孟加拉山羊血清IgM的分离与鉴定

摘要

从孟加拉山羊血清中分离IgM，离心除去血球，无颗粒确认血清纯度。用硫酸铵沉淀法得到纯化血清。透析获得的IgM分离物，以不同pH的磷酸缓冲盐水(PBS)为溶剂，通过硅胶层析定量，得到不同的组分(即I、II、III、IV和V)。蛋白质采用Lowry法定量，SDS-PAGE标标测定分子量。免疫扩散法和免疫斑点法证实IgM的存在。实验结果表明，ⅰ、ⅱ、ⅲ部分含有较多的应激蛋白，与卵清蛋白有一定的相似性。使用IgM作为一抗进行免疫斑点Blot获得的结果颜色强度表明，片段II含有最大浓度的应激蛋白。

关键字

血清，IgM，免疫点印迹，免疫扩散，SDS-PAGE。

介绍

免疫球蛋白M (IgM)是一类主要的免疫球蛋白。它是免疫反应中产生的第一种抗体，随后被其他类型的抗体所取代。IgM由B细胞产生，并形成聚合物，其中多个免疫球蛋白以二硫键共价连接在一起，主要作为五聚体，有时也作为六聚体(Cambier)et al .,1974年)。IgM的分子质量约为900 kDa(以五聚体形式)。因为每个单体有两个抗原结合位点，一个五聚体IgM有10个结合位点。然而，通常情况下，IgM不能同时结合10种抗原，因为大多数抗原的大尺寸阻碍了与附近位点的结合。

J链存在于五聚体IgM中，而不存在于六聚体中。目前，含J链的五聚体是否含有一个或多个J链还不确定。由于IgM是一个大分子，它不能很好地扩散，并且在间质中只发现非常少量的IgM。IgM主要存在于血清中;然而，由于J链的存在，它作为一种分泌性免疫球蛋白也很重要。由于其聚合性质，IgM具有高亲和力，在补体激活方面特别有效。IgM本身是一种无效的调理素;然而，它通过激活补体和使C3b与抗原结合而对活化起很大作用(Ohta)et al .,1990)。IgM抗体在感染过程的早期出现，通常在进一步暴露后再次出现，但程度较轻。IgM的这两个生物学特性使其在传染病的诊断中非常有用。在患者血清中发现IgM抗体表明近期感染，或在新生儿血清中发现宫内感染(如先天性风疹)。正常血清中的IgM经常被发现与特定抗原结合，即使在没有事先免疫的情况下。因此IgM有时被称为“天然抗体”。这种现象可能是由于IgM的高亲和性，使得它甚至可以与自然产生的弱交叉反应抗原结合。例如，与红细胞A和B抗原结合的IgM抗体可能在生命早期形成，这是由于暴露于细菌或植物材料上存在的A和B样物质(Richman)et al .,1982)。

IgM抗体主要负责红细胞的聚集(凝集)，如果输血的接受者接受的血液与他们的血型不相容。IgM对2-巯基乙醇变性比IgG更敏感。在用于免疫测定的特异性抗igg和抗igm二抗商业化之前，这种技术在历史上被用于区分这些同型。在2-巯基乙醇处理之前或之后，检测血清样本与抗原的反应性，以确定活性是由IgM还是IgG (Paster)引起的et al .,1989)。

材料与方法

孟加拉山羊血清IgM抗体的分离与鉴定

采集孟加拉山羊血样，室温保存(最高37℃)用于凝血。收集的血清聚集在无菌小瓶中，保存在-20°C。制备侧血清池，5000rpm离心5min，去除残余RBC，收集的上清-20℃保存。

硫酸铵沉淀

在10ml血清中加入3.13g硫酸铵，使免疫球蛋白饱和至50%，持续搅拌2小时，然后在10000 rpm下离心15分钟，将微球溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.0)中。再次加入PBS，保存2 h后，同样离心，将收集的球粒溶解在PBS中。

透析

将硫酸铵沉淀的IgM放入透析袋中，在25°C下对PBS进行多次变化透析2天，得到粗IgM和硫酸铵。

硅胶柱色谱法

将蒸馏水和硅粉倒入硅胶管中直至上述长度，注意避免硅胶出现裂缝。然后将透析后的蛋白样品倒入硅胶柱(Abdullahet al .,1985)。将透析后的蛋白质样品浇注后，得到的第一个馏分称为粗蛋白质。PBS (pH 6.5)浸泡在硅胶柱中。将收集到的洗脱液命名为馏分i。再将PBS (pH 6.8)倒入硅胶柱中收集馏分II。将PBS (pH 7)倒入硅胶柱中收集馏分III。再次将PBS (pH 7.2)倒入硅胶柱中，得到分数IV。最后将PBS (pH 7.5)浸泡在硅胶柱中。得到第五个也是最后一个洗脱液，称为分数Vet al .,1990)。

SDS凝胶电泳

采用十二烷基硫酸钠凝胶电泳。阿卜杜拉(et al .,1985)

免疫扩散试验

1%琼脂糖在0.9%生理盐水(NaCl)中制备。凝胶凝固后，琼脂糖板上3个培养皿上有5个孔，2个培养皿上有6个孔。在3个培养皿的中心加入抗体(第1、2、3段)，在其余孔中加入抗原(BSA和卵黄蛋白)，然后加入一抗和二抗。另外2组在中心孔中加入抗原(BSA和卵蓝蛋白)，在其余孔中加入抗体(片段1、片段2、片段3、一抗和二抗)。然后培养皿孵育过夜并观察。

免疫印迹或斑点印迹

对于免疫印迹，样品被标记在硝化纤维素膜上，并将其浸入阻断缓冲液中几分钟，因为阻断缓冲液避免了不必要的结合。丢弃溶液，加入洗涤缓冲液，保持10min，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。加入一抗，用洗涤缓冲液孵育1小时。之后，加入二抗，保存1小时，然后浸在反应缓冲液中，保存1小时，使颜色呈蓝色显色(粘贴)et al .,1989)。

结果与讨论

洛瑞估计

以X轴为牛血清白蛋白(BSA)浓度(μg/ml)， Y轴为720 nm处OD值(图1)。然后在Lowry估计中特别在720 nm处进行观察，因为Follin Ciocalteu (F.C.)试剂与蛋白质反应后在720 nm处吸光度最小。然后绘制蛋白质样品的OD值，即粗馏分I, II, III, IV, V (Abdullahet al .,1985)在标准曲线图上，得到上述样品的未知浓度。现在，由于蛋白质样品已经浓缩，所以我们用蒸馏水稀释100倍，从而将浓度值乘以100倍，因此上述蛋白质样品的最终浓度值显示在表1。

SDS-PAGE凝胶电泳

SDS-PAGE运行后，仅在4条通道中获得蛋白质条带，推断在ⅳ段、ⅴ段和粗蛋白样品中不存在蛋白质。

分子量测定

为了确定未知蛋白质的大小或分子量，将一系列经过类似处理的标准蛋白(已知分子量的蛋白质)与凝胶相邻通道的未知蛋白质(图3)。通过测量每个蛋白与装载孔的距离(单位为mm)，可以确定每个蛋白的相对迁移率(Rf)。然后可以在半对数纸上绘制此值，以生成校准曲线(图2)，从而确定未知大小的蛋白质的分子量。

免疫扩散

沉淀发生在大多数抗原上，因为抗原是多价的。抗体至少有两个抗原结合位点(在IgM的情况下有10个抗原结合位点)，因此形成抗原和抗体的大聚集体或凝胶状晶格。在实验中，在一定量的抗体溶液中加入越来越多的抗原，最初在低抗原浓度下，整个抗原被包含在沉淀中。这被称为抗体过量区(即prozone现象)。随着抗原加入量的增加，沉淀蛋白的数量也随之增加，直到抗原/抗体分子达到最佳比例。这就是等当区或等当点。当溶液中抗原的数量超过抗体的数量时，沉淀的数量会减少。这被称为抗原过量区。在抗原-抗体反应中，BSA是所用的抗原，pH为6.5、6.8、7的分数I、II、III是抗体。条形图出现在等效区域。 Fig 4 shows the antibody-antigen reaction, where fraction I at pH 6.5 was the antibody and egg albumin and BSA were the antigens .The bars appeared against both the Ags at the equivalent zones. Another reaction contains the egg albumin that was the Ag and The Fraction I, II, III at pH 6.5, 6.8, 7 are the antibodies. The bars appeared at the equivalent zones. Fig 5 shows the antibody- antigen reaction, where fraction II at pH 6.8 was the antibody and egg albumin and BSA were the antigens. The bars appeared against both the Ags at the equivalent zones. In another antibody- antigen reaction, where fraction III at pH 7 was the antibody and egg albumin and BSA were the antigens. The bars appeared against both the Ags at the equivalent zones (Pasteret al .,1989)。

免疫印迹或斑点印迹

本实验用牛血清白蛋白、馏分I (pH 6.5)、馏分II (pH 6.8)和馏分III (pH 7)在硝化纤维素膜上制造点。Sigma IgM分别作为一抗BSA, Fraction I, Fraction II和Fraction III。当颜色在硝化纤维素膜上显影时，只有部分I、部分II、部分III被发现(图6)。因此，很明显，在这些部位形成了Ab- ag复合物，因此酶连接的次级Ab(山羊抗兔Ab)与Ab- ag复合物结合，并在添加NBT+BCIP后发生了颜色形成。因此，证实了片段I、II、III中含有一些与卵清蛋白有一定相似性的应激蛋白，从而证实了Sigma IgM的表位与3个片段中的应激蛋白结合。分数II的颜色强度大于分数I和分数III。颜色强度显示了馏分中受压蛋白质的浓度。因此，分数II含有较高浓度的应激蛋白(从孟加拉山羊血清分离的IgM中的杂质)。

参考文献

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