研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
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P - ISSN: 2347 - 2286
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周李红1,杨小2,熊Dong-mei3,曾庆红陆3,开中3,熊Xing-yao3,4,李云2苏,晓君1,3,5*
2北京重点实验室的生物过程,生命科学与技术学院,北京化工大学,北京,中国
3湖南省重点实验室作物种质创新和利用、湖南农业大学、长沙,中国
5湖南合作创新利用植物功能成分,湖南农业大学、长沙,中国的公关
收到日期:2015年6月26日;接受日期:2015年8月01;发表日期:2015年8月07
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两个新的隔离指定应变MY6和紧张FY2新鲜牛粪的混合物中分离发酵沼气泥浆,这被认为是潜在的纤维素酶生产商。根据细胞形态、生理和chemotaxonomic特点和16 s rDNA基因序列的相似性,前被确认为Stenotrophomonas sp。而后者被确认为蜡样芽胞杆菌sp。主要发酵因素包括文化时间、初始pH值和温度对纤维素酶生产文化优化使用单因素实验两种。内切葡聚糖酶(CMCase) MY6活动增长了200.74%,达到137.36 U /毫升在优化的条件下(在pH7.0培养48 h, 40°C与震动160 rmp);虽然FY2增强150.61%的活动在优化条件下,取得177.58 U /毫升(培养48 h在pH7.0和45°C 160 rmp)。四个原生木质纤维素的饲料的影响股票CMCase活动进行比较。结果表明,纤维素酶的菌株MY6和FY2类似纤维素退化和滤纸的活动最强,然后脱脂棉花、秸秆粉和木屑基质。这些结果表明,高纤维素浓度作为碳源可以促进CMCase的一代。
筛选、识别、特征、Stenotrophomonas,蜡样芽胞杆菌,纤维素酶
纤维素是地球上最丰富的可再生自然资源,可以用来生产生物燃料和生化。最近,越来越多的被注意从纤维素生物燃料资源在世界各地,拥有安全以石油为基础的燃料和环境污染(1,2]。纤维素生物燃料由酶催化是一个潜在的有前途的方法在过去的几年里。然而,有成本效益的酶催化阻碍这项技术的进展(3,4]。因此,它是至关重要的筛选新的纤维素酶和cellulase-producing应变。例如,马具商等人解决一个属于隔离黄曲霉林0.0731国际单位/毫升的CMCase活动(5]。Goldbeck微生物纤维素酶生产类酵母菌等人报道,纤维二糖酶活性为0.038 u /毫升(6]。Ruegger Tauk证明cellulase-producing微生物青霉菌purpurogenum的活动CMCase 0.034 U /毫升和FPase 0.016 U /毫升(7]。Deswal cellulaseproducing过程优化等人Fomitopsissp。RCK2010下固体发酵,产生CMCase 1.832 IU / g在优化条件下(8]。
从上述的考虑,人们已经发现,大多数研究都集中在cellulase-producing真菌。然而,很少有详细信息cellulase-producing细菌可用更新虽然有些cellulase-producing细菌是报道,如噬细胞菌属sp.LX-7 [9),类杆菌(10)和耐热性的大肠杆菌(11]。细菌与真菌相比,有四个明显的优点:(1)细菌通常可以兼性厌氧条件下发酵;(2)他们可以生长在pH值范围宽(pH值2.2 - -8.0);(3)强抗压力;(4)文化时间短。即使在他们的最优条件,几乎所有真菌文化需要一个相对较长的时期(约4 - 8天)成长和积累代谢产物在纤维素酶,而细菌包括应变MY2和应变FY6,通常需要一个文化时间短(约2 - 5天)。因此,越来越多的有趣的引发了对生物燃料的生物质。
在这项研究中,两个cellulase-producing从新鲜的牛粪和细菌发酵沼气浆筛选和识别的基础上,细胞形态、生理和chemotaxonomic特点和16 s rDNA基因序列的相似性。此外,发酵参数影响纤维素酶生产优化利用纤维素作为唯一的碳源。最后,四个不同的生物质原料的影响对CMCase活动作为碳源进行比较。这项工作的结果将提供新的cellulase-producing微生物细菌,有助于产生纤维素酶对纤维素乙醇生产。
介质:富集培养基中(每升)2.0克Na2HPO4,1.2 g (K2HPO4刃天青的0.1克,0.5 g cysteine-HCl, 0.5 g的酵母提取物,1.0 g胰蛋白胨的pH值6.5 - -7.0。滤纸片(6厘米×2厘米)1 g作为碳源添加。初步筛选培养基(包括2.0 g / L)的Na2HPO4,1.2 g (K2HPO4cysteine-HCl 0.5克,0.5 g的酵母提取物,1.0 g胰蛋白胨的pH值6.5 - -7.0。滤纸片(5厘米×1厘米)1 g作为碳源添加的。绝缘介质(每升)由5 g的CMC-Na, cysteine-HCl 0.5克,1.0 g的酵母提取物、胰蛋白胨的0.5克,2.0 g的Na2HPO4,1.2 g (K2HPO4,0.05 g MgSO4NH 0.5 g4FeSO Cl, 0.02 g4,0.01 g CaCl2,0.005 g MnSO4、1.5 g pf刚果红琼脂pH值在6.5 - -7.0的15克。鉴别培养基(每升)包含CMC-Na 5.0 g、K2HPO41.0 g, MgSO40.5 g (NH4)2所以42.0克氯化钠0.5 g,刚果红1.5 g,琼脂15 g pH值在6.5 - -7.0。发酵培养基(每升)包含CMC-Na 1.0 g,酵母1.0 g,蛋白胨1.0 g, Na2HPO41.0 g、K2HPO41.0 g, MgSO40.1 g pH值在6.5 - -7.0。这些化学物质被境,从北京路桥技术有限公司购买。
细菌分离和鉴定
隔离:菌株指定MY6稀释和FY2被孤立在我们实验室的琼脂种植方法,从新鲜牛粪(保存在4°C)和发酵沼气浆(保存在4°C)在富集培养基接种30% v / v,在37°C和培养5 - 7天。富集培养基的微生物数量被用来接种在初步筛选培养基和培养在37°C。细菌的分离培养基上分离和纯化。获得的分离受到两二次筛选步骤(12):他们在鉴别培养基培养37°C 3天选择形状和形式清晰透明的隔离环。选择隔离被接种到初步筛选培养基和培养在37°C 3天。减肥的滤纸测定和记录。或者,分离获得初步筛选过程在37°C在发酵培养基培养3天,化验为羧甲基纤维素酶(CMCase)活动。两株MY6 FY2从两种方法是基于获得的数据,用于进一步的研究。
形态和文化特点:MY6的形态和文化特征和FY2测定[描述13- - - - - -15]。
DNA提取、PCR扩增和序列分析:与基因组DNA提取的总DNA提取试剂D305S(豆类)和分析所述(约翰等)。进化距离矩阵生成和使用邻居加入的系统发育树构建方法。
酶化验:
预处理酶:50毫升细菌培养发酵培养基接种0.5毫升液体和孵化37°C 48 h。不同的发酵使用shake-flask方法进行治疗。发酵媒体在4000转离心20分钟和过滤去除细胞碎片。浮在表面的游离是用于纤维素酶活动的决心。
酶试验:除非另外注明,所有实验都运行一式五份,结果取平均值。所有的微生物都孵化在烧瓶放在一个旋转瓶速度160转。
上层清液的稀释与无菌蒸馏水和纤维素钠的解决方案是在37°C水浴加热30分钟。反应混合物包含1毫升每个稀释上层清液和预热纤维素钠溶液和2毫升的DNS试剂都摇动了几次用手大力,在沸水浴中加热5分钟,冷却后,无菌蒸馏水添加给最后一卷25毫升。一个单位(U)的活动被定义为酶的释放量1μg还原糖从每1分钟0.8 g / ml CMC-Na解决方案条件下的37°C和pH值5.5,用葡萄糖作为标准。
纤维素酶生产的优化培养条件
文化:细菌发酵培养基和孵化CMCase活动化验在不同的时间(24小时,72小时,96小时,120小时,144小时,168 h和216 h)的标准筛选温度(37°C)和pH值(7.0)。
pH值:pH值对纤维素产量的影响评估通过测量CMCase活动在不同初始发酵培养基pH值(5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0)和37°C优化时间(48小时)。
文化温度:文化的影响温度对纤维素酶生产发酵培养基被确定CMCase评估活动在不同的温度下(30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C)的最优初始pH值7 48 h。
木质纤维素的来源:四个木质纤维素的饲料股票滤纸、脱脂棉花、秸秆粉、木屑被用来确定其影响CMCase生产。10毫升细菌的解决方案是添加到饲料的蛋白胨纤维素中包含一个股票(0.5克)和培养优化静态条件下(应变MY6,培养48 h在pH值7.0和40°C;应变FY2:培养48 h在pH值7.0和45°C)。纤维素酶产量确定基于CMCase活动。
隔离cellulase-producing细菌
刚果红试验:总共有15个隔离孤立使用唯一的碳源是羧甲基的绝缘介质。刚果红染色后,殖民地的直径(d)和透明区(d)在殖民地用游标卡尺测量。这两个直径是用来计算活动率R (D / D)。纤维素酶生产和R值呈正相关。基于R值,两个隔离,名叫应变MY6和应变FY2选中。他们两人产生更大、更清晰透明的区域,表明他们有纤维素酶的活动。FY2,透明区域的直径(D)和殖民地(D)和R值分别是15.2毫米,2毫米和7.6毫米。MY6,透明区域的直径(D)和殖民地(D)和R值分别是18.6毫米,4毫米和4.56毫米(图1)。
图1:化验CMC-hydrolyzing活动使用刚果红试验MY6 (a)和FY2 (b)。
滤纸退化:六个隔离,当,MY2、MY3 MY5, MY6, FY2,化验的能力分解生成过滤器纸和清晰的光环在纸上。他们被选为进一步筛选。类似于板筛选、微量分析滤纸的水解产生微发酵也可以通过观察检测酶活性差异的减肥。隔离被转移到种子培养基的接种环和孵化24-36h 37°C。滤纸当时丰富菌株接种到初步筛选后重介质和孵化37°C 3天。滤纸的分解能力被定义为减肥速度和计算根据以下方程:
其中W0滤纸和W的原始重量吗1是最后的滤纸的重量。
这些隔离的重量损失率滤纸分解所示图2,从7.9%到22.95%不等。MY6显示率最高(22.95%),其次是当(16.28%)和FY2(16.21%),而在于较低(11.16%、10.56%、7.96%)。
图2:不同菌株孵化后的重量损失率在滤纸上。
CMCase活动分析:为了繁殖6分离获得(当、MY2 MY3, MY5, MY6和FY2),像前面所述菌株被孵化,然后追究CMCase发酵培养基的活动。所示的结果图3,CMCase MY6活动和FY2高于其他人。综合刚果红的数据测试和减肥试验,MY6和FY2选择研究他们的形态,生理生化特性和确定其CMCase活动。
图3:CMCase活动不同的菌株。
应变FY2和应变MY6的识别
形态:为了观察两个菌株的形态特征及其文化,隔离被稀释,条纹在琼脂板和孵化37°C 48 h。殖民地MY6直径1 - 2毫米,圆形,有光泽的,不透明的湿凸和整洁的中心,边缘整齐,表面光滑。他们呈乳白色或淡黄色,而FY2殖民地圆直径3 - 10毫米,不规则凸波状的边缘,没有光泽的,湿但粗糙表面,不透明的乳白色的颜色。两株细胞杆状。革兰氏染色后,用显微镜观察细胞(1000 x)和拍摄(图4)。
图4:细菌菌株的形态学MY6 (a)和应变FY2 (b)。
生理生化特性:两个菌株的生理生化特征中列出表1。
表1:MY6和FY2a生理生化特性。
应变MY6革兰氏阴性杆移动1 ~ 1.5×0.4 ~ 0.5μm大小。non-spore和可以使用葡萄糖的利用。氧化酶试验和过氧化氢酶试验阳性,而FY2革兰氏阴性杆移动中央附近但non-bulgy叶状体孢子。v-p试验阳性,lecithovitellin反应和明胶液化也厌氧生长。细菌是水解酪氨酸,发酵葡萄糖和产生酸。主要基于系统细菌学的Bergey手册(16和普通细菌鉴定手册17),这些生理生化分析表明,MY6可能属于假单胞菌属,而FY2几乎是类似于蜡样芽胞杆菌sp。
16从菌株MY6 srrna FY2的识别
总DNA提取、PCR扩增的结果:两个菌株的基因组DNA提取使用试剂购买(豆类公司)。DNA产量和纯度检查通过琼脂糖凝胶电泳(图5一个)。PCR扩增的DNA是纯粹的足够使用16 s rDNA-specific引物模板和放大。一群大约1500英国石油公司放大(图5 b)。
图5:(a)凝胶电泳的基因组DNA, PCR产物。一、DNA分子量标记(豆类,DL2000 DNA标记);B和C,基因组DNA MY6 FY2,分别。
(b):a - DNA分子量标记(豆类,DL2,000 DNA标记);b -积极的控制;c - -控制;d和e - PCR产物MY6 FY2,分别。
分析16 srdna序列和它的发展史:放大产品16 srdna序列,催生了两个片段1537 pb(从MY6)和1544年的英国石油公司(从FY2)长。比较序列与参考序列的物种基因库中包含数据库。使用邻居加入的系统发育树构建方法(图6)。
图6:16 s rDNA基因序列的系统发育树株MY6 (a)和FY2 (b)。
形态和文化特点的基础上,chemotaxonomic和生理分析,应变MY6被确认为的假单胞菌sp。然而,通过16 s rRNA分析,确认Stenotrophomonassp。图7可以看出,范围从99%到100%的相似之处Stenotrophomonas物种和应变MY6形成一个集群美国acidaminiphilast31(加入基因库No.FJ544377.1)和美国acidaminiphila(AMX 19写明ATCC 700916)。与此同时,应变FY2证明b的仙人掌sp。图7 b),这是按照形态和chemotaxonomic和生理分析和文化特征。形成一个共同的集群b的仙人掌加入应变NA10(基因库。FJ462699.1)。
图7:文化的影响时间株MY6和FY2 CMCase活动。
优化纤维素生产条件
培养时间对纤维素酶活性的影响:纤维素酶酶从MY6 FY2都有一个最佳的文化时间48小时(图7)。当发酵进行了37°C和pH值7.0,扩展文化时间导致CMCase活动的增加近似106.48 U /毫升144.07 U /毫升时文化时间从24小时增加到48 h。然而,进一步提高文化的时间给CMCase活动带来了负面影响,导致逐渐减少到58.27 U /毫升。也观察到类似的结果FY2, CMCase活动从119.56升高U /毫升to186.57 U /毫升时,文化时间从24小时增加到48 h,而cellulase-producing能力下降48 h后发酵。原因可能是归因于损耗的营养和代谢产物的毒性作用的文化。
初始pH值对纤维素酶活性的影响
初始pH值的影响在CMCase活动调查的pH值范围5 - 10两种使用CMC-Na作为衬底。结果表明,初始pH值有显著的影响在CMCase活动(图8)。MY6的CMCase活动增加而增加初始pH值从6.78 U /毫升144.07 U /毫升。但在pH7, CMCase活动减少。在相同的实验条件下,应变CMCase FY2显示相似的响应CMCase最高的活动(186.57 U /毫升)获得初始pH值7,这表明更多的纤维素可以在中性环境中分解(pH = 7)的两个隔离。它已经表明之间的结合和催化底物和酶可能取决于他们的离解度,这是受到反应体系的pH值。
图8:初始pH值对菌株MY6和FY2 CMCase活动。
温度对纤维素酶活性的影响
最高的活动从应变CMCase MY6 150 U /毫升获得40°C (图9)。
图9:温度对菌株MY6和FY2 CMCase活动。
CMCase变化从90.96 U / ml 35°C到117.11 U /毫升45°C。另一方面,从FY2 CMCase相当稳定40°C和50°C之间的最大活动获得45°C孵化后48 h。它保持着大约94%和91%的最大CMCase活动40°C和50°C,分别。
碳源对纤维素酶活性的影响
据报道,高浓度的纤维素作为碳源可以促进具体研究包括CMCase的合成纤维菌属flavigena水果纤维(18),粗糙脉孢菌对小麦秸秆(19),木霉属reeseion牛粪(20.]。这项工作的结果是类似于这些报告。应变的CMCase活动MY6被发现是不同的在不同的碳源在摇瓶孵化。使用滤纸导致最大的酶的活动(图10)。
图10:碳源对菌株MY6和FY2 CMCase活动。
脱脂棉花近有同等影响CMCase MY6活动而滤纸。然而,锯屑不是一个好生产CMCase的碳源。稻草粉之间的两个。也观察到类似的结果应变FY2 [21]。与锯末和滤纸相比,脱脂棉花是更好的作为唯一碳源,其次是秸秆粉。CMCase活动提高从98 U / ml - 148 U /毫升锯末滤纸所取代时,其纤维素含量最高的四种饲料股票。
筛选纤维素分解微生物一直被认为是一种很有前途的选择识别新的CMCase来源。在这项研究中,应变MY6,已被确认Stenotrophomonas基于形态学的结果,sp. physicological和生化特征和16 s rDNA基因序列分析。同时,应变FY2隔绝的混合新鲜的牛粪和发酵沼气浆,并被确认为是b的仙人掌sp。据我们所知,这是第一个报道Stenotrophomonas sp.产生多种纤维素酶在实验条件。为了获得高纤维素生产,三个关键因素(文化时间、初始pH值和文化温度)影响CMCase活动和产量初步优化。在优化条件下,应变MY6 CMCase活动增加了150.61%,使用原始的条件;而应变FY2增加了200.74%。此外,四个原生木质纤维素的原料比较发现纤维素含量之间的关系中作为唯一碳源和降解纤维素的能力的工作。然而,还需要进一步的研究来研究这些因素之间的相互作用,提高纤维素酶产量和压力宽容之前被用于大规模生物降解。本研究表明,菌株MY6对纤维素酶酶生产和FY2是有前途的。
这项研究得到了国家“863”计划高技术研究和发展的中国(2012 aa101804),中国国家基础研究计划(973计划)(2012 cb723004),重点实验室基金作物种质创新和利用湖南省(12 kfxm03)和中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委21476016)。
