀粉酶和HepG2癌细胞的影响。

方法:采用α-葡萄糖苷酶抑制法和α-淀粉酶抑制法测定铜铜提取物的抗糖尿病作用，采用MTT法测定铜铜提取物的抗癌作用。

结果:在100 μg/ml浓度下，铜铜提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用以乙酸乙酯提取物为次之(57.88±0.05)，正丁醇提取物为21.27±0.04，甲醇提取物为15.19±0.05，氯仿提取物为12.34±0.01。100 μg/ ml浓度下，正丁醇提取物对α-淀粉酶的抑制作用为53.70±0.10，其次为乙酸乙酯提取物31.81±0.05，甲醇提取物20.51±0.05，氯仿提取物16.00±0.05。在抗癌活性方面，铜铜正丁醇提取物对HepG2癌细胞具有明显的细胞毒作用，IC50值为300 μg/ml。

结论:本研究表明，铜草提取物具有开发潜力植物化学物质纯化和鉴定后，将有助于抗糖尿病和抗癌治疗

关键字

α-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶，MTT，铜毛菌，餐后，高血糖，糖尿病，癌症活性

简介

糖尿病是一种代谢紊乱以缺乏血糖引起的高血糖为特征胰岛素激素影响了全世界无数人。2011年，估计有3.66亿人患有糖尿病，到2030年，国际糖尿病联合会预计这一数字将达到5.52亿[1］．在印度，有4090万人患有糖尿病，预计到2025年将增长到6090万人[2］．2014年，全球有3.87亿人患有糖尿病，预计到2035年这一数字将达到5.92亿[3.-5］．据估计，2013年非洲有1980万人患有糖尿病，预计到2035年这一数字将达到4140万人[6］．2014年，厄立特里亚成人糖尿病发病率为4.89% [7］．在美国，8%的成年人患有糖尿病，导致年龄相关死亡率增加两倍[8］．沙特阿拉伯的一项糖尿病研究报告称，16917人中有4004人(23.7%)在30-70岁之间患有糖尿病，城市地区的糖尿病患者比例为25.5%，而农村地区的糖尿病患者比例为19.5% [9］．一种可能的方法预防通过抑制胃肠道中存在的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶来控制餐后高血糖[10］．抑制这两种酶可降低碳水化合物水解和葡萄糖吸收，从而降低餐后血糖升高[11］．

α-淀粉酶的功能是消化淀粉，而α-葡萄糖苷酶有助于葡萄糖的吸收，因此这两种酶都参与控制餐后高血糖[12-15］．胰腺和唾液腺分泌的α-淀粉酶催化淀粉的α-D-(1-4)-糖苷键水解产生麦芽糖和葡萄糖，而另一种肠道酶α-葡萄糖苷酶(麦芽糖酶、异麦芽糖酶和蔗糖)则从麦芽糖和蔗糖中释放葡萄糖[16，17］．因此，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是控制血糖水平的方法之一[18，19］．有许多合成抑制剂，如阿卡波糖，伏格列波糖和米格列醇用于II型糖尿病[20.］．然而，这些抑制剂有一些副作用，如肝脏疾病、胀气、腹泻和其他肠道紊乱。

根据全球癌症统计数据，肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的第三大常见原因[21]据估计，在被诊断为肝癌的78.2万人中，有74.6万人死亡[22］．西方国家肝癌发病率为10万分之4至15，而亚洲和非洲为10万分之120 [23］．肝癌是由多种因素引起的，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎感染、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、黄曲霉毒素- B1、糖尿病、酒精和铁积累[24］．

丝状真菌已被用于生产不同的天然产品，如酶、抗生素、着色剂、添加剂和许多其他用于化妆品、食品和制药的应用[25］．植物和动物来源的天然产物具有低溶解度和不稳定性等缺点[26］．另一方面，由于合成色素/化合物的环境和毒性问题，工业正在寻找微生物作为天然化合物的替代来源[27-31］．据报道，镰刀菌、红曲、曲霉、青霉菌和毛囊菌属的真菌成员在细胞内和细胞外都能产生大量色素，颜色从红色、黄色和橙色不等[29-35］．这些真菌菌株大多对人类无致病性和无霉菌毒素。真菌产生不同类型的酶和次生代谢产物，具有不同的活性来生存和与环境竞争。

由于药物毒性和耐药性的增加，从天然来源(如真菌)中寻找新药的替代品非常重要。天然化合物抑制活性强，副作用小，是目前研究的热点之一。毛囊类产生一类次级代谢产物，称为氮杂唑酮。Azaphilones是一种真菌色素，具有吡喃醌结构，具有高氧双环核和手性四元中心[36，37］．氮杂氮酮通过生成乙烯基χ-吡啶酮具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗真菌和抗炎活性[38，39］．这项研究的目的是研究不同的提取物c . cupreum抗糖尿病和抗癌的功效。

材料与方法

真菌的分离鉴定

铜毛菌是从印度卡纳塔克邦班加罗尔的GKVK校园收集的土壤样本中分离出来的。以马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)为培养基，采用连续稀释法进行分离。分离出的真菌被鉴定为c . cupreum-SS02基于形态学和微观特征[40］．形态鉴定由NFCCI, Agharkar研究所，浦那，印度确认。基于内部转录间隔区(ITS)的分子系统发育，使用通用引物进行物种鉴定;ITS-1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)为正向引物，ITS-4 TCCTCCGCTTATTGATATGC为反向引物[41］．使用BLAST(国家生物技术信息中心;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) [42］．对ITS序列进行BLAST搜索，与其他菌株同源性99%c . cupreum可在Gen银行。该序列存入NCBI Genbank，登录号KF668034。该培养物保存在印度国家真菌培养藏品(NFCCI)中，编号为NFCCI 3117。分离出的真菌在4°C的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板和马铃薯葡萄糖琼脂倾斜上保持。

接种剂的制备和发酵

用于接种体制备，真菌在25°C的PDA平板上生长7天，然后从菌落外围钻出5毫米的菌丝盘，转移到250 ml装有100 ml马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)的Erlenmeyer烧瓶中，在26±2°C的旋转搅拌器上以120转/分的速度培养20天，以达到最高的色素产量。

细胞外色素的提取

色素的提取按照前面所述的方法进行[43］．培养20天后，通过Whatman No. 1滤纸过滤去除生物量，得到含有细胞外色素/代谢物的肉汤。将得到的培养液用液-液法在500 ml分离漏斗中从非极性到极性的四种不同有机溶剂(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇)按1:1的比例提取色素/化合物。从分离漏斗中取出50毫升过滤过的肉汤和50毫升溶剂，摇匀20分钟，静置至水层和有机层分离。收集有机层，用Whatman 1号滤纸过滤，转移到250毫升烧杯中。用相同的肉汤和相同的溶剂重复这一过程三次，直到没有更多的色素扩散到溶剂中。以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇为溶剂，采用类似的方法提取。利用真空旋转蒸发器在45℃下对有机层进行蒸发。获得粗的干燥提取物，并在4°C保存以备将来使用。

α-葡萄糖苷酶抑制试验

的影响c . cupreum根据Kim所描述的方法测定提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[44］．真菌提取物通过溶解5 mg/ml的DMSO来制备库存浓度。以3.0 mM的4-硝基苯基α- d -吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，250 μl溶于20 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.9)中，各100 μl (DMSO为100 μg/ml)c . cupreum提取液(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇提取物)和100 μl α-葡萄糖苷酶溶液(1.0U/ml)加入0.01 M磷酸盐缓冲液(pH 7)中，25℃孵育20分钟。孵育后，加入2ml 0.1M碳酸钠(Na2CO3)停止反应。α-葡萄糖苷酶活性是通过测定对硝基酚葡萄糖苷(PNPG)在420 nm处释放的黄色对硝基酚来测定的。对照样品包括所有含酶试剂，用DMSO代替样品。α-葡萄糖苷酶抑制活性的计算公式如下:

%抑制= (A₀——一个₁) /₀) *100 ......

在那里,一个₀对照样品和A的吸光度是多少₁是测试提取物的吸光度。

α-淀粉酶抑制试验

的影响c . cupreum提取液对α-淀粉酶活性的抑制作用按前文所述方法测定[45］．反应混合物由250 μl (100 μg/ml)的DMSO组成c . cupreum(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇提取物)、0.02 M磷酸钠缓冲液(pH 6.9) 250 μl和α-淀粉酶溶液(0.5mg/ml) 100 μl。该溶液在250℃下孵育10分钟。孵育后，在0.02M磷酸钠缓冲液(pH 6.9)中加入250 μl 1%淀粉溶液，25℃孵育10分钟。加入3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂500 μl终止反应。然后将反应管在沸水中孵育5分钟，冷却至室温。在540 nm处用分光光度计测定α-淀粉酶活性。对照样品包括所有含酶试剂，用DMSO代替样品。α-淀粉酶的抑制作用c . cupreum按给定公式计算提取物:

%抑制= (A₀——一个₁) /₀) *100 ......

在那里,一个₀对照和A的吸光度是多少₁是测试提取物的吸光度。

抗癌活性

细胞培养与维护

的癌症HepG2细胞系(肝细胞癌)来自印度浦那的国家细胞培养科学(NCCS)。细胞在细胞培养瓶中培养，使用Dulbecco 's Modified Eagles Medium (DMEM)营养混合物F-12 HAM，补充10%胎牛血清(FBS)， 15mM HEPES, NaHCO_3.吡哆醇和l -谷氨酰胺。细胞保存在5%的CO中₂37ºC恒温箱。

细胞活力测定

细胞毒性c . cupreum采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5二苯基溴化四氮唑)测定法评估HepG2肝癌细胞的提取物，如前所述[46］．HepG2肝癌细胞镀1 × 10⁴在96孔微量滴度板(nun96ft - nunclone -96 Flat transparent)的每孔中加入200 μl细胞悬液。在37°C加5% CO的潮湿气氛中孵育₂24小时以确保附着和80%至100%的汇合。24h后吸除培养液，换用200 μl新鲜培养液c . cupreum不同浓度(25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、150 μg/ml、200 μg/ml、250 μg/ml和300 μg/ml)的提取物。培养皿在37℃，5% CO孵育₂24小时。孵育后吸除培养液，每孔加入含20 μl MTT试剂(2 mg/ml PBS)总体积200 μl的新鲜培养液，37℃，5% CO孵育₂，持续2至3小时。孵育后，轻轻除去含MTT的培养基，每孔加入200 μl DMSO溶解甲醛晶体。对照样品包括所有试剂，HepG2细胞用DMSO替代样品。在585 nm处使用680型微孔板阅读器(Shimadza UV-1800)测量吸光度。细胞存活率百分比按以下公式计算[47］．

细胞存活率百分比=(处理细胞的OD值/对照细胞的OD值)*100 .......

抑制50%细胞的药物浓度(IC₅₀值)为这些样本进行计算。

统计分析

所有测量均为三次，以平均值±标准差表示。数据分析采用单向方差分析(ANOVA)，然后采用Bonferroni多重比较检验。使用Graph Pad Prism 6软件(Graph Pad software, Inc.， USA)。p<0.05的概率值被认为有统计学意义。

结果

的识别c . cupreum

根据形态、显微和分子系统发育对该真菌进行了鉴定，涉及rDNA的ITS-5.8S区域，并将其命名为c . cupreumSS02。在形态学c . cupreumPDA上显示出典型的白色棉质菌丝菌落。

的影响c . cupreumα-葡萄糖苷酶抑制作用提取物

的c . cupreum研究了提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。每种抑制所显示的百分比c . cupreum摘录载于图1．在四种不同的提取物中c . cupreum在100 μg/ml浓度下，乙酸乙酯提取物的抑制率为57.88±0.05，其次为正丁醇提取物的抑制率为21.27±0.04，甲醇提取物的抑制率为15.19±0.05，氯仿提取物的抑制率为12.34±0.01。乙酸乙酯提取物对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性₅₀浓度为86.38 μg/ml。乙酸乙酯提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，甲醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率最低。的c . cupreum经Bonferroni多重比较检验，两组间差异显著(p<0.0001)。

的影响c . cupreum提取物对α-淀粉酶的抑制作用

α-淀粉酶的抑制百分率c . cupreum摘录载于图2．在不同的提取物中c . cupreum当浓度为100 μg/ml时，正丁醇提取物对α-淀粉酶的抑制率为53.70±0.10，其次为乙酸乙酯提取物31.81±0.05，甲醇提取物20.51±0.05，氯仿提取物16.00±0.05。正丁醇提取物对α-淀粉酶抑制活性最高c . cupreum与集成电路₅₀浓度为93.10 μg/ml。正丁醇提取物对α-淀粉酶的抑制率最高，氯仿提取物对α-淀粉酶的抑制率最低。在结果中，可以观察到c . cupreum经Bonferroni多重比较检验，两组间差异显著(p<0.0001)。

的影响c . cupreumHepG2细胞提取物

体外效应c . cupreum在HepG2上的提取图3．在不同浓度的治疗24小时后，观察到细胞对HepG2癌细胞的存活率百分比显著下降。细胞活力百分比的最大下降c . cupreum在300 μg/ ml浓度下，24 h后，以正丁醇提取物为最高(51.68±0.01)，其次为乙酸乙酯提取物(43.45±0.01)，甲醇提取物(30.94±0.01)，氯仿提取物(24.04±0.07)。的集成电路₅₀正丁醇提取物的价值c . cupreum在处理24小时后，浓度为300 μg/ml。研究结果表明，从正丁醇提取物中提取的化合物c . cupreum可能是肝细胞癌治疗的一个可能靶点。Bonferroni后验检验有显著差异(p<0.0001)。

讨论

在糖尿病治疗方法包括抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶，这将导致延迟碳水化合物消化和减少葡萄糖吸收，从而降低餐后葡萄糖水平高血糖[48］．因此，抑制碳水化合物消化酶可能是控制糖尿病最有效的方法之一[49］．目前使用的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂有阿卡波糖、米格糖醇和伏格列波糖[50］．在碳水化合物消化过程中，它们抑制麦芽糖转化为葡萄糖，从而降低葡萄糖进入血液循环的速率[51］．我们的研究表明所有的c . cupreum提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性有抑制作用。而乙酸乙酯提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用最强c . cupreum而正丁醇提取物对α-淀粉酶的抑制作用最大c . cupreum．在文献中，没有关于α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的资料真菌c . cupreum．因此，本研究评价了土壤分离真菌体外α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性c . cupreum．对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用c . cupreum提取物会导致碳水化合物水解缓慢，从而降低小肠摄取葡萄糖的速度，从而通过抑制碳水化合物消化酶来控制高血糖状况[52，53］．

在我们的报告中，我们第一次证明c . cupreum提取物可通过诱导HepG2细胞剂量依赖性凋亡发挥抗癌作用。本研究的结果提示进一步深入的体外和体内研究。未来研究的积极结果将有助于发展c . cupreum化合物作为一种治疗肝细胞癌的新型化合物。因此，这些生物活动c . cupreum提取物可能是由于其中存在的植物化学物质。未来研究的积极结果将有助于发展c . cupreum化合物作为抗糖尿病和治疗肝细胞癌的新化合物。

结论

这些发现表明c . cupreum提取物是α -葡萄糖苷酶和α -淀粉酶的有效抑制剂，可能有助于降低餐后葡萄糖水平。同时,c . cupreum已经显示出显著的抗癌对HepG2癌细胞的活性。本研究的结果提示进一步深入的体外和体内研究c . cupreum提取并净化以及化合物的特征。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢印度政府新德里的大学教育资助委员会(UGC)提供的UGC- mrp资助，并感谢印度卡纳塔克邦班加罗尔大学(BUB)微生物学和生物技术系(MB & BT)系主任使用实验室设施。

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