从土壤磷增溶的真菌的分离和鉴定

文摘

在限制农业生产磷(P)中扮演一个重要的角色是主要bio-element之一。磷酸盐增溶的真菌扮演一个有趣的角色在增加土壤磷对植物的生物利用度。目前的研究目的是为隔离和描述磷酸盐增溶的从根际真菌使用固体和液体Pikovskaya (PVK介质)。结果表明高溶解指数在琼脂板和晕区观察周围的殖民地。Phosphate-solubilizing微生物在土壤磷循环,增加土壤无机磷对植物的生物利用度。两个真菌菌落识别为磷酸盐增溶的真菌(PSF),命名为AP1 AP2。

关键字

Pikovskaya介质;磷酸;PSM(磷酸盐增溶的微生物);曲霉属真菌,其(内部转录间隔区)

介绍

磷(P)是第二个最重要的植物生长营养,占0.2% (w / w)的植物干重。它是仅次于氮矿物营养最通常限制作物的扩张。磷酸生态系统中发挥着不可替代的作用,参与能量代谢的大多数方面,高分子和蛋白质合成,激酶监管。典型的土壤磷含量近0.05% (w / w)最多的两种形式是无机磷酸盐(Pi)和有机磷酸盐(Po)。然而,只有0.1%的P通常是利用植物,呈现可用P植物生长的限制性因素。P矿物质,如磷灰石和红磷铁矿,有缓释率,其他P矿物质,包裹着钙、铝、铁、更快的溶解率是连接包括土壤的pH值和颗粒的尺寸。高土壤pH值(基本)导致铝和iron-complexed P变得更加可溶,而土壤pH值较低的溶解度(酸性)促进calcium-complexed P .然而,大部分可用的应用化肥磷并不是植物,因此添加无机肥料数量多,通常用来打败这种效应会导致环境问题,地下水污染和富营养化的航道。因此,P化肥成为磷全球最重要的市场。由于农业对全球股市的磷的需求,据估计,地球将达到它的最大质量矿物P生产速度到2040年此时产量将下降,而农业需求仍将上升。因为P供应不容易补充氮相比,重要的是要提高利用P储备在土壤和回收它。

土壤微生物强化植物养分的收购。他们参与多种生物学过程中包括不溶性土壤养分的变换。在自然环境中许多微生物在土壤和根际有效磷释放从土壤总磷通过溶解和矿化。这群微生物也提到磷增溶的微生物(PSM)。许多种类的土壤真菌和细菌已经准备好溶解磷体外和其中的一些可以动员磷在植物。磷酸盐增溶的微生物(PSM)发挥非常重要的作用,通过交换其可用性植物磷营养通过从无机和有机土壤磷释放池增溶和矿化。磷酸的土壤矿物溶解的主要机制是通过降低土壤pH值由微生物生产有机酸的释放二氧化碳和有机磷的矿化酸性磷酸盐。PSM增加土壤的生物利用度不溶性磷对于植物使用。他们溶解不溶性无机磷和采集矿物不溶性有机磷(矿物)。耐盐或嗜盐的土壤微生物也表现出溶解的权力不溶性磷促进盐碱地的事件soil-based农业。 The beneficial plant-microbe interactions within the rhizosphere are determinants of plant health and soil fertility. Among the rhizosphere microbes, the important genera of P-solubilizing bacteria include Rhizobium, Bacillus, and Pseudomonas.青霉菌和曲霉菌。是占主导地位的P-solubilizing丝状真菌中发现根际。丝状真菌在RP溶解非常重要。他们广泛使用有机酸的生产商。黑曲霉和一些特异溶解的物种测试P和其它生物技术的重要性就像生物防治,生物降解、磷酸和动员。

土壤和作物的接种与磷酸盐增溶的/矿化微生物是一个有前途的战略发展的植物吸收磷的利用率,从而减少化肥对环境有负面影响。

材料和方法

从根际土壤样本的集合

根大学的植物园的样本收集Shyama Prasad穆克吉大学博士。这是通过挖掘土壤高达5 - 6厘米深度和根的长度大约是3 - 4厘米长。1 g的根际土壤被随机的植物的根。微生物分析是在实验室进行的,微生物学系DSPMU Morabadi。地理坐标是23 o23 17.8 o N的纬度和85 o19 20.6 o E。

图1:采样站点的DSPMU植物园:(一)大学校园;(b)植物园;(c)地图的位置的研究。

隔离的磷酸盐增溶的真菌

孤立的磷酸盐增溶的真菌,Pikovaskaya媒体准备,消毒,分发到佩特里盘子。少量的从根际土壤(1通用)是已知的植物样本和连续稀释水的体积。稀释准备高达的纯,每板接种100µl无菌土壤水分别悬挂4稀释10 - 2和打败。后来盘子孵化了大约5 - 6天在37 o c组成的介质是在桌子下面提到。酵母提取物、葡萄糖,磷酸氢钙,磷铵,氯化钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、琼脂媒体中使用的一些因素。

物理和显微鉴别

殖民地的识别是基于群体特征和微观特性。观察表面外观、质地和颜色的殖民地从上下都为身体做鉴定。此外,分生孢子,分生孢子,孢子的安排,营养结构与光学显微镜测定使用乳酚棉蓝染色染料。

分子识别

孤立的文化被送到欧陆坊DNA提取和测序的基因组学印度经纪有限公司。DNA测序是由DNA分析仪。3730.xl 96 capillary from applied Biosystems (Life Technologies). Internal transcribes spacer (ITS) 1 (TCC GTA GGT GAA CCT GCG G) and internal transcribed spacer ITS 4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) were used for amplification of internal transcribed region.

筛选磷增溶的活动

无机和有机磷酸盐存在于土壤中。大多数土壤真菌和细菌是磷酸盐增溶剂,他们扮演着重要的角色在维持磷平衡的农作物。这个事实是培养利用磷酸盐增溶剂,能溶解磷酸盐。磷酸盐磷中存在介质和葡萄糖作为能量来源。不同的盐和酵母提取物支持生物体的扩张。隔离的磷酸筛查主要增溶的活动是由允许的真菌生长在媒体选择性Pikovskaya琼脂培养基和孵化。后,潜伏期出现一个透明的光环带真菌菌落周围观察到阳性结果。

在固体培养基测定溶解指数

真菌分离株显示磷酸盐增溶的活动发现Pikovskaya的媒介出现的光环区进一步使溶解指数的计算。公式用于测定:总直径比(殖民地+晕区)和菌落直径

使溶解指数(SI) =菌落直径+结算区/菌落直径

通过分离出真菌筛选酸生产

Czapek-Dox琼脂和酚红葡萄糖琼脂准备接种真菌隔离。接种板块在30°C孵化1 - 2天。两个板块在孵化后观察。滑石粉作为替代的碳酸钙Czapek阿霉素琼脂观察酸的生产。

表1。组成Czapek阿霉素琼脂媒体通用/ L。

计算分析的DNA序列

在从欧陆坊FASTA文件接收序列后,重叠群装配的帮助下完成DNA Sequentix龙软件。后来大型X mega-software用于系统发育树的制备及其分析。

结果

隔离的磷酸盐增溶的微生物在固体培养基上

在混合文化2真菌隔离标识显示Pikovskaya磷酸盐增溶的活动的媒介的出现晕区周围。

使溶解指数=菌落直径+结算区/菌落直径

= 2.65 + 3.15/2.65

= 2.18厘米

使溶解指数的真菌菌落在给定的数字是2.18厘米。

显微鉴定真菌隔离

分子识别

表2。加入数量受到NCBI后提交序列的分离。

筛查的酸生产板测定酚红琼脂培养基

酚红葡萄糖琼脂为研究葡萄糖发酵的建议。眎蛋白胨是免费的从可发酵碳水化合物添加琼脂内。与酚红葡萄糖琼脂、积极的碳水化合物发酵反应由大会表示琼脂的黄颜色,由于体内酸性物质的产生。

筛选的柠檬酸生产板试验在Czapek-Dox琼脂培养基

真菌,包括酵母和丝状物种或模具无所不在地分布在自然。Czapek阿霉素琼脂是一种半合成培养基用于真菌的培养,含硝酸钠为唯一氮源和少量的碳酸钙用于酸生产的检测。酸生产显示晕区在殖民地这表明酸的生产有辱人格的碳酸钙在滑石粉。滑石粉用于碳酸钙的地方没有包含抗菌性。

计算分析的DNA序列

随后我们研究的基因的序列结果与相应的记录真菌生物序列,以及由此产生的系统发育树显示,这些隔离集群曲霉菌。相似性比例非常密切相关的99%以上。FASTA序列2从DNA测序获得的样本被用来识别物种通过爆炸。所有序列检索在期望(E)值0.0,这意味着比赛重要。树木比例尺真菌隔离AP1差了0.20%和AP2核苷酸序列和从树上很明显的隔离从数据库集群与他们特定的匹配。

讨论

磷酸盐增溶的真菌(PSF)有益真菌能够使溶解无机磷的不溶性化合物。磷(P)的一个主要重要营养素的植物和磷酸的形式应用于土壤肥料。然而,大部分可溶性无机磷酸盐的应用于土壤化肥是植物迅速固定,变得不可用。我们进行了磷酸溶解两种真菌菌株的筛选固体PVK媒体体外。本研究表明,AP1和AP2高效增溶的磷酸。隔离AP1 AP2也显示最伟大的pH值下降PVK汤含有磷酸三钙(TCP),这表明它可能产生有机酸。我们的结果是相似的研究得出的曲霉菌。显示出更高的pH值下降的PVK肉汤包含TCP和高相比P溶解青霉菌spp。Phosphate-solubilizing微生物不溶性磷酸盐转化为可溶性形式通过酸化的进程,螯合,交换反应,有机酸的生产。

细菌、真菌、放线菌和甚至在P溶解藻类发挥重要作用。其他机制在于生产的H₂年代,这与磷酸铁反应产生硫酸亚铁与伴随的磷酸盐的释放。采用的P增溶机理主要由土壤微生物包括:(1)释放复杂的化合物如有机酸阴离子,质子,羟基离子,有限公司₂,(2)解放细胞外酶或也称为生化P矿化和P的释放在基质的降解。因此,微生物在土壤P周期即有关键作用。、降水和矿化。psm应用各种方法形成磷对植物吸收。这些措施包括降低土壤PH值、螯合和矿化。

目前的研究表明土壤微生物群P-solubilizing支持。最主要属属于曲霉菌。同样,也孤立P-solubilizing真菌等黑曲霉和青霉菌spp。从不同的根际的土壤样本。P-solubilizing真菌在当下研究的有效性可能因为足够的磷酸根分泌物自增溶的微生物主要是依赖于植物根活跃的碳来源丰富的有机酸生产用于增溶的soil-bound磷酸。在目前的研究中,曲霉菌。(55.69%)是最常发生P-solubilizing真菌的三个属。这可能是由于曲霉菌的效率sp.根殖民。酸化的有机酸被报道的主要微生物溶解无机磷的机理,为证实试验我们使用酚红和Czapek-Dox琼脂培养基观察体内酸性物质的产生。观察显示阳性结果酸生产中。

曾经有一段时间化肥使用严格时,虽然产量高,但土壤质量下降。由于化肥农业的负面影响开始切换到生物肥料。在发展生物肥料的系列微生物通过各个方面发挥了重要作用。磷是第二大主导元素对植物生长,所以科学家开始溶解和固定磷对于植物的生长。后来这些磷酸盐增溶的微生物成为可持续的方法来管理农业土壤缺磷。今天还研究如何这些微生物菌剂可用于增溶的和固定磷有助于植物的生长。

应用的有益微生物,尤其是phosphate-solubilizing真菌,对促进植物生长是有用的策略。隔离AP1和AP2磷酸增溶的高效菌株;因此,我们乐观,它可以发挥潜在作用在实际应用支持植物生长。这将对农业的发展产生至关重要的影响,工业、恢复生态学和林业。

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