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国际创新研究期刊》的研究在科学、工程和技术

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隔离Nostocales和研究Scytonemin的影响对经济增长概况和利用黑色素瘤细胞系杀菌作用

Pranay Abhang1、3,Girish Pathade2、3
  1. 教学助理,研究所生物信息学和生物技术,Savitribai Phule浦那大学浦那(印度马哈拉施特拉邦。
  2. 本金,h . v .德赛学院浦那(印度马哈拉施特拉邦。
  3. 生物技术学系•弗格森学院,印度浦那
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文摘

本研究的目的是屏幕scytonemin、紫外线屏蔽色素,在孤立Nostocales, Scytonema sp,织线藻属sp,螺旋藻sp, Lyngby sp。scytonemin被硅胶柱层析法分离及其影响进行体外增长概要和B16F10黑素原生成小鼠黑色素瘤细胞系。为了研究这些scytonemin对增长的影响资料——细胞生存能力计算、MTT和DCPIP细胞毒性试验、基因毒性试验和显微观察彗星被认为是。研究酪氨酸酶酶活性- diphenolase化验和本地SDS PAGE方法被使用。Scytonemin隔绝Scytonema sp.和Lyngby sp.显示降低杀菌作用,抑制酪氨酸酶活性,在30.25μM, 100.25μM IC 50值分别。而scytonemin隔绝织线藻属sp.螺旋藻sp.并没有显示出影响黑素原生成酪氨酸酶活性没有改变,有45.5μM, 60.5μM IC 50值分别

关键字
细胞毒性、基因毒性、杀菌作用,Scytonemin,酪氨酸酶。

介绍
继续存在,太阳辐射生活的演变和发展中发挥了重要的作用。太阳辐射,达到厄撒¢€Ÿ年代表面,紫外线(UV)辐射对人体皮肤尤为重要。皮肤黑色素的色素即生产过程称为杀菌作用是高度依赖于太阳紫外线辐射(Del Marmol et al ., 1993年,Jimbow etb, 2000)。在分子水平上酪氨酸酶酶调节紫外线杀菌作用响应的过程,它充当关键酶和调节酪氨酸转化多巴和多巴DOPAquinone。(听力v . j . et al ., 1980,听力和冢本,1991年,a slominski et al ., 2004)。
的UVA¢€电磁波谱的区域分为三个不同的区域:短波紫外线辐射(200 A¢€290海里),UVB辐射(290 A¢€320海里)和UVA辐射(320 A¢€400海里)。这些波长的短波紫外线辐射以及大量的UVB辐射被臭氧层吸收。因此,紫外线辐射到达厄撒¢€Ÿ年代表面包含大约5%的UVB和95%的UVA辐射。(芒r . et al ., 2006)
增加渗透的紫外线(UVA)对地球表面是由于平流层的臭氧浓度下降(克尔et al ., 1993和s Madronich et al ., 1998)。因此uv - b,这被认为是有害的,可以渗透到水柱生物学上重要的深度(Kuwahara et al ., 2000),从而影响水生生态系统。uv - b对初级生产者的不利影响是不同的,主要由破坏分子介导的目标如核酸、蛋白和色素,并间接地产生活性氧。这些可以导致细胞分裂和生长的抑制,影响各种生理生化过程,如运动性、取向在能动的有机体和光合作用,因此改变群落结构和功能。a可以净破坏性影响光合作用(卡伦et al ., 1992)。
尽管紫外线有害,一些生物试图应对紫外线辐射。Sinha et al。(1998)确定了以下四个适应策略通过生物容忍或适应紫外线环境
一、DNA修复机制
二世。酶的生产系统和感应淬火剂的形成
三世。行为修改以避免暴露于紫外线
四、防紫外线物质的生产
在陆地环境中,高等植物最重要的初级生产者,多项研究表明,在高等植物有害的紫外线辐射是由表皮吸收糖类,主要是类黄酮衍生品(Kootstra, 1994)。在水生环境中,发现微藻,UVabsorbing化合物的存在像孢粉素,scytonemin, mycosporine-like氨基酸(MAAs)已经建立了。
Scytonemin [(3 e,本部)3、3 ' bis (4-hydroxybenzylidene) - (1,1’- bi (cyclopenta [b]吲哚))2、2’(3 h, 3是什么)土卫四]是UVA¢€筛选色素通常产生于护套蓝藻种群生活在不同栖息地和地理位置,这个国家太阳能辐射非常大(Garciapichel et al ., 1991)首次报道了黄绿色色素Scytonemin Nageli早在1849年,提供的化学结构是Proteau et al ., 1993。这是一种脂溶性生物碱反应合成的UVA辐射和蓝藻的细胞外鞘内积累。生物从而防止细胞损伤通过这种自然UVA¢€过滤器吸收有害的太阳辐射。2007和史蒂文森(弗莱明和Castenholz, et al ., 2002) Scytonemin吸收主要在UVA (325 A¢€425海里,λmax = 370海里)UVC地区(λmax = 250海里),但它也吸收大大UVB地区(280 A¢€320海里)。scytonemin的最大吸收波长为370 nm体内。然而,它转向一个更长的波长384 nm的溶剂后隔离。据报道,scytonemin的摩尔消光系数大(250 l / g / cm)波长384 nm (Vincent et al ., 1993),是计算基于136000 l / mol /厘米544 Da的分子量。因此,scytonemin是一种高效photo-protective化合物由于其庞大的消光系数(Bultel-Poncef et al ., 2004)。indolic组成的二聚体和酚醛子单元有544克/摩尔的分子质量。两个单元之间的连接在scytonemin烯碳原子,天然产品中是独一无二的。 Hence, scytonemin possess a new ring system in nature for which Proteau et al. (1993) have proposed the trivial name „the scytoneman skeleton‟. Scytonemin exists in oxidized (green) and reduced (red) form. In an oxidized state, the two chromophores are connected by a single bond. Therefore, they can freely rotate and prevent steric repulsion. This steric repulsion between two bulky chromophores makes a dihedral angle of about 90 degrees, so electronic interaction between them becomes very weak. On the other hand, in a reduced state, the indole ring and the benzene ring, which have 10-π and 6-π electron aromaticity, respectively, are alternately connected by double bonds. Therefore, π-conjugation is expanded by increase of planarity. Due to this structural and electrical change, the color of the compound changes from brown (oxidized state) to red (reduced state) (Saman M. et al., 2014).
在本研究天然紫外线筛选化合物从Nostocales分离和测试体外黑素原生成使用小鼠黑色素瘤细胞。

方法
1。隔离的蓝藻
答:收集和浓缩样品
水和土壤样本收集旧游泳池Savitribai Phule普纳大学,在热压处理过的玻璃瓶子。海藻收集或垫使用网状网(孔隙大小25 - 30μm)。酸度和盐度的样本记录使用分别带和盐度计。样本离心机和颗粒悬浮在BG 11媒体1 mg / L二氧化锗和0.05毫克/毫升环己酰亚胺。样本保存浓缩通过提供12小时光明与黑暗条件28摄氏度10 - 15天。细菌和真菌污染降低了添加0.05 mg / L链霉素、10 U / ml青霉素,在媒体上0.05 mg / L两性霉素B。(藻培养技术,由罗伯特·安德森)
制备无菌培养
Unialgal文化得到浓缩样品用连续稀释法。丰富样本稀释10 - BG 11中真空度BG 11平皿上媒体和传播(1.5%琼脂)和培养10 - 15天,提供24小时光条件在28摄氏度。绿颜色的殖民地新鲜BG 11连胜琼脂板(1.5%琼脂5μg / L链霉素,青霉素10 U /毫升、5μg / L两性霉素B BG 11媒体)。盘子被孵化15 - 20天提供24小时光条件在28摄氏度。混合藻文化立体显微镜下分离。(藻培养技术,由罗伯特·安德森)
c .识别蓝藻
孤立的文化被殖民地特点,确定存在的色素(和),纤维素和果胶,显微观察按“不列颠群岛的淡水藻类植物:一个淡水和陆地藻类鉴定指南。”由d . m .编辑约翰·et al。(2002)和《t . v . Desikachary蓝藻门”。80%丙酮提取的样本用于检测存在β-carotene (450 nm)和叶绿素a (430 nm和662 nm),磷酸缓冲提取的样本用于检测存在phycocyanobillin (620 652 nm和562 nm)。存在的纤维素和果胶样品检测采用蒽酮法(e . p . Samsel和j·c·奥尔德里奇,1957)和咔唑测试(Mc梳子et al ., 1957和s Nurdjanah et al ., 2013)。
2。筛选蓝藻的scytonemin的隔离
发现存在scytonemin遵循技术(Proteau et al ., 1993)。
答:TLC对scytonemin
5毫升丙酮添加10毫克的蓝藻样品并保持在4摄氏度10 - 12小时黑暗。0.1μl样本被发现在TLC板(Sigma-Aldrich,涂硅铝60 Ao的支持与孔隙大小和厚度200μm),由使用氯仿:甲醇(9:1)作为流动相。黄棕色颜色的现场检测和射频值的计算。(Rf值scytonemin大约是0.8)
b .光度分析
5毫升丙酮添加10毫克的蓝藻样品并保持在4摄氏度10 - 12小时黑暗。样品在5000转离心10分钟4摄氏度和上层清液从350纳米到450纳米扫描分光光度计(日本岛津公司UV 1601紫外可见)。高峰在384海里(380 nm -390海里)显示scytonemin的存在。(Shailendra et al . 2010年)。Scytonemin包含蓝藻被用于进一步的实验。
3所示。隔离Scytonemin
生物质炉干在60 0 c。干重是记录和scytonemin通过柱色谱法分离。(Naoki W。,2013)。约2.5克的干生物量悬浮在50毫升的乙腈和保持在4 0 c 1小时。生物质被离心分离,上层清液含颜料收集。这个步骤是重复两次。乙腈是被使用Rota-vapor (Buchi r - 210)。干颜料悬浮在50毫升的乙醚去除叶绿素和其他色素。Un-dissolved颜料被收集并溶解在丙酮。硅胶(Hi-media)列在丙酮和样本准备解决50厘米硅胶柱使用丙酮作为流动相。 Procedure was repeated twice for further purification. Collected samples were screened on spectrophotometer (Shimadzu UV 1601) for scytonemin.
4所示。研究scytonemin对增长的影响和杀菌作用
答:细胞系维护-
老鼠B16F10黑素瘤细胞系购买从国立浦那。细胞株是保持与10%血清DMEM和50μg /毫升链霉素通过提供5%的二氧化碳气氛。亚文化是每5天之后(文化动物细胞的离子Freshney)。
b . scytonemin -
纯化scytonemin股票10毫米(5.5毫克/毫升)是在100%丙酮准备的。测试1μm 10μm 100μm, 1000μm和10000μm浓度在细胞培养中添加(初始细胞浓度3×105细胞/)。
- c细胞生存能力计数
细胞生存能力的帮助下计算0.4%台盼蓝染色使用血球计至关重要。染色和nonstained显微镜下细胞计数和记录为细胞/毫升。(由离子Freshney培养动物细胞)
d .蛋白质估计
估计是由蛋白质改性BradfordA¢€Ÿ年代分析(1976)。未知的蛋白质被溶解细胞颗粒蛋白分离估计包含50 mM Tris-HCl缓冲,5毫米EDTA, 0.1% Triton PMSF x - 100和1毫米。0.2毫升的5 x BradfordA¢€Ÿ年代的试剂(500μg /毫升CBB g - 250, 25%的乙醇和50%的ortho-phosphoric酸)被添加在0.8毫升稀释样品由涡流和OD是在595海里。OD与BSA标准图形和未知的蛋白质浓度估计的。
e .酪氨酸酶酶活性在SDS聚丙烯酰胺凝胶-原位染色
分析是描述Jimenez-Cervantes et al。(1993)。细胞颗粒细胞溶解在裂解缓冲TrisHcl包含50毫米,5毫米EDTA, 0.1% Triton PMSF x - 100和1毫米。黑色素瘤蛋白质样本与样本混合缓冲没有β-mercaptoethanol(0.18米三羟甲基氨基甲烷- HCl液pH值6.8,15%甘油、0.075%溴酚蓝,9% SDS)没有给热处理是2:1。样本然后在30 ma解决12% sds - page。电泳后的凝胶产物在50 mM钠磷酸盐缓冲剂(pH值6)15分钟在37摄氏度。酪氨酸酶活性被浸在50 mM磷酸钠平衡凝胶缓冲区(pH值6.8)包含1.5毫米LDOPA和4毫米MBTH在370 c温柔摇晃直到天黑pink-brown彩色乐队了。
f .酪氨酸酶酶测定-
分光光度法测定酪氨酸酶活性测定,所描述的(西莉亚et al . 2001年)。10μl酶提取物添加到包含1.5毫米左旋多巴的衬底,1毫米DMF和4毫米MBTH磷酸盐缓冲剂(pH值6.8)。左旋多巴是dopaquinone转换的主要基质酶活性。MBTH强烈nuocleophile连着产生一个粉红色的复杂。DMF添加到反应混合物为了保持在溶液中生成的复杂状态的调查。反应的进展之后,测量产生的粉红色的强度在505海里。一个典型的反应混合物的总量1毫升含有100μl酶解,850μl衬底溶液和50μl磷酸盐缓冲剂(pH值6.8)。估计酪氨酸酶活动,产品的摩尔消光系数是3700每厘米每摩尔。
g .超氧化物歧化酶(SOD)测定
SOD测定是由阿德里亚娜M C et al。(2004)。酶提取是由溶解细胞颗粒(含103个细胞/毫升)裂解缓冲和上层清液在12000转离心后使用。在两组组件被添加后管。1.5毫升的0.1米磷酸钾缓冲(pH值7.8),L -蛋氨酸0.6毫升的65毫米,0.3毫升750μM电视台,核黄素0.3毫升的2毫米,1 EDTAμl 10毫米,0.1毫升的酶提取(用于控制增加了0.1毫升水)和成交量调整到3.5毫升蒸馏水。一组管照明光源下了30分钟30厘米的距离和另一组管一直在黑暗的30分钟。30分钟后吸光度是阅读560海里在室温下孵化。SOD量成正比的活性氧生成反应期间以560海里和计算公式。
h . MTT和DCPIP测定细胞的细胞毒性
细胞细胞毒性测试是由卡尔·b·et al。(2012)。1天,1 x 105细胞/ 96年允许连接板与200年μl二氧化碳培养箱的完全培养基。
第二天,要测试化合物添加在各自的井用新鲜培养基和孵化24小时。
第三天,中被移除和单层与PBSA洗3 - 4次。
MTT试验——新鲜培养基含有5μg /毫升MTT被添加在每个和孵化4人力资源在二氧化碳培养箱。
后4小时。中被删除和晶体溶解在200μl DMSO溶液。这50μl甘氨酸缓冲(0.1米甘氨酸,0.1 M氯化钠,pH值10.5)是补充道。
立即吸光度在570 nm记录使用ELISA板读者。和IC 50值的计算。
DCPIP试验- 200μl新鲜培养基添加在每个好,这5μl 2毫米DCPIP试剂添加在每个二氧化碳孵化器和孵化为4小时。
后4小时。吸光度在660 nm记录使用ELISA板读者。和IC 50值的计算。
即彗星试验基因毒性
分析了由史蒂文森c . s . et al。(2002)。载玻片覆盖着层薄薄的1.5%琼脂糖融化。200年μl 20μl 0.6%琼脂糖融化了的细胞悬液(1 x106 /毫升)补充道。这是用盖玻片覆盖幻灯片上传播。下滑是保持在0 0 c 2 - 3分钟,下滑是淹没在裂解缓冲(0.25 M氯化钠,0.6%氢氧化钠,100毫米EDTA, 2% DMSO,特里同X 100 0.2%, pH值10)2小时在黑暗。冰冷的运行缓冲(300毫米氢氧化钠,0.5 EDTA, pH值13)添加在电泳槽和样本运行300 mA在黑暗条件下30分钟。
电泳后,滑动在中和缓冲(0.4米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.5),然后用蒸馏水洗净。EtBr污点撒在幻灯片,幻灯片在荧光显微镜下观察到的彗星。

结果与讨论
1。隔离Nostocales scytonemin
11藻类分离收集样本,其中只有6蓝藻。6蓝藻都scytonemin特征和屏幕,其中只有四个显示scytonemin即scytonema sp。,织线藻属sp,螺旋藻sp.和螺旋藻sp。(图1)分离scytonemin TLC显示射频值作为scytonema sp。0.82(绿色),0.80(褐色紫色)织线藻属sp, 0.82(布朗)螺旋藻sp。0.84(黄棕色)螺旋藻sp.和峰值在384海里。由于存在变量侧链和电荷Scytoneman骨架,scytonemin可以存在于不同的颜色。Scytonemin色素是高度疏水性和存在于不同的颜色,颜色可以用于纺织工业。
图像
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结论
在蓝藻scytonemin的主要作用是保护细胞免受紫外线。因为它是一种天然的紫外线筛选化合物自由基清除活性,它可以用于化妆品行业。根据我们的研究结果scytonemin隔绝Scytonema sp.螺旋藻sp.抑制酪氨酸酶活性,因此它可以用于治疗疾病与杀菌作用如装饰音,色素沉着和黑色素沉积的补丁。酪氨酸酶活性抑制的scytonemin可能调节黑色素生物合成,因此可以调节黑色素生产。

确认
作者感谢博士r . g . Pardeshi主要大学•弗格森,浦那提供实验室和化学物质。

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