研究和评论:药理学和毒雷竞技苹果下载理学研究杂志》上
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1部门神经生物学研究,医院·拉蒙-卡哈尔,马德里,西班牙
2神经学部门,医院Eugenio Espejo,基多、厄瓜多尔
收到日期:24/02/2017;接受日期:09/03/2017;发表日期:14/03/2017
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目的:探讨毛泽东抑制特性,毒性、行为和神经保护老鼠死藤水的性质和多巴胺丰富的神经母细胞瘤细胞对PD为了评估其潜在的影响。方法:本研究调查的影响溶性提取物Banisteriopsis caapi在老鼠大脑活动毛,毛抑制活动用高效液相色谱电化学检测和动物´s行为在一个开放的领域和大理石埋测试。体外细胞化验在神经母细胞瘤NB69细胞被用于评估的抗氧化性质死藤水通过测量自动氧化对多巴胺醌类暴露及其神经保护效应对DA和鱼藤酮引起的细胞毒性。MTT比色神经活动、LDH和台盼蓝或propidium碘(π)染色。结果:腹腔内注射的老鼠死藤水提取产生了明显的纹状体的抑制作用在毛泽东和毛泽东B的活动。小鼠纹状体死藤水治疗小鼠有海拔多巴胺和减少的水平di-hydroxy-phenyl乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)和5-hydroxy-indole乙酸(5-HIAA)。死藤水管理后,小鼠显示少anxiogenic行为在大理石埋测试和探索性活动开放领域的测试。结果显示没有明显的抗氧化和神经保护死藤水对多巴胺和鱼藤酮毒性的影响。结论:死藤水提取由于其强大的抑制作用在毛的活动和更强大的抑制毛B,和没有毒性可以作为一个替代或补充疗法治疗帕金森疾病´s。
Mono-amino-oxidase死藤水,帕金森病,神经保护
帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病,其特征是电动机(失去活动能力、刚度、地震静止和姿势异常)和非机动车的迹象。帕金森病的患病率在不同的欧洲国家估计从300年到600多例/ 100000居民(1]。治疗PD的成本是高的,包括医疗保健(医疗就诊,住院,药物、物理治疗等)以及社会保障(失去工作,提前退休,日托设施,养老院,等等)。最近,新的治疗方法的预算电动机并发症大大增加。脑深部电刺激的成本,阿朴吗啡注入或l - 3, 4 dihidroxifenilalanina。
(左旋多巴)凝胶肠政府在100.000和200.000之间€/ 5年2]。这是一个沉重的负担的卫生保健系统发达国家和第三世界国家是无法忍受的。
在许多发展中国家的药物用于治疗PD的标准配方左旋多巴和多巴胺受体激动剂。然而,这些国家的一些富含植物含有的产品可以治疗PD的候选人和其他疾病。最常用的产品是蚕豆含有大量的左旋多巴(3]。但也有其他工厂的候选人。
死藤水是一个精神热带植物树从一群获得拉丁裔美国Banisteriopsis属植物。最近死藤水被使用在萨满仪式在亚马逊国家(4),但在过去的几年里使用它蔓延到城市社区在拉丁裔美国和通过扩大合一的宗教是欧洲城市(5- - - - - -7]。
死藤水被认为包含一个独一无二的结合mono氨基酸氧化酶抑制剂(毛)抗氧化剂可能感兴趣的症状以及神经保护治疗PD (8,9]。在这项研究中我们进一步调查了毛泽东死藤水的抑制特性,其行为影响多巴胺在啮齿动物和其潜在的神经保护效应神经母细胞瘤细胞在体外。
准备死藤水
我们试图获得一种注入稳定和可复制。我们获得的葡萄树的分支从亚马逊厄瓜多尔的一部分,从费尔南多博士提问——医院Eugenio Espejo,厄瓜多尔基多。为了准备注入具有可再生的特性我们选择每次三或四块树枝的植物或多或少10 - 12厘米的长度和直径约1厘米。这些分支在45ºC干了4天,然后刮获得粉。这个粉是悬浮在蒸馏水,30.4 g的粉200毫升蒸馏水。暂停了沸腾和三次过滤,最后的成交120毫升。这种液体是分布在整除1.8毫升,存储在2毫升埃普多夫管。14 - 16 h管冻干的35ºC和保持在-80ºC。
180年样本重组μl盐水。调整后的样品显示3层。上部层包含了可溶性部分。中间一层是一种糖蜜。和底部是一个黑色的存款。在大部分的实验中我们使用了可溶性分数。糖蜜部分只是在一个实验中使用体外毒性的这个分数在神经母细胞瘤的文化。样品用于神经母细胞瘤文化消毒他们穿过0.22μm孔径膜过滤器。
动物和治疗
行为测试
九26周大野生型雄性小鼠C57BL / 6遗传背景(所有)种植食物和水的标准条件,保存在我们的动物保健部门,控制温度和周期12 h的光明与黑暗,31到42克重量被用于实验。动物被注射重组死藤水或稀释的可溶性分数1/10,1/100,1/1000,2.75μl / g的体重,i.p。控制老鼠注射相似体积的生理盐水。这些动物被用来衡量总共死藤水活动的影响,探索行为8811年Actitrack勒(Panlab S.L.巴塞罗那,西班牙)和大理石埋测试如前所述10]。协议下所有动物实验动物实验的伦理委员会批准的医院“·拉蒙-卡哈尔”(动物设施ES280790002001),按照欧盟理事会指令(86/609 / EEC)。
Actimeter测试
汽车活动分析在计算机actimeter (Actitrack Panlab,巴塞罗那,西班牙)。这允许距离的分析中运行actimeter(移动)和纬向分布的运动(焦虑和探索性指数)。探索性指数所花费的时间和距离成反比的中心区域远离墙壁。电动机的分析活动是一段10分钟完成的。
Marble-burying测试
单独的老鼠被放置在塑料笼子一样的笼子回家,但是没有食物或水,和9球3行3放在他们之间的距离相等。这些动物同时进行测试,以避免潜在的混淆within-cage秩序的作用。新的笼子,干净的玻璃球,和新鲜的被褥被用于每个鼠标。老鼠被放置在他们的测试的笼子里,安静的30分钟。在这段时间里,玻璃球的数量被记录为:发现,彻底埋葬,2/3覆盖,覆盖了一半。这种分类是用来获得“埋指数”,作为一个anxiolytic-like活动的迹象。
类代谢物和毛老鼠大脑的活动
老鼠死藤水或生理盐水处理被斩首牺牲,他们的大脑被提取和切割如前所述11]。纹状体的水平通过高效液相色谱法测定儿茶酚胺电化学检测(HPLC / ED)如前所述12]。毛活动直接或间接测定。直接测量全球毛活动的执行使用毛活动装备(美国Biovision苗必达,CA)根据制造商的协议。这个工具包是基于荧光检测过氧化氢,期间产生的bioproducts之一毛底物的氧化脱氨基作用(酪胺)。在波长荧光的变化是阅读(前/ Em = 535/587)使用一个自动标(光谱萤石;Tecan Mannedorf、瑞士)。间接测量毛的A和B的比例执行5-hydroxy-indol乙酸/ 5 -羟色胺(5-HIAA / 5),和di-hydroxy-phenyl醋酸/多巴胺分别(DOPAC / DA)。释放多巴胺的测定、间接根据比率3-methoxy-tyramine /多巴胺(3 mt / DA)。
细胞培养实验
细胞培养
人类神经母细胞瘤NB69细胞生长和维护如前所述[13,14]。总之,细胞生长在杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)补充15% (v / v)热灭活胎牛血清(FCS)、青霉素(100 U /毫升),链霉素(100毫克/毫升),丙酮酸(1毫米)和谷氨酰胺(4毫米)(DMEM±FCS)。细胞解冻后从4±6次文化。镀三天后的密度1 x 105个细胞/ mL 35毫米直径多井,无血清的培养基是改变定义中N2 (DMEM /火腿´s F12 1:1补充20 nM黄体酮,100μM腐胺,30 nM亚硒酸钠和5μg /毫升胰岛素从σ(圣路易斯,密苏里州)和100年μM转铁蛋白是由Boehringuer(德国曼海姆))。多巴胺的细胞治疗200 - 400μM,鱼藤酮10 - 20μM或车辆的存在和没有死藤水(1/1000、2/1000)24或48 h。
细胞生存能力测量
与MTT测定线粒体活动分析NB69文化。MTT(0.5毫克/毫升)被添加到每个好,和文化板块被孵化2 h在37°C。之后,甲瓒盐溶解100μl二甲亚砜(DMSO)和吸光度(Abs)决定在540海里自动微升读者(光谱萤石;Tecan Mannedorf、瑞士)。坏死的细胞死亡的决心,乳酸脱氢酶(LDH)活动是由使用细胞毒性检测装备在培养基和台盼蓝染料排斥在细胞14- - - - - -17]。此外,细胞死亡(凋亡和坏死)是衡量propidium碘(PI)染料排除试验。π积极死细胞标记为红色荧光,为奥林巴斯1×70显微镜检查,并计入总面积的七分之一封面幻灯片,在预定义的平行条使用计数手提袋插入到显微镜目镜(18]。
检测的醌类
形成醌,用作DA自动氧化的速度,是评估根据光度法测量光密度在490 nm培养基(19]。
死藤水体外神经的影响
死藤水的假定的神经保护效应进行了测试在儿茶酚胺神经母细胞瘤细胞丰富,NB69细胞,体外。细胞培养(如前所述)(14- - - - - -16]。两个模型的神经毒性体外,NB69细胞与多巴胺的治疗与鱼藤酮治疗。
多巴胺的毒性NB69细胞在文化研究中维护N2定义媒介与多巴胺治疗后24小时。在我们研究的假定的神经保护效应死藤水在多巴胺毒性我们执行一个与不同浓度的多巴胺剂量反应曲线,以确定理想的剂量的多巴胺。我们发现多巴胺的最小中毒量在这个模型是400年μM NB69细胞。那么文化与生理盐水治疗,与多巴胺,最终的浓度400μM;死藤水,最后从0.001到0.02稀释;和多巴胺,400μM +死藤水从0.001到0.02。毒性或其预防测量根据媒介的醌类水平,作为一个自然氧化指数;麻省理工的水平,作为一个能源生产指数;LDH水平,作为一个索引的坏死和渗透细胞的百分比根据碘化propidium阳性细胞数/总细胞(积极的和消极的细胞)。死藤水的影响在69年鱼藤酮治疗NB细胞具有类似调查技术在文化与生理盐水治疗(控制),鱼藤酮10μM和20μM,死藤水0.002和0.001与鱼藤酮+死藤水稀释或上述浓度。
多巴胺的毒性NB69细胞在文化研究中维护N2定义媒介与多巴胺治疗后24 h。在我们研究的假定的神经保护效应死藤水在多巴胺毒性我们执行一个与不同浓度的多巴胺剂量反应曲线,以确定理想的剂量的多巴胺。我们发现多巴胺的最小中毒量在这个模型是400年μM NB69细胞。那么文化与生理盐水治疗,与多巴胺,最终的浓度400μM;死藤水,最后稀释从0001到0,02和多巴胺,400μM +死藤水从0.001到0.02。毒性或其预防测量根据媒介的醌类水平,作为一个自然氧化指数;麻省理工的水平,作为一个能源生产指数;LDH水平,作为一个索引的坏死和渗透细胞的百分比根据碘化propidium阳性细胞数/总细胞(积极的和消极的细胞)。死藤水的影响69年鱼藤酮治疗NB细胞采用类似的技术,研究了在文化对待盐水(控制),鱼藤酮10μM 20μM死藤水0.002和0.001稀释,或在上述与鱼藤酮+死藤水浓度。
统计分析图表的协助下垫棱镜包,5.01版本,从图垫软件公司,7825年费Av,拉霍亚,CA,美国。分析了实验与实验两组学生的t检验。实验与分析了多个实验组执行单向方差分析,其次是Newman-Keuls测试多个比较。差异p < 0.05时被认为是重要的。
运动行为的老鼠死藤水处理
动物治疗2.75μl / g的体重,ip死藤水,稀释1/100和1/1000,没有显示异常行为或神经赤字在开放的领域,社会行为或Actitrack。动物死藤水稀释处理提出了减少全球汽车活动(图1一个)以及增加时间的百分比在外部Actitrack的一部分(图1 b)。关于大理石埋行为减少了在老鼠死藤水处理后注入稀释的茶或稀释(1/10图1 c)。这些发现符合减少探索行为和减少焦虑。
图1:死藤水对正常小鼠的运动行为的影响。对距离运行在actitrack A)的影响。B)影响外部时间的百分比。C)影响大理石埋测试。
毛死藤水对类的影响、代谢物和纹状体的活动
添加死藤水稀释,5μl酶鸡尾酒(最后死藤水浓度的1/10),减少了毛泽东活动28日总数的5%毛纹状体的活动(图2一个和2 b)。多巴胺(DA)的水平几乎翻了一倍的动物纹状体死藤水处理(图3一),去甲肾上腺素(NE)和5 -羟色胺的水平(5)保持不变(图3 b和3 c)。关于单胺代谢产物的水平di-hydroxy-phenyl乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)和5-hydroxy-indole醋酸大大减少(图3 d- - - - - -3 f)而3-methoxy-tyramine增加(图3 g)。这些变化,都在一起,表明死藤水是一个强有力的抑制剂体外毛的毛a和B B毛效果更强大的比毛自比DOPAC / DA (图3 h)小于5-HIAA / 5 -(比图3我)。3-methoxy酪胺的水平(3 mt)增加死藤水治疗动物(图3 g)表明死藤水增加DA的释放及其细胞外代谢通过catechol-ortho-methyl转移酶(COMT)。
图2:死藤水对单胺氧化酶活性的影响(fluometric试验)。)过氧化氢标准曲线。B) Total-MAO缺氧小鼠纹状体溶解产物中的活动。
图3:毛死藤水调节单胺代谢产物和活动WT老鼠。DA水平,B)钠的水平,C) 5水平。d)单胺代谢产物(DOPAC, HVA 5-HIAA 3 mt)。H)缺氧的活动。我是活动。结果表示在毫微克每克的新鲜组织。值表示为均值±SEM (n = 4 - 5)在每个实验组动物)。统计分析是由学生t测试。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001 WT老鼠死藤水处理与WT老鼠处理车辆。
死藤水对细胞生存能力和抗神经毒素的影响
治疗死藤水,上层或中间层,NB69文化,在稀释0.01岁到0.1岁,产生剂量依赖性降低细胞生存能力MTT的水平(如图所示数字4和4 b)。同样,对待文化与死藤水来自上层或中产层,在稀释从0.01到0.1,增加了坏死率如图所示的LDH水平(图4 c和4 d)。
图4:死藤水存在剂量依赖的相关性在NB69细胞神经毒素对细胞活力的影响。6天后体外,细胞治疗与死藤水(0.001 - 0.1 x) 24 h。A, B) MTT活动分别为可溶性和糖蜜分数。C和D) LDH活性。值均值±SEM与6复制两个独立的实验。统计分析是由学生t测试。* * * p < 0.001和控制文化处理车辆。
模型中多巴胺的毒性NB69细胞有一个增加的百分比的醌类级别和水平propidium碘(IP)阳性细胞(图5一个- - - - - -5度)。Co-treatment这些细胞的多巴胺,200μM +死藤水,1/1000或2/1000,不会改变醌类的水平,它甚至增加的百分比propidium碘化增加了多巴胺。400μM NB69细胞与多巴胺治疗,结果都是一样的除了有一个减少肝癌的水平,这不是恢复通过co-treatment死藤水,这是进一步增加死藤水稀释的2/1000 (图6)。
图5:影响多巴胺和死藤水在细胞死亡和醌生产NB69细胞。5天后体外(DIV),细胞与死藤水预处理的前15分钟达200μM 24小时定义中没有血清(DM)。一)Propidium碘染色图像(比例尺= 30μm)。B)的影响200μM DA,死藤水治疗醌生产,在490海里。C)的细胞死亡比例,表示为碘化propidium细胞/总细胞的比例。值均值±SEM与6复制两个独立的实验。统计分析是由单向方差分析之后,纽曼Keuls多重比较检验。* * * p < 0.001与对照组;+ + + p < 0.001死藤水+ DA和DA-treated文化。
图6:多巴胺和死藤水对细胞活力的影响和醌生产NB69细胞。4天后体外(DIV),细胞与死藤水预处理的前15分钟达400μM 48 h的定义中没有血清(DM)。一)显微照片显示台盼蓝染料排斥(比例尺= 30μm)。B)坏死细胞的百分比。C)线粒体活动[3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、5溴化联苯四唑(MTT)试验]。D)的影响400μM DA,死藤水治疗48 h醌生产,在490海里。值均值±SEM与6复制两个独立的实验。统计分析是由单向方差分析之后,纽曼Keuls多重比较检验。* * * p < 0.001与对照组。
模型中鱼藤酮的毒性NB69细胞我们发现鱼藤酮减少肝癌的水平在20μM浓度,增加从5到20μM LDH的水平(数字7和7 b)。鱼藤酮减少NB69细胞的数量,这种影响不了死藤水(图7 c和7 d)。
图7:鱼藤酮的影响和ayahuaska NB69细胞细胞生存能力。A和B)剂量反应曲线NB69鱼藤酮的影响。一)MTT的鱼藤酮水平从0到20μm和B) LDH活性。C)相衬显微照片NB69文化的前置处理死藤水鱼藤酮前15分钟20μM 24 h(比例尺= 50μM)。在定义培养基培养细胞(DM)没有血清(比例尺= 50μm)。D和E)肝癌和线粒体活动NB69细胞治疗鱼藤酮10和20μM 24 h。值均值±SEM与6复制两个独立的实验。统计分析是由单向方差分析之后,纽曼Keuls多重比较检验。* * * * p < 0.05, p < 0.001与对照组。
我们调查的影响死藤水在细胞和组织系统丰富的老鼠和儿茶酚胺。我们最重要的发现是,死藤水是通过小鼠耐受性良好;它不能产生明显的副作用,在轻度减少探索行为,减少焦虑。在小鼠纹状体死藤水治疗小鼠有海拔多巴胺和3 mt,减少DOPAC的水平、HVA 5-HIAA。这些变化表明,死藤水有很强的抑制作用在毛活动和一个更强大的抑制毛B的海拔3 mt的水平很难解释在毛面前B抑制但它提出了一个由死藤水增强多巴胺的释放,影响已报道(20.]。
死藤水是一种花草茶获得不同类型的亚马逊Banisteriopsis属植物,最频繁Banisteriopsis斗篷。这种植物毛包含几个化合物具有较强的抑制特性,主要是骆驼蓬碱,和较小的微量和harmalol的浓度。这些物质将毛泽东抑制特性具有较强的抗氧化作用[8),经常与其他植物提取物富含di-methyl-tryptamine混合,一个在5 -羟色胺受体植物迷幻剂。
死藤水饮料传统仪式在萨满仪式。最近,由于其良好的宽容,它的使用已经扩散到城市社区在美国拉美裔,合一的宗教团体在美国和欧洲,和来自世界各地的旅行者。死藤水通常是相对良好的耐受性,但有死亡病例报道21]。绝大多数的消费者现在倒胃口的从30 - 40分钟到几小时后摄入和时间腹泻、出汗、心动过速和血压的变化。这段时间是紧随其后的是一个开放的印象,增加知觉和感觉;然后是一段时间的平静,和平与安宁。
我们已经调查了潜在的PD患者死藤水使用。这种潜在的使用是建立在两个基本原理:1)提供廉价而有效的治疗植物提取物在国家负担不起最近销售药品的奖项,和2)寻找anti-parkinsonian代理治疗属性。第一点会清楚需要考虑比很多拉丁裔美国和其他第三世界国家治疗PD的有限。死藤水的潜在神经保护属性可能源自其毛B抑制活动可以减少自由基的水平。此外,死藤水的摄入增加羟色胺神经传递,它一直声称,5 - 1 a受体的刺激星形胶质细胞改善nigral神经元的生存(22]。
遗憾的是我们没有找到两个模型的神经保护效应对NB69细胞毒性,我们测试了使用高浓度的多巴胺或与鱼藤酮进行治疗。多巴胺,多巴胺神经元毒性被认为是由几种机制包括多巴胺醌类自动氧化和自由基过度生产由于增强多巴胺代谢通过毛我们在我们的研究中发现,毛死藤水强烈抑制B活动但不抑制形成醌。鱼藤酮的毒性是由于抑制线粒体呼吸链的复杂我因此,剥夺能量。死藤水可以预防,如果它产生的刺激5 - 1由于这些受体在脑缺血与神经保护和线粒体失败23- - - - - -25]。自神经保护研究的结果是阴性的潜在影响死藤水应该在其他的PD模型进行测试。
胡安Perucho和玛丽亚·约瑟夫Casarejos参与实验工作;胡斯托加西亚•德•Yebenes玛丽亚洛杉矶中东和北非地区和费尔南多·阿拉申请资助,设计实验协议和准备手稿。
作者宣称他们没有竞争,金融或非金融,利益。
本研究支持部分由西班牙卫生部FIS 2010/172, CIBERNEDπ2010/06和凸轮2011 / bmd - 2308。作者感谢安娜·戈麦斯和夫人玛丽亚女士巴斯穆尼奥斯优秀的技术援助。