Gowhar戴尔＊、桑迪亚·伊耶、施鲁蒂·德赛、马杜拉·巴瓦林戈达、舒布哈姆·卡米什瓦、拉姆巴克什·普拉贾帕蒂、Chandrani Achari和普拉雅克塔·卡达姆
收到日期:07/02/2018;接受日期:09/05/2018;发表日期:16/05/2018
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在当今时代，癌症治疗已经经历了范式的转变，通过基因组学的干预，有针对性和个性化的治疗方法已经得到普及，以确保患者获得更大的利益。靶向治疗极大地改变了癌症患者的治疗方式，从过去十年到今天。使用肿瘤组织进行基因组分析，往往只能提供一个快照;除了难以获得之外。其他因素如肿瘤异质性、克隆进化和选择有助于获得肿瘤对系统治疗的抗性。由于需要识别一种同样有效且具有成本效益的快速生物标志物，因此开始使用无细胞循环肿瘤DNA (ctDNA)作为潜在的替代标志物。目前的综述旨在探索ctDNA(液体活检)在癌症中的诊断、预后和预测潜力。所有生物学和技术方面的最新进展有关的分析灵敏度和准确性已提出。尽管ctDNA拥有巨大的前景，但它在临床应用中的常规应用仍然不广泛。需要协调分析前和分析过程，并建立标准来验证液体活检作为一种有效的临床标记物的作用。
液体活检，ctDNA，癌症，靶向治疗
有效的癌症治疗围绕着在基因组分析的支持下识别发病机制基础的分子事件的能力;根据肿瘤的基因组成量身定制的治疗已经导致治疗结果的显著改善。肿瘤分析或基因表达分析是一种流行的方法，它有助于推动临床决策，也可以通过肿瘤分类确定各种药物的反应者。因此，确定可靠的标记物不仅是提高早期诊断的必要条件，而且是获得治疗选择指导和监测治疗反应的必要条件。在这方面，全国综合癌症网络(NCCN)，这是美国27个癌症中心的联盟，发布指导方针，帮助提高癌症护理的质量，功效和有效性。NCCN非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤学临床实践指南已更新(2018年4月版)，以包括新的治疗方案、建议等。即使对于转移性疾病，NCCN NSCLC指南也强烈建议广泛的分子谱分析作为识别罕见驱动突变的必要条件，这将有助于确定最合适的治疗药物，以及确定可能对患者有益的适当的正在进行的临床试验(NCCN v1.2015)。液体活检剂;循环肿瘤细胞(CTC)和ctDNA在这方面被认为是非常有益的。它们还为克服实体活检的缺点提供了极大的支持，其中除了具有侵入性外，它甚至不能真正反映当前的肿瘤动态以及治疗敏感性[1］．虽然ctc也被研究为乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的广泛预后因素，但它们在其他癌症类型中的作用仍有待探索。然而，ctc的早期检测被认为有助于识别转移风险增加，为可手术或局部晚期疾病患者设计定制的辅助治疗提供了机会。表征ctc也被证明有助于破译转移过程和识别新的治疗靶点。
核物质，脱氧核糖核酸(DNA)可以被封闭在细胞核内，也可以是游离的(cfDNA)。1948年在血清中检测到循环核酸的功劳与两位法国生物化学家有关。在生理条件下，cfDNA的生成大约在70- 200bp之间的大小发生在凋亡和坏死细胞。虽然确切的生物学机制尚不清楚，但最近的研究已经描述了从骨髓和肝脏中提取cfDNA健康的个人。cfDNA半衰期短，在15分钟到几个小时之间，可被肝脏和肾脏迅速清除。由于癌细胞的高周转率，也会在循环中释放DNA片段，即ctDNA，由于存在与癌症相关的突变，ctDNA很容易与cfDNA区分开，因为前者是从肿瘤中释放出来的(图1)．设计一种方法来收集和分析这种ctDNA，提出了一种低侵入性的方法来解决癌症诊断和治疗的各个方面。基于“液体活检”的概念，与肿瘤异质性有关的各种障碍以及监测化疗耐药突变成为可能[2-4］．ctDNA片段的负载已被检测到极大的变化，从0.01%到超过50%的cfDNA，许多研究已经确定了ctDNA突变和匹配的肿瘤突变之间的高度一致性，也发现ctDNA水平与肿瘤负荷呈正相关。由于ctDNA被认为是从肿瘤中释放出来的，而且还被发现对肿瘤内异质性的影响具有抗性，因此液体活检除了具有低侵入性的另一个好处外，还有望在特定患者中检测出整个癌症突变谱。
图1:从癌细胞中释放的ctDNA片段。
检测ctc仍然是一个巨大的挑战，因为与正常血细胞相比，ctc在循环中的比例很低;大约1个CTC/106-108个白细胞，这使得它们极其罕见[5］．因此，它们的发现是富集的先决条件。常用的不同的CTC富集技术包括
基于抗体的富集
该技术利用针对细胞表面标记物的抗体，其中阳性免疫选择专门利用针对癌细胞表面标记物的抗体。在大多数CTC检测中，常用的阳性免疫选择方法是EpCAM或上皮细胞粘附分子。另一方面，阴性选择技术也可用，包括白细胞消耗和cd45结合抗体的使用。
基于物理/生物的分析
这涉及基于细胞大小或生物电特征等物理属性的CTC分离，因为与正常血细胞相比，大多数CTC表现出更大的尺寸、不同的密度、电磁电荷以及运动性。通过使用电泳、过滤器或微流控芯片等技术，可以很容易地实现它们的分离。富集后，ctc的检测可以通过基因组学、蛋白质组学或转录组学方法实现。利用染色细胞进行形态学检查的细胞学方法仍然被吹捧为CTC检测的金标准。本文中值得讨论的一项技术是细胞研究这是基于epcam的富集和免疫细胞荧光检测的组合。它根据上皮细胞角蛋白的表达、CD45染色的缺失和细胞核的存在来识别和计数ctc。该测试也已被美国FDA批准用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的管理。第三种检测方法涉及检索癌症特异性突变，通常是富集细胞DNA中的KRAS。这有助于从理论上100%特异性地证明分离的ctc与原发肿瘤有克隆相关性。然而，这些基于突变的技术是费力和耗时的，需要单细胞分析，使其不利于临床应用。因此，有大量关于使用各种技术在局部疾病条件下分离ctc的文献，其检出率在10-80%之间，这取决于所使用的技术以及疾病的阶段。
虽然使用液体活检有很多好处，但它的检测和血液中检测到的数量受肿瘤负担和类型以及其他潜在机制的影响。此外，检测ctDNA存在的时间在很大程度上取决于癌症进展的阶段;研究表明，在癌症进展期间而不是在对全身治疗的反应期间检测出阳性(可以强调癌症的早期发现)。研究表明，ctDNA在82%至100%的IV期结直肠癌患者中有效检测，而在I期患者中有效检测的比例为47%。然而，基于ctDNA的检测技术在乳腺癌中比传统x线成像平均提前5个月预测疾病。ctDNA液体活检分析的另一个重要作用是治疗响应分析。在一项对53例接受一线化疗的转移性结直肠癌患者的研究中，在第2周期前观察到ctDNA水平的降低，这与8至10周的放射反应相当相关，证明是一种比现有的放射成像技术更敏感的疾病反应预测生物标志物[6］．嵌合和克隆扩增现象在癌症检测中也有重要作用。研究还表明，对“起源细胞”的分析表明，在组织水平检测到的突变可以先于干细胞或祖细胞有效检测到[7］．虽然很少有研究证明ctDNA在转移性疾病患者中的检测，但其临床应用仍有待评估[8，9］．可用于检测ctDNA的技术有很多，包括等位基因特异性PCR、beam(珠状、乳液状、扩增、磁性)、液滴数字PCR、下一代测序(NGS)等。10，11］．在所有的技术中，NGS目前被列为黄金标准，因为它有潜力检测出广泛的癌症相关基因突变。许多因素被认为会影响ctDNA的检测，其中分析前的条件具有关键的意义。采血量、采样管中健康细胞DNA的污染等因素影响ctDNA检测的灵敏度。因此，血浆被认为是最适合用于ctDNA检测的，尽管抽血和血浆分离之间的时间间隔在这里至关重要。据说理想的处理时间小于一小时，因此为了使基于液体活检的诊断在临床设置中可行，已经提供了带有专用固定剂的商业样本收集管。这有助于样品在处理前储存几天。广泛建议的ctDNA检测技术之一是针对已知的突变，这些突变可能是高度复发的突变，如KRAS，或先前在肿瘤组织上已被表征的突变，或通过专门寻找从头开始的遗传改变。其他技术包括基于pcr的方法，用于在正常DNA背景下检测和定量少数突变等位基因，其中高水平的敏感性变得可以实现，从而有可能从100,000个正常等位基因中检测出最多1个突变等位基因。液滴数字PCR、beam等技术被认为是高灵敏度检测高复发性热点突变的最有前途的方法。 For e.g.: A sensitivity and specificity of ~95% and ~99% has been associated with detection of KRAS mutations in colorectal cancer not pre-exposed to anti-EGFR drugs. The copy number variations were precisely established in 34.4% (n=32) of stage IV colorectal carcinoma patients from plasma DNA. The detection rate from plasma DNA was concordant with those observed in the primary tumor and CTCs thus proving the efficacy of a non-invasive liquid biopsy based cancer detection. The study also proves that the detection of copy number alterations from the first plasma sample after 2 years and 3 months of the disease in colorectal cancer patient was almost identical to those of the primary tumor [12］．在另一个对比谱上，有一种像NGS这样的技术，可以在不事先了解肿瘤基因型的情况下研究几个基因并鉴定肿瘤ctDNA遗传病变。这提供了突变的图景，并强调了可能在耐药性或疾病进展中发挥作用的新出现的变异。然而，与液滴dPCR相比，基于NGS技术的灵敏度被检测到较低，而技术上改进的超灵敏NGS方法，如SafeSeq、CAPP-Seq等，尽管表现出至少0.1%的灵敏度，但被称为检测极限，对于常规临床实验室使用来说过于复杂。从液体活检标本中检测ctDNA具有早期发现癌症的特性，是一种重要的临床应用价值。多项研究不断证明了这一点，引用了一个例子，该方法在检测临床症状轻微的早期乳腺癌患者血浆DNA突变时，灵敏度和特异性分别为90%和100% [13］．
美国目前的癌症诊断和治疗计划的标准，监测药物治疗和耐药性，以及制定替代策略，包括对体细胞突变的评估。在美国，肺癌是导致死亡的主要原因，其次是女性的乳腺癌和结肠癌，男性的前列腺癌和结肠癌，基于基因组图景规划的策略有望更好地提供治疗。14］．据报道，黑素瘤癌症的数量也在增加。体细胞突变分析通常采用的方法包括使用液体活检，其中从血浆中测量cfDNA或更具体地说ctDNA，而不是通过活检或细针穿刺获得肿瘤组织。这种非侵入性方法灵敏度高，在检测各种癌症的体细胞突变方面也具有高特异性[2-4，10］．ctDNA评估也与临床和放射学结果相关，并在某些情况下有助于预测患者的总生存期[8，9，11，15，16］．此外，在几种癌症类型中，ctDNA的连续评估已被证明有利于跟踪疾病进展，以及识别可能与药物敏感性和耐药性相关的额外体细胞突变的外观[17-20.］．在Perrone等人最近的一项研究中，ctDNA突变分析也显示出有希望的结果，可用于筛查和鉴定易患结直肠癌的高风险个体。[21］．在临床设置中，另一个方面在破译疗效方面起着关键作用，即周转时间。在肿瘤学中，这方面更值得关注，因为时间是决定医疗结果的关键因素。最近的一项研究分析了基于液体活检的检测在一种常见肺癌中检测关键基因突变的准确性，结果表明，与组织活检相比，液体活检的数据传递速度更快。检测到液体活检的中位周转时间为3天，而在12天情况下组织活检。该报告还强调了与这种基于血浆基因分型的快速检测相关的高准确率，其中血浆ddPCR对新诊断患者的原发性EGFR和KRAS突变的预测值为100% [22］．组织活检通常只提供整个肿瘤的一部分，因此可能会错过肿瘤其他地方的一些关键变异。另一方面，液体活检更能反映突变在整个肿瘤中的分布。
临床试验表明，在驱动癌症的关键基因热点突变中，这些突变反映了肿瘤负担、治疗反应和耐药性以及疾病预后。经常检测的基因包括BRAF、EGFR、NRAS、KRAS、FOXL2、TP53、PIK3CA等，涉及多种癌症类型，如黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌等。这些体细胞突变大多被认为是激活突变，其中它们增加蛋白质的活性，导致生长信号的持续释放，从而增加细胞增殖，促进肿瘤的形成。许多研究已经发表，将许多不同癌症类型的关键癌症驱动突变的识别联系起来。
本综述中很少引用文献数据来强调基于ctDNA的诊断的意义，并讨论在这方面发表的可能性。
乳腺癌
Olsson等人最近的一项研究[19]，强调在86%的患者中，基于ctDNA的检测先于临床检测转移，并指出其数量可以预测生存率较差。另一方面，该研究还指出，在长期无病存活的患者术后ctDNA不可检测[19］．另一项致力于ctDNA突变追踪以预测早期乳腺癌复发的研究发现，术后血浆中的ctDNA水平被证明是转移性复发的预测因素，准确度很高[23］．以PIK3CA基因为例，它编码一种参与信号分子磷酸化的蛋白质，许多研究已经在ctDNA中检测到突变。道森等人的一项研究[24]，在97%的转移性乳腺癌患者的ctDNA中发现了PIK3CA突变。此外，ctDNA的突变水平为53%女性的早期治疗反应提供了见解。100天的随访也检测到ctDNA水平升高与不良生存结果相关[24］．另一项关于ctDNA中PIK3CA突变的研究发现，22.7%的I-III期患者存在突变。与ctDNA低突变或无突变的患者相比，具有高水平PIK3CA突变的患者也表现出较短的无复发生存期和总生存期[17］．另一个与乳腺癌有关的热门候选基因是肿瘤抑制基因TP53。Madic等人的研究[18]在81%的三阴性乳腺癌患者的ctDNA中发现了TP53突变。ctDNA水平也被检测到对进展时间或总生存期没有预后影响。Olsson E等人的研究[19]强调在20例侵袭性乳腺癌患者中鉴定出TP53中的ctDNA突变，这些患者都在随访阶段发生了转移。除了有利于复发预测外，86%的患者在出现临床证据之前就已经进行了隐匿性转移的识别[19］．
黑素瘤
黑素瘤或由黑素细胞发展而来的皮肤癌近年来在世界范围内呈上升趋势。目前唯一可用于确定转移的临床测试是测量血清乳酸脱氢酶(LDH)水平。尽管其水平升高与更高的疾病负担相关，但它是一种非特异性生物标志物，与许多恶性肿瘤有关。在临床方面，虽然有靶向和免疫治疗的选择，但可靠的标志物来识别早期复发性疾病以及预测治疗反应是不可用的。为了克服这一障碍，许多研究评估了液体活检ctDNA的益处，以评估疾病状态的实时测量以及治疗反应[20.］．许多科学出版物显示ctDNA突变对黑色素瘤敏感。Sanmamed等人的一项研究[25]，强调ctBRAF V600E突变的定量在晚期黑色素瘤患者治疗反应的随访中是有益的。本研究报道肿瘤组织中BRAF突变与ctDNA的一致性为84.3%。此外，ctBRAF基线与肿瘤负荷及疾病进展状态相关，与最佳反应相比，ctBRAF V600E浓度显著降低。Ascierto等人的另一项研究[16]，确定cfDNA是临床活动性转移性黑色素瘤患者使用dabrafenib治疗的有益预后和反应标志物。肿瘤组织中BRAF V600E突变与cfDNA的总体一致性为84%，而V600K突变的一致性更高，分别为97%。对BRAF V600E和V600K的敏感性分别为79%和89%，特异性分别为100%和99%。此外，基线cfDNA BRAF V600E突变水平与总体缓解率之间也检测到具有统计学意义的相关性[16］．Lipson等人的报告。[26]研究了ctDNA的实时分析，用于监测接受免疫检查点封锁治疗的黑色素瘤患者的肿瘤负荷。该报告得出结论，ctDNA水平与临床和放射结果密切相关。在少数病例中，ctDNA水平的升高也被检测到与放射学分析的疾病进展相关。这份报告还强调了两项至关重要的认识;其中之一是在临床或放射学疾病进展期间检测到的ctDNA水平下降可能有助于确定哪些患者会表现出治疗反应，其次，在放射学检查之间检测到的ctDNA水平上升可能有助于临床医生考虑早期放射学重新分期，因为它可能表明真正的疾病[26］．
肺癌
肺癌仍然是世界范围内癌症相关死亡的主要原因，只是因为诊断延迟。这种无法早期发现的情况也部分是由于没有理想的早期诊断方法。DNA甲基化鉴定被认为是早期诊断的必要条件[1］．Salazar等人对此方面的报告。[27]报道了366例患者中179例CHFR(叉头和无名指结构域检查点)甲基化状态与二线化疗结果的相关性。表皮生长因子受体(EGFR)在触发几种信号转导级联反应中起着至关重要的作用，其突变与肺癌有关。EGFR的突变以及基因扩增状态被认为是决定肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂反应的关键[28］．Karachaliou等人的研究[29]分析了cfDNA中EGFR L858R突变与接受厄洛替尼作为一线治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者和肿瘤组织中存在EGFR突变的患者的生存之间的关系。在78%的IIIB+IV期患者中检测到cfDNA中的EGFR突变，其中与外显子19缺失患者相比，cfDNA L858R突变患者的中位总生存期较低。本研究认为cfDNA L858R是一个很好的替代预后标志物。该方法的敏感性和特异性分别为78%和100% [29］．Mok等人的另一份报告。[30.]分析了ctDNA中的EGFR突变作为一线嵌入厄洛替尼和化疗治疗的NSCLC患者生存结局的预测因子。本研究得出结论，基于血液的EGFR突变分析是相对敏感和高度特异性的，其中cfDNA EGFR突变的动态变化成为临床结果的一个很好的预测指标。组织和血液突变分析的总体一致性为88%，而基于血液的检测的敏感性和特异性分别为75%和96% [30.］．邱等人的报告。[31]结论ctDNA可有效检测非小细胞肺癌的EGFR突变，其中液体活检可在个体化癌症治疗中发挥关键作用[31］．Oxnard GR等人的研究[32]，发现基于液体活检的检测可有效评估NSCLC的反应和耐药，并可在放射学进展前16周帮助检测耐药突变。Dowler Nygaard等人的另一项研究[33]，分析了晚期NSCLC治疗期间KRAS cfDNA突变水平。该研究检测到cfDNA的中位数量在进展过程中显著高于基线的5450个等位基因/ml(9250个等位基因/ml)。此外，总体和无进展生存期。在cfDNA水平高的患者中检测到明显较短。临床上，预后差与cfDNA基线水平高相关[33］．纽曼等人的一项研究[34]，实现了深度测序方法;CAPP-Seq(深度测序癌症个性化分析)，以广泛的患者覆盖定量ctDNA。该技术在NSCLC中被设计用于覆盖多种类型的体细胞改变，在>95%的肿瘤中发现突变。此外，在II-IV期NSCLC患者中检测到100%的ctDNA，在I期患者中检测到50%，突变等位基因的特异性为96%。ctDNA水平与肿瘤体积之间也有高度相关性的报道，从而区分了治疗相关疾病和残余疾病之间的影像学变化[34］．
结直肠癌
基于ctDNA的液体活检方法在结直肠癌中的应用已被发表，其中有报道在75%的晚期结直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌等患者中检测到其水平。[35］．在有关ctDNA在结直肠癌中的出版物中，Lin等人的一份报告。[36]，基于原发肿瘤突变谱分析结直肠癌患者循环血浆DNA (cpDNA)水平改变的临床意义。本研究检测到cpDNA的中位水平稳步上升，从I期的4300拷贝/ml上升到IV期的13000拷贝/ml。cpDNA突变的敏感性在I期为24%，II期为45%，III期为27.3%，IV期为87.5%。cpDNA低的患者5年总生存率也较好[36］．Morelli等人的一项研究[37]，报道了抗egfr治疗无效的CRC患者ctDNA克隆选择的特征。本研究中的ctDNA测序分析发现了新的EGFR和KRAS突变，并强调了监测治疗诱导的遗传改变的重要性，以帮助识别抗EGFR难治性患者的治疗疗效筛选标志物[37］．另一项研究评估了一种新型高灵敏度多路突变检测平台;SCODA (sequence-specific synchronous coefficient of drag modification)对突变DNA进行富集，获得了较高的敏感性和特异性，表明该方法对ctDNA的突变分析和定量非常有利。肿瘤和血浆ctDNA之间检测到的突变的总体一致性在转移病例中为93%，在非转移患者中为54%。在本研究的三个病例中，还在肿瘤中不存在的ctDNA中检测到其他突变。此外，该研究表明，ctDNA分析比生化标志物癌胚抗原(CEA)或影像学检查更早地预测肝转移切除术患者的肿瘤复发[38］．Spindler等人的一项研究[39]，研究了接受二线化疗的CRC患者和健康对照组的总cfDNA水平。与对照组(2400个等位基因/ml)相比，CRC患者的cfDNA水平(6000个等位基因/ml)明显更高，并且这些cfDNA水平高的患者与低水平的患者相比，伊立替康的生存期更短。该研究得出结论，cfDNA是预测转移性结直肠癌化疗结果的一个重要方面，在进展时提取的样本中，检测到与KRAS联合标记分析进一步增加了一致的预后效果[39］．Reinert等人最近的一项研究[40]，该研究将ctDNA负荷作为CRC术后患者疾病负担的指标，发现ctDNA评估对于监测疾病负荷具有高度特异性和敏感性，并提供临床相关的提前时间。本研究ctDNA分析发现6/6例复发患者全部复发，非复发患者0/5例复发，敏感性和特异性均为100%，CEA分析发现4/6例复发患者复发，非复发患者0/5例复发，敏感性和特异性分别为67%和100% [40］．Tabernero等人的研究[41]使用beam技术鉴定KRAS、PIK3CA和BRAF突变的变化，以预测regorafenib在转移性CRC患者中的临床活性。在KRAS患者中检测到69%的ctDNA肿瘤相关突变，PIK3CA患者中检测到17%，BRAF患者中检测到3%。该报告认为ctDNA的beam是一种很好的实时无创分析方法，可用于识别档案组织中未检测到的临床相关突变。在肿瘤样本和ctDNA之间检测突变的总体一致性被检测到，KRAS为76%，PIK3CA为88%，BRAF为97%。KRAS的高不一致性是由于在ctDNA中发现了某些突变，而这些突变在档案肿瘤样本中没有检测到。此外，从两个来源鉴定的热点突变在97%的KRAS病例和94%的PIK3CA病例中被发现是相同的[41］．Wong等人的另一份报告。[42]分析了regorafenib在转移性CRC患者中的药动力学效应，并通过ctDNA发现参与预测临床获益的潜在生物标志物。这项研究在ctDNA中检测到KRAS、PIK3CA和BRAF等特定基因的经常性体细胞突变，但在肿瘤组织中没有检测到。此外，cfDNA的总水平与KRAS的无进展生存期和突变呈负相关，且周期较短。该研究认为血浆cfDNA是regorafenib治疗反应的潜在预测生物标志物[42］．
卵巢癌
高级别卵巢癌和子宫内膜癌是世界上最致命的女性生殖道恶性肿瘤之一。虽然目前的诊断和治疗策略似乎有效，但大多数病例在18个月内出现广泛复发，许多病例在复发后5年内死亡。目前关于生物标志物分析和成像的过多测试并不能证明在预测初始治疗结果方面是有效的[43］．因此，许多研究探索了使用基于ctDNA的检测来克服当前障碍的有效性。forshow等人的一项研究[44]，显示了通过ctDNA深度测序识别和监测癌症突变的功效。该研究筛查了>5000个基因组碱基的低频突变，识别频率低至2%，敏感性和特异性超过97%。在使用微量ctDNA对相当大的基因组序列进行分析的62个样本中，检测到等位基因频率为>2%的突变的阳性预测值(PPV)为100%，敏感性为97.5%。对ctDNA高水平患者的TP53基因进行分析，检测到同一基因中所有突变的等位基因频率在2-65%之间。同样，EGFR基因中也检测到一种从头突变，而在肿瘤中未检测到这种突变[44］．因此，作者强调了与ctDNA分析相关的适当的标准化协议，将大大有助于使个性化基因组学成为一种可行的方法。
胰腺癌
胰导管癌仍然是世界上最致命的恶性肿瘤之一，也是导致死亡的第七大原因。主要驱动因素之一是无法获得早期检测工具以及预后不良，其中5年生存率仅为4-7%。虽然手术被认为是最有效的治疗方法，但它只适用于15-20%的非转移性局部疾病患者。在这种情况下鉴定出的四个经常突变的基因是KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A [45］．许多研究已经证明了基于ctDNA的分析在克服胰腺癌疾病监测和治疗的许多方面的好处。Takai等人最近的一份报告[46]，分析了ctDNA在胰腺癌分子评估和精准医疗中的临床应用。本研究使用ddPCR分析了cfDNA中的KRAS突变状态，并进一步对患者中频率超过>/=1%的KRAS变异进行了靶向深度测序。ddPCR在58.9%的不能手术的肿瘤患者中检测到cfDNA KRAS突变，而通过cfDNA测序在29.2%的患者中检测到潜在的靶向性体细胞突变。此外，cfDNA中KRAS突变的存在与较差的总生存率显著相关。因此，这项研究强调了使用cfDNA的组合技术方法的重要性，证明有利于设计临床方法[46］．Kinugasa等人的另一份比较报告。[47]，分析了ctDNA KRAS突变和超声引导下细针穿刺活检胰腺癌患者组织，并给出了生存率的比较结果。组织样本与ctDNA的KRAS突变率分别为74.7%和62.6%，一致性为77.3% [47］．Zill等人最近的一项研究[9]分析了基于NGS的ctDNA分析在胰胆癌患者中的诊断准确性。ctDNA分析检测到了90.3%的肿瘤活检中检测到的突变。连续取样研究发现cfDNA变化与肿瘤标志物动态之间存在良好的相关性。此外，cfDNA测序方法的诊断准确率为97.7%，敏感性和特异性分别为92.3%和100%。因此，本报告重申了在胰腺癌病例中使用基于cfDNA的分析的好处和安全性，其中组织取样被认为是不安全或不可行的[9］．
头颈癌(HNC)
头颈部癌症是一种异质性疾病，通常发生于该区域的粘膜上皮以及唾液腺和甲状腺细胞。鳞状细胞癌最流行的治疗方法包括手术方法，因为大多数鳞状细胞癌对化疗和放疗表现出普遍的耐药性。这种情况也被认为是多因素的，在中国南方后裔的亚洲人中患病率很高。除了分析病毒标记物和放射学评估外，还研究了EGFR、FGFR、CCND1、PIK3CA等的基因改变，以确定治疗潜力[48］．Wang等人的报告。[49]，分析了ctDNA作为血浆和唾液HNC生物标志物的潜力。在唾液中，100%的口腔癌患者检测出了肿瘤DNA，而在血浆中，80%的口腔癌患者检测出了肿瘤DNA。此外，100%的口腔患者唾液中检测出肿瘤DNA。因此，这项研究假设唾液是口腔癌病例中肿瘤DNA富集的重要来源，而血浆对应物可用于其他部位[49］．
胃癌
胃癌是世界上第三大常见的死亡原因，由于大多数病例只有在疾病的晚期才被诊断出来，因此继续对治疗构成巨大挑战。计算机断层扫描(CT)的成像技术是最流行的工具，用于临床管理这种情况。然而，CT很难预测疾病复发。cfDNA作为一种有效的结肠癌诊断替代方法也有研究，文献中确实存在很少的报道。Hamakawa等人的报告。[50]，分析了ctDNA作为胃癌有效生物标志物的潜力。本研究对TP53突变的cfDNA进行了深度测序。尽管cfDNA水平与病程没有很好的相关性，但其水平确实反映了疾病状况[50］．
基于检测的液体活检或快速血浆基因分型包括分析癌细胞中自由漂浮的DNA突变。这项技术提供了重要基因变异的快照，这对于识别不同癌症类型的分子组成至关重要。许多报告已经确定基于ctDNA的检测在临床环境中具有巨大的潜力，因为它们是非侵入性的，并且可以快速识别常见的遗传指纹[22］．本文重点介绍了在ctDNA碱基检测中可用作标记的关键基因。
CTNNB1基因编码粘附连接蛋白;-连环蛋白对细胞粘附和细胞间通讯至关重要。它也参与WNT信号通路，帮助细胞分裂，生长和分化。突变的CTNNB1作为致癌基因触发癌细胞的发展，大多数这些变异已被检测为点突变，导致异常的WNT信号以及不受控制的细胞生长[51］．CTNNB1体细胞突变在不同类型的癌症中被检测到，程度不同，比如;子宫内膜癌18%、胰腺癌7%、卵巢癌6%、甲状腺癌及前列腺癌3% [52］．在约48%的结直肠癌和约3%的转移性黑色素瘤病例中也报告了突变[56，57］．研究还强调了使用基于siRNA的表达阻断逆转吉非替尼耐药NSCLC细胞系过度表达β -catenin的耐药性的可能性[58］．已发表的数据还强调了β -连环蛋白在肺肿瘤发生中的关键作用，其中靶向β -连环蛋白可能提供了克服EGFR-TKIs耐药性的新策略。在显示EGFR-L858R-T790M的转基因小鼠中，-连环蛋白的药理抑制抑制了肺肿瘤的生长，而基因缺失则显著减少了肺肿瘤的形成[59］．
表皮生长因子受体
EGFR基因编码细胞表面糖蛋白，它是参与EGFR结合的蛋白激酶超家族的成员。这种结合导致二聚化，然后是酪氨酸的自磷酸化，最终导致细胞增殖、分化、细胞周期进展以及细胞侵袭性和凋亡的增加。EGFR体细胞突变在不同的癌症类型中被检测到，在不同的水平上;肺癌占29%，前列腺癌占3%，头颈癌占2% [52］．编码部分激酶结构域的EGFR基因的外显子18-21已被证明是大多数突变的港湾。外显子19的缺失在约40%的病例中最常见，其次是L858R (36.2%)， T790M(3.8%)，外显子20突变(1.3%)。有文献证明，EGFR突变的NSCLC患者可以使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)进行有效治疗。一些临床试验已经证明了阿法替尼和厄洛替尼对外显子19缺失患者以及外显子21 L858R突变患者的疗效。结直肠癌患者检测到EGFR突变阳性，KRAS和NRAS密码子12/13突变阴性，通常适用于抗EGFR抗体治疗;帕尼单抗(37］．在接受第一代TKIs治疗的EGFR T790M阳性肺癌患者中，发生耐药的最常见机制是获得继发性突变[60］．
FOXL2(叉头转录因子)
FOXL2基因是对颗粒细胞发育至关重要的叉头翼螺旋转录因子家族的一员，并含有高度保守的dna结合叉头结构域[50］．它对颗粒细胞的正常发育至关重要，在颗粒细胞中有高表达。在基质细胞中也可见到中度表达，而在卵母细胞中则完全不存在。它是卵巢分化的最早标志之一，其表达持续到成年期。FOXL2的体细胞突变在不同类型的癌症中被检测到不同的水平，如;卵巢癌发病率为18%，睾丸癌发病率为2% [52］．颗粒细胞瘤(gct)是卵巢癌和睾丸癌的一种亚型，占所有卵巢恶性肿瘤的不到5%。Shah等人的一项研究[61]，该研究分析了卵巢GCT中FOXL2的突变，确定突变负荷在成人型GCT中为97%，在青少年型GCT中为10%，在昏迷中为21%。
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白
GNAS基因编码刺激性G蛋白(Gsα)的α亚基，激活环3 '，5 ' -环磷酸腺苷(cAMP)介导的细胞内级联，导致细胞生长和增殖[51］．GNAS的体细胞突变在不同类型的癌症中被检测到，其水平不同，如;睾丸癌9%、甲状腺癌3%及大肠癌约2.3%至9% [52，62］．GNAS密码子201突变在67%的胰腺乳头内黏液性肿瘤(IPMN)和0.5-9%的结直肠癌中被报道。在近端结肠癌中，GNAS突变常与KRAS和BRAF突变同时发生[62］．
柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒致癌同源物
KRAS基因编码一种蛋白质，该蛋白质是表皮生长因子受体(EGFR)下游RAS/RAF/MEK/MAPK信号转导通路的一部分，在细胞生长和分化的信号传递中发挥关键作用[51］．异常KRAS蛋白的组成性表达导致细胞分裂和生长失控。KRAS基因的体细胞突变已在不同类型的癌症中以不同水平被检测到，如胰腺癌中57%，肺癌中17%，胃癌中6%，甲状腺癌中2%等。[52］．在95%的KRAS突变癌症中，密码子12和13的突变频率很高。根据NCCN(国家综合癌症网络)指南，在使用egfr抑制剂如Erbitux(西妥昔单抗)或Vectibix(帕尼单抗)治疗NSCLC和结直肠癌之前，建议检测KRAS密码子12和13突变。对于BRAF v600突变型黑素瘤，使用MEK抑制剂曲美替尼已获批准。关于靶向KRAS信号的策略，曲美替尼和其他MEK抑制剂，无论是单一治疗还是联合治疗，以及其他多种方法，都在临床试验中。
成神经细胞瘤病毒致癌同源物
与KRAS相似，NRAS基因在有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中发挥关键作用[51］．编码蛋白中的固有GTPase活性由鸟嘌呤核苷酸交换因子激活，反过来由GTPase激活蛋白灭活。NRAS基因的体细胞突变在不同类型的癌症中被检测到不同程度的突变，如;转移性黑色素瘤发病率为18%，甲状腺癌发病率为7% [52］．最近的研究还发现，约55%的KRAS和NRAS癌基因突变的结直肠癌患者对egfr靶向单克隆抗体如西妥昔单抗和帕尼单抗表现出耐药性[63］．
磷脂酰肌醇3-激酶催化α
PIK3CA基因编码PI3K-PTEN-AKT通路的一个成员，该通路调控细胞生长、增殖、凋亡和自噬，作用于EGFR和RAS/RAF/MAPK通路的下游[51］．所有PIK3CA激活突变都会导致被激活的PI3K蛋白的释放，最终导致细胞异常增殖。PIK3CA的体细胞突变已经在不同的癌症类型中被检测到，如;乳腺癌26%，子宫内膜癌21%，结直肠癌14%，还有更多[52］．对于PIK3CA阳性肿瘤，PI3K抑制剂buparisib已被证明有希望抑制该蛋白的四种亚型。为了确定抗egfr药物的治疗结果和疗效，建议确定PIK3CA与KRAS、BRAF和NRAS的状态[64］．
肿瘤蛋白53
TP53基因编码p53蛋白，p53蛋白是一种重要的肿瘤抑制因子，通过防止有毒化学物质、辐射等物质对DNA造成损伤来调节细胞分裂。51］．TP53突变在很大程度上与使蛋白质失去功能导致不受控制的细胞分裂有关。TP53的体细胞突变已经在不同的癌症类型中被检测到，在不同的水平上，比如;卵巢癌占46%，结直肠癌占45%，胃癌占33%，肺癌占34%，子宫内膜癌占17%等等[52］．研究还记录了三阴性乳腺癌病例中肿瘤和血浆DNA分析之间81%的一致性[18］表1．
| 体细胞变异频率(%) | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 癌症类型 | CTNN1 | 表皮生长因子受体 | FOXL2 | 玲娜 | 喀斯特 | 国家管制当局方面 | PIK3CA | TP53 | BRAF |
| 黑素瘤 | 18 | 12 | 45 | ||||||
| 甲状腺癌 | 3. | 3. | 2 | 7 | 3. | 6 | 41 | ||
| 结肠直肠癌 | 48 | 2．3 | 36 | 5 | 14 | 45 | 11 | ||
| 卵巢癌 | 6 | 18 | 12 | 9 | 46 | 7 | |||
| 胰腺癌 | 7 | 16 | 57 | 2 | 36 | 2 | |||
| 睾丸癌 | 19 | 2 | 9 | 4 | 2 | 5 | 2 | ||
| 前列腺癌 | 3. | 3. | 4 | 2 | 14 | 1 | |||
| 非小细胞肺癌 | 29 | 17 | 4 | 34 | 1 | ||||
| 子宫内膜癌 | 18 | 14 | 21 | 17 | |||||
| 肾癌 | 8 | 16 | 5 | ||||||
| 头颈癌 | 2 | 7 | 38 | ||||||
| 颗粒细胞瘤 | 97 | ||||||||
| 胃癌 | 6 | 10 | 33 | ||||||
| 乳腺癌 | 26 | 23 | |||||||
表1:强调在每种癌症类型中通常发现突变的基因和突变频率。
间变性淋巴瘤激酶
ALK是一种酪氨酸激酶受体，可诱导MAP(丝裂原活化蛋白)激酶的磷酸化，并激发PTN(多养素)结合诱导的MAPK通路激活。ALK中的重排被归类为与NSCLC相关的一类重要的遗传改变，因为靶标药物如克唑替尼和艾乐替尼被设计和批准用于同样的目的。传统上，ALK重排的检测是通过组织中的FISH或IHC来完成的，对于NSCLC，获得足够数量的ALK重排仍然是一个挑战。无创液体活检的引入，加上NGS技术的出现，导致了一种补充分析技术的发展，许多研究评估了其性能。2017年发表的一项研究通过液体活检评估了NSCLC中的alk重排，其特异性和敏感性分别为100%和89.3% [65］．另一项研究比较了NSCLC中循环细胞和组织中alk重排的检出率，显示EML4-ALK具有良好的一致性。本研究发现5例患者在CTC和肿瘤样本中表现出ALK重排，而82例患者通过FISH和IHC对CTC和肿瘤组织分析均显示ALK阴性[66］．在ALK分析的情况下，液体活检被吹捧具有优势，其中检测也可以在脆弱的患者中进行，以检测持久性ALK重排，甚至是ALK耐药突变，以指导治疗建议。此外，液体活检分析已被证明可以有效地监测克唑替尼或艾乐替尼的治疗结果，其中复发表明缺乏反应或预测放射学进展[67］．但在ALK的情况下，仍然迫切需要提高基于液体活检的检测的敏感性。
最近的一份报告强调，美国FDA批准在NSCLC病例中进行基于ctDNA的检测，以识别患有EGFR T790M突变的患者，并认为他们有资格接受新的T790M酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物治疗，这突出了人们对这种较少讨论的基于液体活检的检测的认可程度。在过去的一年里，大量的科学出版物已经记录了这种非侵入性生物标志物在不同类型的癌症诊断、预后以及治疗效果监测方面的益处。在基于ctDNA的基因组测试中，它通常报告患者血浆中突变DNA水平超过2个等位基因/ml的突变是否存在。通常，输入DNA水平是指从患者血浆中富集用于检测的cfDNA的量。报告区域通常包括ctDNA突变拷贝的总数以及相对于输入的突变DNA的百分比，并参考检测极限(LOD)。除测量的技术因素外，还可根据临床病史对结果进行个性化解释，并可为相关临床试验特别是晚期患者提供选择。
癌症是一种异质性疾病，主要由各种驱动基因的体细胞突变驱动。基于ctDNA的检测提供了一种有效和非侵入性的策略来识别关键癌症基因中的体细胞癌衍生突变。随着大量文献指出基于液体活检的基因检测的阳性，有必要注意几个可以驱动检测决策的关键要点。液体活检是一种有效的基于基因组学的测试，帮助临床医生识别许多因素，如血浆突变肿瘤负担，疾病监测，治疗策略，以及早期发现高风险病例的预防性监测;值得注意的是，ctDNA诊断并非用于癌症诊断，而是作为其他现有医学检查程序和干预措施的辅助手段，用于识别可能的恶性肿瘤的筛查工具。此外，它不是用来识别小肿瘤的，也不能检测出所有类型的癌症。此外，阴性结果，即未检测到突变，并不能消除存在其他基因改变的机会，因为有可能涉及ctDNA中未检测的基因，或者也有报告表明，基于ctDNA的阴性结果归因于癌细胞未脱落血液中突变的ctDNA。对阳性检测结果的解释还需要考虑到个人的临床病史、疾病阶段、治疗以及影像学和其他实验室结果。这些因素在决策驱动中起着关键作用，因此应不惜一切代价避免错误。其他分析前因素，如不恰当的采血技术或处理也可能导致错误的结果。 Ensuring appropriate counselling through a professional genetic counsellor or medical consultation is recommended for each test to garner patient confidence in understanding the report outcomes. Though, a lot has been analyzed and written upon on the benefits of liquid biopsy based testing in cancer, it needs to be understood that no test can replace the nuance of a physician’s examination, results of imaging technologies as well as tissue biopsies which have been considered as gold-standard for cancer diagnosis.
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