研究与评论在药学和制药雷竞技苹果下载科学
菜单e-ISSN: 2320 - 1215 p-ISSN: 2322 - 0112
e-ISSN: 2320 - 1215 p-ISSN: 2322 - 0112
Deepthi Priya K1,3,Manish Petkar1,Ghanta Venkaiah Chowdary2*
1研发实验室,Privi有机物有限,a - 71, Koparkhairane,纳维400709年孟买印度
2药学院,Opp: IIT(海德拉巴)Kandi(必须),Sangareddy (M), Medak (Dt),印度海德拉巴- 502285
3托尔生物技术学系Acharya Nagarjuna大学522 510,印度
收到:14/10/2013接受:20/12/2013
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小说萜烯抗微生物分离得到从腐朽的黄色橙色柑橘类水果(试)收集从遥远的地方在孟买纳水果市场。总共有9个微生物孤立和编码为24 b1, 48 b1, 48 y1, y2, 48 48 y3, 120日元,120日元,2 wy1和2黄蜂。萜烯抗微生物分离筛选通过检查他们的增长增加浓度的单萜、柠檬烯和α蒎烯。五株,24 b1, 48 y2, 48 y3, 2 wy1和2黄蜂选中他们抵抗萜烯在初级筛选酵母麦芽汤。随后,三个菌株,24 b1, 48 y2和2黄蜂选择在他们使用这些能力萜烯作为唯一碳源矿物媒体在二级筛查.Hence上述三个隔离可能会进一步处理保留他们的活动有辱人格的萜烯生产价值的芳香物质。
腐朽的黄色橙色柑橘类水果,抗微生物特性、萜烯新菌株。
香气和香味纳入食品、香水和化妆品在世界市场上有很高的价值,主要对物种的选择商业栽培挥发性物质的数量和质量。目前大多数生产调味化合物通过化学合成或从天然材料提取1- - - - - -3]。然而,最近的市场调查表明,消费者喜欢的产品贴上自然。近年来,有越来越多的天然来源的口味需求。使用微生物可能提供另一种方法生产天然香料和香水4]。香气对应的工业生产食品添加剂世界市场的25% (5]。除了口味出现额外知觉的特点、抗菌活性、抗氧化活性、消炎作用,脂肪减少,动脉压力调节6]。有超过22000个人鉴定化合物,萜烯代表最大的天然香料产品在自然界中广泛分布。萜烯是生产植物次生代谢产物,在某种程度上,作为一个防御微生物和昆虫。简单的萜烯(mono -和倍半萜烯)和萜类化合物是精油的主要成分和风味行业被广泛使用。他们可能纳入制定食品、化妆品、卫生和家用产品,不仅是口味(7),但也是抗菌药物(8]。在这个角度看,这类化合物的兴趣不断增长。
萜烯的生物转化是一个非常有吸引力的替代生产芳香的(9),因为它发生在温和条件下,不会产生有毒废物,并允许生产的“自然”的香味,可以用作香水和香料行业(10]。单萜前驱可以转化为更有价值的含氧衍生物。单萜、R -(+)柠檬烯和α-pinene在本质上是最广泛的,主要用于香味和风味产业。这两个单萜已经使用的主要前体合成含氧高价值的产品。α-Pinene (图:1)两种同分异构体的萜烯类的蒎烯是一种有机化合物,它是一种烯烃,它包含一个被动的四元环。
图1:对映体的α-蒎烯
图1 b:对映体的柠檬烯
α-pinene双环单萜烃的低价格和是一个组件的木头和各种各样的其他植物的叶油和柑橘类水果。的一些生物转化产品α-pinene马鞭草烯醇,verbenone, sobrerol-d [11),α-松油醇,柠檬烯(12,pinocarveol pinocarvone、myrtenol myrtenal [13]。d - Verbenone &马鞭草烯醇用作驱虫剂,香水,芳香疗法和食品调味。高度纯sobrerol-d用作香和呼吸兴奋药。Myrtenal辛辣和伍迪的味道。最近研究结果得出myrtenal展品良好的自由基清除活性和抗癌活性的抑制肝细胞癌在wistar鼠给积极的见解对肝癌采取这种化合物作为有效治疗剂(14]。
D-Limonene, (R) -对映体(图:1 b)是自然界中最丰富的单环单萜,代表超过90%的橙皮油。perillyl酒精,一些衍生品的柠檬烯alpha-terpineol carveol、香芹酮和薄荷醇(15,16]。除了他们的香味,其中一些含氧衍生物不仅可以防止癌症的形成或恶化,但也回归现有恶性肿瘤(17]。
超过50000吨/年(+)柠檬烯,160000吨/年全球α-pinene积累作为主要石油和木材加工副产品在柑橘,分别。这些单萜代表生物催化的理想原料,因为他们几乎无限的可用性。许多物种从原核生物到高等真菌已被证明能够改变萜类化合物,通过分解代谢的崩溃。因此筛选微生物是特别感兴趣的,可以促进特定反应的兴趣。
考虑生物转化过程中涉及的主要问题如化学不稳定的低溶解度前体,高波动性,细胞毒性的前体和产品和低转换利率(18),一个好的萜烯耐药菌株的筛选是最关键的步骤之一选择一个适当的生物催化剂。
考虑到巨大的萜类化合物的应用和研究小说的来源范围萜烯降解微生物隔离,本研究进行了分离和描述的萜烯耐药微生物腐烂柑橘类水果。橙色水果丰富的萜烯,它被认为是菌株更适应环境含萜烯,腐朽的黄色橙色柑橘类水果是用来隔离新菌株可能被用作微生物池的一部分生产萜烯的香气。在未来,所选菌株可能评估产生有价值的芳香化合物的生物转化能力。许多研究最近执行的香味使用萜烯的生产,导致各种各样的产品(19- - - - - -23]。
两个单萜R -(+)柠檬烯(97%,奥尔德里奇),α-pinene(> 98%,丙烯酰胺)作为底物。使用的试剂是没有任何预处理。所有其他化学物质或溶剂均为分析纯。
衰变官员收集从遥远的位置纳孟买水果市场,并把研发实验室,Privi有机物有限公司纳孟买。收集样本存储在无菌包装,直到那一刻的进一步分析和处理隔离微生物。
隔离方法是基于理念等(21]。样本序列稀释,接种petridishes含有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和孵化30°C为24小时2周。随机接种完成后各自的潜伏期。孤立的微生物菌落的生长后,他们文化板块,直到完全的隔离纯微生物隔离。
殖民地被转移到琼脂偏与PDA培养基(用于丝状真菌)或酵母麦芽汁琼脂(YMA)媒体(酵母和细菌)和孵化30°C 48 h .选择文化,增长后,被储存在4°C。文化是促进未来的识别。
纯度的菌株被显微镜检查核实。微生物的特性进行了使用选择性培养基对细菌和酵母。细菌的选择性培养基是由100毫升的平皿计数琼脂(PCA)胰蛋白胨组成5.0 g / L, 2.6 g / L的酵母提取物,1.0 g / L的葡萄糖、琼脂和15.0 g / L), 500μl制霉菌素(100 U /毫升)和酵母的选择性培养基是100毫升的PCA与50μl氯霉素(52.5毫克/毫升)。细菌和丝状真菌分别通过革兰氏染色法和micro-cultivation技术识别。真菌属的识别是基于殖民地和果实的形态结构属的菌株的关键研究[25]。
微生物分离的纯菌落转移无菌与循环包含媒体厄伦美厄烧瓶。酵母和麦芽提取物(YM)中被用来准备与组成、细菌和酵母的接种物(1%葡萄糖、蛋白胨0.5%,0.3%麦芽提取物,0.3%的酵母提取物。2.4% PDB用于真菌和孵化30ºC和275 rpm。
萜烯耐药微生物的选择基于理念et al(21和25)。培养基含有柠檬烯/α蒎烯是用来测试微生物的耐药性萜烯的存在。每剂100μl是厄伦美厄烧瓶100毫升含10毫升的YM / PDB媒介。
萜烯的浓度增加了0.2%,0.5%,1%,和1.5% v / v。文化孕育在旋转瓶30ºC和275 rpm七天,控制样品相比,它不包含萜烯。增长模式七天测定的吸光度在660 nm酵母和细菌,而生物质是湿重过滤和量化的真菌。
纷纷,认为抗药性从上面测试评估萜烯作为唯一碳源的利用率。100以上μl抗性筛选文化被接种10毫升的矿物媒体。萜烯被添加在0.2%、0.5%、1%、1.5% v / v每个作为唯一碳源。媒体组件包含;(NH4) 2 so4: 5.00 g / L;KH2PO4: 0.9 g / L;生理盐水:0.50 g / L;MgSO4.7H2O: 0.40 g / L;氯化钙:0.60 g / L;氯化钾:2.15 g / L; FeSO4.7H2O: 0.01g/L; ZnSO4: 0.01g/L; CuSO4: 0.01g/L; NaNo3: 3.6g/L. The cultures were incubated for seven days at 30ºC and 275rpm in rotary shaker. A mineral medium containing equivalent quantity of glucose in place of the terpenes was used as the control. Kinetic study for growth determination was followed in order to select terpene degrading strains.
总共有9微生物孤立从腐烂柑橘类水果随机抽样。观察孤立的微生物在光学显微镜和选择性培养基允许我们确认6株属于酵母类,2株细菌和丝状真菌。细菌鉴定为芽孢杆菌革兰氏阴性球菌和革兰氏阳性菌落的一般特征和革兰氏染色技术。所选菌株的丝状真菌被确认为黑曲霉micro-cultivation技术,根据果实的形状的身体。宏观和微观方面,上下部分的颜色,黑色的分生孢子的正面,菌丝密度和基于透明和黑暗的存在有隔膜的菌丝体。怎么提出了孤立的微生物的数量和他们的殖民地特点。
表1:通过随机抽样微生物分离出腐烂柑橘类水果。
一般来说,最低抑制浓度(MIC)柠檬烯对一些细菌和酵母是低于2%。尽管一些真菌和细菌支持更高的浓度,通常在生物转化,柠檬烯应用不同浓度从0.2到1%27]。1.5%的柠檬烯v / v /α蒎烯也被应用在抗微生物的筛选分离(21]。由于这个原因,在实验中使用的最大浓度是1.5%。自属柑橘提出了高浓度的单萜,大量的耐药菌株的分离可以解释(21,26]。
结果中描述图1表明,隔离24 B1被发现耐药的浓度0.2% v / v v / v的柠檬烯1.5%在48小时孵化。文化花了48小时种植柠檬烯的浓度更高。
图1:柠檬烯对24 b1分离酵母的生长麦芽汤在初级筛选。
耐隔离48 y2被发现只有0.2% v / v的柠檬烯在48小时孵化。进一步提高柠檬烯浓度为0.5%,1%和1.5%导致缺乏生物量的形成(图2)。
图2:柠檬烯对48 y2隔离的增长的影响在初级筛选酵母麦芽汤
隔离48 y3 (图3)被发现耐0.2% v / v, v / v 0.5% & 1% v / v的柠檬烯在孵化24小时。48 y3几乎是稳定的增长概要集合后接种后1.5%的柠檬烯。
图3:柠檬烯对48 y3隔离的增长的影响在初级筛选酵母麦芽汤。
隔离2耐wy1被发现只有0.2% v / v的柠檬烯在孵化24小时30°C。生物质不接种后形成的0.5%、1%和1.5%浓度的柠檬烯(视图)。
图4:柠檬烯对增长的影响2 wy1隔离在初级筛选酵母麦芽汤。
这是观察到的图5隔离2黄蜂被发现耐0.2% v / v v / v的柠檬烯1.5% 72小时的潜伏期。孢子形成显著的控制在48小时,但文化花了72小时形成孢子的萜烯。
图5:柠檬烯对增长的影响2黄蜂隔离在初级筛选酵母麦芽汤。
如上的隔离了好结果的萜烯他们提交碳源的研究。添加碳源的微生物耐萜烯主要筛选并不能保证高生物转化活动,但它是一个重要的特征biotransforming代理。因此,这一步被认为是研究的一个重要组成部分。为了找到上述微生物的能力biotransforming萜烯,关键的一步是找到抵抗微生物的筛选,可以使用萜烯作为唯一碳源(27]。这表明存在substrate-degrading代谢途径,这可能建立有趣的中间产品。比例,恢复菌株能够使用萜烯作为唯一碳源似乎最适合微生物。在介质含有柠檬烯作为唯一碳源生物质生产的最好的结果是通过下面的菌株。
从图6隔离24 b1被发现耐0.2% v / v, v / v (0.5% v / v, 1%柠檬烯在孵化24小时。几乎有1.5% v / v柠檬烯概要稳定增长从集合后孵化后文化30°C。
图6:柠檬烯对24 b1分离矿物的生长媒体在二级筛查
耐隔离48 y2被发现只有0.2% v / v的柠檬烯在48小时孵化(图7)。为0.5%、1%和1.5%柠檬烯没有增长从集合后孵化后的文化观察30°C与柠檬烯作为唯一碳源。
图7:柠檬烯对48 y2分离矿物的生长媒体在二级筛查
隔离2黄蜂(图8)被发现对浓度0.2% v / v 72 v / v的柠檬烯的1.5%小时30°C的孵化矿物媒体以柠檬烯为唯一碳源。
图8:柠檬烯对增长的影响2黄蜂隔离在矿物媒体在二级筛查
电阻筛选试验的微生物分离与α蒎烯,获得的结果似乎类似于微生物隔离对柠檬烯的反应。相同的隔离,被发现对中小学的柠檬烯浓度筛选耐也发现类似的测试浓度的α-pinene中小学筛查。
从figure.9最好的结果得到了微生物生长的菌株,24 B1是发现对萜烯1.5%和1%分别在初级和二级筛查,48 y2,发现耐(0.2%)萜烯,在初级和二级筛查,发现2黄蜂耐1.5%萜烯在初级和二级筛查。相反48 y3和2 wy1未能在碳源生长研究。筛选菌株中,黄蜂(2)已经报道了黑曲霉作为香味生产微生物(11,20.,28]。
中分离的菌株9、24 b1、48 y2, 2黄蜂显示良好的潜力碳源的研究预测能力降低柠檬烯和α蒎烯。从(图:9)值得注意的是,大约有一半的孤立的微生物浓度显示抗单萜在初级筛选除了革兰氏阳性球菌(48 b1),这似乎是对萜烯更敏感,和一些酵母(48 120日元y 120日元),无法在测试浓度的萜烯酵母通常比细菌更敏感的萜烯(29日]。
图9:微生物隔离电阻筛选结果与柠檬烯/α-蒎烯
在目前的工作即使一半的孤立的酵母菌株(48 y2, 48 y3, 2 wy1)抵制萜烯浓度主要筛选,只有一个应变(48 y2)显示增长中单萜为唯一碳源的二次筛选。这较低的萜烯代谢能力解释了工作发表在酵母介导的生物转化的柠檬烯(30.]。
最初的生理研究规模摇瓶进行描述的生长行为文化各自的单萜的存在使后续调查的基础生物转化的生物反应器。从生长曲线的隔离(图1 - 8),观察不同生物质率和吸光度与文化在初级和二级筛查。也注意到在文化与生物量形成萜烯浓度低于控制文化(没有萜烯用量)。Raising the terpene concentration resulted in a steady decrease of cell viability (absorbance) illustrated by the fact that there is a significant effect of terpenes on the growth of the isolates and determines individual isolate’s response to different concentrations of terpenes [31日- - - - - -33]。尽管越来越多的在中包含萜烯测试,几株在一般情况下,需要24小时至48 h在媒体含萜烯相比,控制媒体。观察到,隔离48 y2显示增长48小时(图:2和7萜烯)为0.2%。隔离2蜂花了72小时(图5和8)形成孢子丰富地在初级和二级筛查的萜烯浓度。获得的结果在目前的工作似乎是明显的。
所有菌株显示显著增长的主要筛选步骤,但少了增长在中含萜烯作为唯一碳源在二级筛选。
不同的观察是由24 b1隔离,为0.5%,1%,和1.5%的萜烯,增长是在48小时(图1在主要的筛查。然而在二级筛查文化显示24小时增长0.2%,0.5% & 1%萜烯和控制,但没有检测到增长1.5%的萜烯(图7)。因此,它是可能的理解结果的重要性从微生物的萜烯浓度观察到的行为选择。几项研究已经进行萜烯耐药菌株的筛选21应变电阻选择、11)和真菌,1 3细菌,酵母菌株是抵抗(R) -(+)柠檬烯(1%)。理念(21]孤立193柠檬烯(1.5%)耐药微生物从各种来源,并提交(-)-α-pinene生物转化。Bicas和帕斯托雷26隔离的d -柠檬烯从柑橘加工厂筛选耐药微生物70株,能够生长在矿物中含有柠檬烯(1%)作为唯一的碳源。
生物转化过程与所选择的微生物可以进一步调查以选择最佳aroma-productive菌株。文献和目前的工作显然认为萜烯耐药微生物的分离和筛选是研究的一个重要部分出现的新菌株,执行萜烯生物转化生产价值的芳香化学品。
24 b1, 48 y2和2黄蜂被发现是最好的潜在隔离展示抵抗1.5%,0.2%和1.5%浓度的单萜烯/α蒎烯分别在初级筛查和上述三个分离株的1%,0.2%和1.5%浓度的单萜安排在二级筛选。选择最好的隔离可以进一步受到生化鉴定测试和执行优化研究对其他生理参数可能的勘探工业和实验室规模生产。因此,这项工作可能作为一个良好的基础,标志着一个非常有前途的一步的生物技术生产有价值的自然风味和芳香剂从廉价和丰富天然萜类化合物。
作者感谢D先生。B Rao,导演,privi有机食品有限公司;纳孟买是谁给机会从事研究工作和Vijay Kumar先生,董事技术、privi生命科学,他在不同阶段的指导和见解的研究工作。
