方法建立并验证高效液相色谱法测定左乙拉西坦和缬沙坦制剂中左乙拉西坦含量

摘要

药物分析在质量的肯定和保证中起着非常关键的作用质量控制大规模药物治疗和他们的计划。药物检验是一门特殊的科学分支，它包括对物质标本中各部分的分离、识别和确定相关的测量。它涉及物质的定量和主观的实质描述。药学研究的标准来自不同的科学分支，如物理科学、微生物学、原子科学和小工具等。

关键字

左乙拉西坦，缬沙坦，高效液相色谱

简介

几乎任何物理性质或正常的特定成分或化合物VAL应作为其调查确定策略的前提。例如:光谱学策略包括在电吸引范围内的所有区域保持/散发灿烂的活力[1-10]。

对物质的全面研究包括四个主要步骤[10-20.]。

1.测试计划/抽样

2.分解实例，将分析物改变为适合估计的结构。

3.估计

4.估计和说明估计。

常用的分析技术

用于定量调查的主要系统是基于，

a)适当的调制反应，考虑到完成反应所需的试剂量或获得的反应项的量[21-26]。

例如:中和(酸碱反应)，复合成形反应，沉淀反应，氧化-减少反应。

b)适当的电学估计，包括在安排中对某一动物种类集中的电流、电压或电阻的估计[27]。

例如:伏特计、电位计、电导计
伏特计:伏特计是一大批仪器方法的典型名称，这些方法是根据测量在阴极上移动的不停息电位形成的电流[28-30.]。

电位测量法:a的估计潜在的， E，它反映了被分析物物种在排列上的收敛性，根据nernst样比较[31-38]。

E = E0 + (0.059/n)log[Ox]/[Red]

c)某些的估计光学性质这取决于

-测量某一特定波长所消耗的灿烂活力的测量实例。

-关于光辉活力的散发和估计特定波长放电的活力的度量。

例如:可见分光光度法，紫外分光光度法，红外分光光度法。除了这些光谱方法，核磁共振核磁共振(NMR)和准磁共振(Para Magnetic Resonance, PMR)在基本辅助检查中越来越受重视和重视[39-42]。

药物可以被描述为用于发现、治愈、调节、厌恶或治疗人或生物的疾病，或用于旋转个体或生物集合的任何结构或能力的物质。医药科学是一门利用一般科学规律研究药物的排列、配制性质、结构、结构、对生物的影响，研究药物的物理性质和复合性质、质量控制程序和储存状态等的科学。该组药物可以全面委托

1.药效学代理

2.化疗药物

创建和接受一个逻辑策略的程度是为了保证一个适合特定分析物的系统更加特定、精确和精确。这样做的主要目标是改善在改进和批准时应遵循的条件和参数。

一项关于写作的研究发现，对于像左乙拉西坦钠和左乙拉西坦这样的药物，很好的解释策略是不可用的。目前的物理复合程序尚不能满足先决条件;因此，建议加强目前的策略，并发展新的系统，以估计左乙拉西坦钠和药物测量结构中的左乙拉西坦，接受各种可访问的解释方法，如高效液相色谱[43-50]。

HPLC方法发展:高效液相色谱法(HPLC)是分段色谱法的一个不常见的分支，在这种色谱法中，便携式段以高速通过截面受到限制。因此，相对于已建立的节层析，调查时间减少了1-2个尺寸要求，而且吸附剂或背衬颗粒更小，可以想象，可以显著提高节段生产率[51，52]。

吸附色谱法或正相色谱法

反相色谱法

HPLC方法验证

技术批准VAL特征为(ICHQ.2B)“建立报告确认，它给予高度肯定，特定的运动将可靠地提供令人垂涎的结果或项目，满足其预定的细节和质量属性”。

战略审批是制度完善不可或缺的一环;它是展示科学的策略适合于其建议的使用，并增强药物物质和药物项目的特性、质量、完美性和效力的过程。从本质上讲，技术批准是证明诊断策略因其提出的理由而有价值的程序。

尽管如此，技术验证在很大程度上是在策略产生后执行的一次性程序，以证明系统在实验上是可靠的，并且它满足了计划的解释性需要。
验证参数为

(a)恢复(b)响应函数(c)灵敏度(d)精度
(e)准确度(f)检测限(g)定量限
(h)坚固性(i)鲁棒性(j)稳定性(k)系统适用性。

药物简介

Levetiracetam

分子结构

化学名称:(-)- (S) - α -乙基- 2 -氧基- 1 -吡咯烷乙酰胺

分子式:C8H₁₄N₂O₂．

分子量:170.21

性状:白色细结晶粉末。

类别:抗惊厥的。

作用机制

左乙拉西坦抗惊厥作用的成分尚不确定。它没有被人为地与不同的抗惊厥药确定，似乎不通过神经递质调节的传统系统起作用。它可能通过避免癫痫样爆炸终止的超同步而起作用，从而阻碍癫痫发作作用的扩散[53-57]。

缬沙坦

结构:

缬沙坦化学

缬沙坦的化学名称为(±)-1-羟乙基- 2-乙氧基-1-[对-(o-1H -四氮唑-5-基苯基)苄基]-7-苯并咪唑羧酸酯，环己基碳酸酯。

经验公式:C₃₃H₃₄N₆O₆

分子量:610.67

性状:白色至灰白色粉末

溶解度:不溶于水，微溶于甲醇。

药理学

缬沙坦，一种特殊的血管紧张素II，单独使用或与其他抗高血压专家一起治疗高血压。缬沙坦完全不像血管紧张素受体的敌人氯沙坦，它没有动态代谢物，也没有尿尿酸影响。缬沙坦与血管紧张素II在at上不相上下₁受体亚型。由于血管紧张素II是一种血管收缩剂，它还会激活醛固酮的混合和到达，其财产的阻塞会降低全身血管阻力。

作用机制

•它通过阻碍血管紧张素一类(AT₁)受体。血管紧张素II是肾素-血管紧张素-醛固酮框架的基本血管活性激素，其影响包括血管收缩刺激醛固酮放电和肾钠重吸收。

•这是一个前体药物在从胃肠道摄取的过程中，迅速转换为动态药物。

•它通过特异性地阻碍血管紧张素II与AT的耦合来阻碍血管收缩剂和醛固酮释放的影响₁许多组织中的受体，如血管平滑肌和肾上腺器官。其活性随后不受血管紧张素II结合途径的影响。

•药物对AT有更明显的偏爱(> 10,000倍)₁受体比AT的受体要多₂受体。

•药物治疗和AT之间的牢固联系₁受体是与受体紧密结合和适度分离的后遗症。

•药物不抑制血管紧张素向化学物质转变(ACE)，也称为激肽素II，这种化合物从血管紧张素I转变为血管紧张素II并破坏缓激肽，也不与其他已知的在心血管调节中不重要的激素受体或颗粒通道结合或形成正方形。

高效液相色谱法测定左乙拉西坦口服液的含量

方法开发

本实验的目的是建立一种精确、快速、经济、稳定的方法来分析制剂中左乙拉西坦的含量。

HPLC法测定

化学品和试剂

Ortho磷酸:AR级

甲醇:HPLC级

乙腈:HPLC级

水:milliq级

缓冲液的制备

在1000毫升水中加入1毫升正磷酸。

的制备流动相

将缓冲液、乙腈和甲醇按800:150:50% V/V的比例制备脱气混合物

色谱条件

色谱柱:Inertsil ph-3, 100 x 4.6mm;3μ

流速:0.8 mL/min

波长:210 nm

注射体积:10μL

列温度:500C

运行时间:30分钟

稀释剂的制备

使用水。

左乙拉西坦标准原液的制备

准确称量并将约50mg左乙拉西坦工作标准品转移到50ml容量瓶中。加入约10mL甲醇和声波溶解稀释与稀释剂体积和混合。

防腐剂标准原液的制备

精确称量并将约85mg对羟基苯甲酸甲酯工作标准品和10mg对羟基苯甲酸丙酯工作标准品转移到200mL容量瓶中，加入约20mL甲醇并超声溶解。用稀释剂稀释至体积后混合。

将3mL以上溶液转移到50mL容量瓶中，用稀释剂稀释至体积并混合。

标准溶液的制备

将5mL左乙拉西坦标准原液和3mL防腐剂标准原液转移到25mL容量瓶中，用稀释剂稀释至一定体积并混合。

样品溶液的制备

准确地将5mL左乙拉西坦口服液转移到200mL量瓶中，加入约120mL稀释剂，超声10分钟，偶尔摇晃。用稀释剂稀释至体积后混合。将部分溶液通过0.45μ膜过滤器过滤，并将前几mL的滤液用声波发生器丢弃。

将2mL以上溶液倒入25mL的容量瓶中，用稀释剂稀释至一定体积并混合。

过程

将稀释剂标准溶液(5次注射)和样品溶液分别注入色谱系统10mL。记录色谱图并测量峰响应。

系统适用性评估

从标准溶液中测定左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯峰的色谱柱效率不小于2000个理论板，相同峰的尾砂系数不大于2.0。

5次重复注射标准溶液左乙拉西坦峰面积的相对标准偏差不大于2.0。

5次重复注射标准溶液对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯峰面积的相对标准偏差均不大于5.0。

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯峰的保留时间分别约为2.5、7和20 min。

计算:

左乙拉西坦(%标签量)

在那里,

AT =样品溶液中左乙拉西坦峰面积。

一个₅= 5次重复注射标准溶液所得左乙拉西坦峰的平均面积。

W₅=左乙拉西坦工作标准重量，毫克

P =左乙拉西坦工作标准纯度(以此为依据)

L =左乙拉西坦标签声明，单位mg/mL。

防腐剂含量:

对羟基苯甲酸甲酯(%标记量)

在那里,

在₁=样品溶液中对羟基苯甲酸甲酯峰面积

作为₁= 5次重复注射标准溶液得到的对羟基苯甲酸甲酯峰的平均面积。

WS₁=对羟基苯甲酸甲酯工作标准重量，单位为mg。

P₁=使用对羟基苯甲酸甲酯工作标准的纯度(以此为基础)

l₁=对羟基苯甲酸甲酯标签声明，单位为mg/mL。

对羟基苯甲酸丙酯(%标记量)

在那里,

在₂=试样溶液中对羟基苯甲酸丙酯峰面积。

作为₂=对羟基苯甲酸丙酯峰的平均面积，取5个重复昆虫的标准溶液。

WS2 =对羟基苯甲酸丙酯工作标准重量，单位:毫克

P₂=所使用的对羟基苯甲酸丙酯工作标准的纯度(以此为基础)。

l₂=对羟基苯甲酸丙酯的标签声明，单位为mg/mL。

对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的代表性空白色谱图

方法验证总结1.系统适用性和系统精度:

以左乙拉西坦为标准品，按试验方法配制标准液，注入高效液相色谱系统10次。

通过计算10次左乙拉西坦重复注射的RSD %、保留时间和峰面积，从标准色谱图中评估系统适宜性参数。

验收标准:

1.每个标准溶液10次重复注射的主峰保留次数的RSD %不应超过1.0%

2.每一种左乙拉西坦标准溶液重复注射10次，主峰峰面积反应的% RSD不应超过2.0%，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯不应超过5%。

3.左乙拉西坦、甲羟苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的理论板数(N)为NLT 2000。

4.左乙拉西坦、甲羟苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的拖尾因子(T)峰值为NMT 2.0

观察:

保留时间和峰面积的RSD均在限定范围内。

2.特异性B)降解产物干扰:

进行了一项研究，以证明有效分离降解物从左乙拉西坦。对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯药品的分离部分暴露于以下应激条件下诱导降解。

a)水质退化

b)酸降解

c)碱降解

d)过氧化物降解

e)热降解

f)紫外线降解

g)湿度退化

采用光电二极管阵列检测器，按照以下测试方法条件将应力样品注入高效液相色谱系统。在上述条件下，所有样品的色谱图中所有降解物峰均从左乙拉西坦、苯甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的峰中分离出来，而安慰剂没有显示出任何相当大的峰。

利用water公司的Empower软件对压力样品的色谱图进行了左乙拉西坦、甲羟苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的峰纯度评估。

对于所有强制降解样品，降解物不应干扰对羟基苯甲酸甲酯左乙拉西坦和对羟基苯甲酸丙酯的定量测定。

验收标准:

纯度角应小于纯度阈值。左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯及其降解物质在纯度结果表中不应有任何标记。

观察:

在所有强制降解研究中发现纯度角小于阈值角，没有纯度标志的迹象。因此，这种方法被认为是“稳定性指示”。

3.精度

a.系统精度:按试验方法配制标准溶液，注射5次。

b.方法精密度:按试验方法分别配制6种样品制剂，每种溶液分别注射。

验收标准:

五种注射剂的相对标准偏差%不超过2.0%，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯不超过2%

左乙拉西坦的含量应不低于98.0%，不超过102.0%。

观察

试验结果表明，该试验方法是准确的。系统精度参见表7.3a，方法精度参见表7.3b。

精度(恢复)

对准确性进行了研究。按试验方法进行药物测定，每次重复3次，每个量瓶中分别加入等量的左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯，按试验方法得到相当于标记量的50% ~ 150%的浓度。计算了平均回收率。

分别将空白、安慰剂、左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯注入色谱。

验收标准

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯的平均回收率应不低于98.0%，不超过102.0%。

观察

回收率结果表明，该测试方法具有可接受的精度水平。

5.测试方法的线性

使用左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯工作标准，在目标浓度的50%至150%(50%、60%、80%、100%、120%和150%)的浓度范围内制备一系列溶液。测量1级和6级溶液的峰面积响应6次，测量2级到5级溶液的峰面积响应2次。

验收标准

相关系数应不小于0.9990。

y截距的%应为±2.0。

第1级和第6级的RSD不应超过2.0%。

观察:

相关系数为0.99958。

由上述研究可知，试验方法的线性范围为目标浓度的50% ~ 150%。

6.试验方法的坚固性

i)系统对系统/分析师对分析师/列对列的变化:

系统对系统、分析人员对分析人员、色谱柱对色谱柱在相似条件下、不同时间对不同HPLC系统、不同色谱柱和不同分析人员进行了变异性研究。制备了6个样品，每个样品都按照测试方法进行了分析。

在色谱柱、体系和分析器上，左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯的相对标准偏差均低于2%。

比较两种不同的HPLC系统、不同的色谱柱和不同的分析人员所获得的结果表明，该分析测试方法对于系统到系统/分析人员到分析人员/色谱柱到色谱柱的可变性是可靠的。

验收标准:

6种样品制剂中左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯的相对标准偏差%应不大于2.0%

左乙拉西坦，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯的百分比应介于两者之间
95.0% - -105.0%。

观察:

RSD在规定范围内。

ii)标准品台架稳定性及试验准备:

对左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯标准品和试验制剂进行了为期两天的稳定性研究。左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯试验制剂加标至目标浓度，注射初始、6.0Hr、12Hr和18Hr。左乙拉西坦，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯在最初到18小时的百分比差异在限定范围内。以类似的方式注射标准制剂初始、6.0Hr、12Hr和18Hr。

从上述研究中，可以确定标准制剂和试验制剂在工作台上放置18小时后是稳定的。

验收标准:

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯的初始稳定性样品与工作台稳定性样品的百分比之差应不超过3.0。

实验台上保存的标准品%测定值与初始值的偏差不应超过2.0。

观察:

测定结果在限定范围内。

7.鲁棒性i)流动相组成变化的影响:

进行了一项研究，以确定在流动相中有机相组成的变化的影响。按照测试方法配制的标准溶液通过两个流动相注入HPLC体系。评价了系统的适宜性参数，发现流动相为方法最高有机相的95%和110%。左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯共混溶液在目标浓度下采用有机相含量为95%和110%的流动相进行色谱分析。

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯从所有其他峰中析出，保留时间与有机相为100%的流动相所获得的保留时间相当。

通过研究确定了流动相组成的允许变化量为流动相方法中最高有机相的95% ~ 110%。

验收标准:

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯标准的拖尾系数应符合NMT 2.0的有机相变化标准。

观察:

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯的尾砂系数均在规定范围内。

ii)流量变化的影响:

进行了一项研究，以确定流量变化的影响。按试验方法配制标准溶液，分别以0.9ml/min和1.1ml/min的流速注入HPLC体系。系统适宜性参数进行了评估，发现在0.9ml/min和1.1ml/min流量范围内。

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯从所有其他峰中分离出来，保留时间与流速为1.0ml/min的流动相相当。

由上述研究可知，允许流量变化为0.9ml/min和1.1ml/min。

验收标准:

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯标准的尾砂系数应为NMT 2.0的流量变化。

观察:

的拖尾系数在规定范围内。

iii)温度变化的影响:

进行了一项研究以确定温度变化的影响。按试验方法配制的标准溶液在30℃的温度下注入HPLC体系。系统适宜性参数进行了评估，发现在30ºc的温度变化范围内。

同样，样品溶液在30ºC温度下进行色谱。左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯从其他峰中析出，保留时间与上述峰相当

验收标准:

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯标准溶液和样品溶液的尾砂系数应为NMT 2.0，以适应温度变化。

观察:

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯的尾砂系数均在规定范围内。

iv) pH值变化的影响:

研究pH变化的影响。按照试验方法制备标准液和样液，分别在pH为2.4和2.8的条件下注入HPLC体系。系统适宜性参数进行了评估，发现其pH值在2.4和2.8的范围内。

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯从所有其他峰中分离出来，保留时间与pH为2.5的流动相相当。

由上述研究可知，pH值在2.4和2.8时允许变化。

验收标准:

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯标准的拖尾系数应为NMT 2.0，以适应pH值的变化。

观察:

左乙拉西坦、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯的尾砂系数均在规定范围内。参考表- 7.7。

结论:

从上述结果可以看出，该方法具有鲁棒性。

总结与结论

建立了更快速、准确、特殊、精细、经济和可重复性的等间距反向段高效液相色谱技术，并被批准用于药物测量框架中缬沙坦的定量测定。根据ICH规则，该系统的特异性、线性度、精确性、准确性、粗糙度和功率均得到了认可。强度研究还用于确定试验和标准安排的可靠性。

在6个固定水平上开发了调节弯，发现该技术在18-36聚焦范围内是直的。相关系数≥0.9999。在50、70、90、100、110和200%的条件下，系统对分析物的固定精度进行了测定，回收率分别为100.2、102.2、101.4、101.4、101.1和101.2%。

通过对所创建技术的便携式级流量、摇篮pH值、组织和段温度等计划测试变化来执行框架适宜性参数。在容忍断点方面的结果很好。测试和标准安排稳定长达5天在室温和在更低的温度。在此期间取得的成果是可靠的。

通过这种方式，提出的解释技术是直接的，快速的，具体的，准确的，精确的，和金钱。所创建的解释性高效液相色谱系统是强大的，粗略的，有效的，并说明了定量测定缬沙坦药物剂量结构的特殊技术，该高效液相色谱策略有效地适用于质量控制实验室缬沙坦的常规调查。

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