基质金属蛋白酶作为伤口愈合的分子靶点穆萨sapientum: In-silico和体内证据

文摘

目前的工作一直在试图学习的伤口愈合穆萨sapientum(女士、香蕉)。穆萨sapientum ethanolic提取50% (MSE, 50 - 200毫克/公斤)在联合悬浮显示增加存在剂量依赖的相关性在老鼠体内切口创伤伤口强度模型。MSE 100毫克/公斤产生显著增加蛋白质和胶原蛋白成分,如羟脯氨酸,hexuronic酸和己醣胺在结缔组织细胞外基质含量研究死腔伤口模型鼠。leucocyanidin的作用,活性组分的女士被评估,在伤口愈合中硅的方法。leucocyanidin in-silico研究中被评价基质金属蛋白酶抑制剂的分子对接。分子对接表明leucocyanidin能够抑制所有选定的基质金属蛋白酶,即胶原酶(-9.67千卡每摩尔),白明胶酶(-8.67千卡每摩尔),弹性蛋白酶(-8.27千卡每摩尔),stromelysin(-10.17千卡每摩尔)。

关键字

leucocyanidin, MMP的胶原酶,白明胶酶、弹性蛋白酶stromelysin,伤口愈合

介绍

伤口愈合的目的是纠正一个受伤组织的结构和功能。细胞之间的相互作用和细胞外基质(ECM)的组件负责组织修复。ECM调节生长、扩散运动,分化的细胞生活在它。ECM是由纤维结构蛋白(胶原蛋白和弹性蛋白),粘着糖蛋白、蛋白聚糖。结构蛋白是通过退化矩阵metalloproteases。基质金属蛋白酶属于四类:胶原酶(金属蛋白酶- 1、8和-13年),明胶酶(MMP-2和9),在stromelysins (MMP-3, -10年和-11年)和一个包含matrilysin异质群体(MMP-7) metallo-elastase (MMP-12) enamelysin (MMP-20) endometase (MMP-26)和epilysin (MMP-28) [1]。基质金属蛋白酶是迅速被一系列特定的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)从而防止不受控制的这些蛋白酶的作用。这些TIMPs一群四个蛋白质作为一个群体有效抑制体内所有基质金属蛋白酶(2]。TIMP有细胞生长促进活动对于许多类型的细胞和保护细胞从细胞凋亡3]。

复苏的抗拉强度不仅取决于增加胶原蛋白的合成还减少退化。伤口是胶原蛋白合成和降解之间的平衡力量。在急性伤口,蛋白酶之间有一个平衡活动和ECM沉积(4]。然而,过度的MMP的活动有助于慢性伤口的发展(5]。延迟愈合的特点是增加基质金属蛋白酶(MMPs),减少TIMPs [6]。最近的证据表明,抗凝,活化蛋白C可能是有用的治疗是一小块没有治愈的伤口,防止过度蛋白酶活动(5]。

选择性控制MMP的活动可能是一种有价值的治疗方法促进慢性溃疡的愈合。大多数临床试验使用合成金属蛋白酶抑制剂(Batimastat)进行和最终失败由于不幸的副作用7]。草药有铅化合物的来源得到太多的关注,因为它们被认为是随着时间的考验,相对安全。其中最重要的生物活性成分的植物生物碱、丹宁,苷和黄酮类化合物。生的果肉穆萨sapientum认为有天然的药用价值,例如,消化性溃疡(8),溃疡性结肠炎和糖尿病。从生香蕉天然黄酮类(m . sapientum var. paradisiaca)纸浆,leucocyanidin,保护胃粘膜免受侵蚀9]。

本研究的目的是探索计算方法了解伤口愈合的分子机制的影响50% ethanolic提取(MSE)使用我女士)体内切口(伤口强度)和死腔伤口模型(ECM)的生化估计组件在老鼠和ii)在硅片方法中,其中一个目标蛋白质的每个类的基质金属蛋白酶参与伤口力量被选为分子对接leucocyanidin(黄酮存在于MS)之一。在硅片毒性、药代动力学和药物leucocyanidin可能性评分,估计探索leucocyanidin作为先导化合物。

材料和方法

在活的有机体内方法

动物

近交Charles-Foster (CF)白化大鼠(150 - 250 g)和老鼠(25 - 30 g)的性是来自中央动物医学科学研究所,贝拿勒斯印度教大学,印度瓦拉纳西。他们部门动物屋26岁±20 C和相对湿度44 - 56%,光明与黑暗周期分别为10和14 h 1周之前和期间的实验。动物提供标准的啮齿动物颗粒随意饮食和水。“实验动物保健原则”(NIH没有出版。82 - 23,1985年修订)随访指导方针。动物伦理委员会的批准机构拍摄前实验工作(没有通知。-院长/ 2008 - 09/316过时5/1/2009)。

收集和植物提取物的准备

穆萨的果肉sapientum (MS)在几个月的September-March收集。100克女士果肉粉和500毫升乙醇提取,在室温下保存3天,提取过滤。上述过程重复两次,获得的提取物(女士)涨跌互现,在室温下干燥。收益率为3.0% (w / w)。MSE储存在-20°C到进一步使用。

处理协议

伤口愈合的研究是在切开的伤口和死腔伤口模型。MSE和标准药物维生素E (VTE)悬浮在1%羧甲基纤维素(CMC)在蒸馏水和从第一天每日口服一次,4小时后实验伤口了10天的感应,控制老鼠收到1% CMC。动物收到MSE /静脉血栓栓塞,口头的帮助下一个oro-gastric管悬挂在10毫升/公斤体重的体积。分级剂量的MSE(50、100和200毫克/公斤)被发现的最佳有效剂量MSE加强伤口切开伤口模型大鼠的抗断强度。静脉血栓栓塞(Evion,默克有限)促进伤口愈合是200毫克/公斤作为标准剂量的药物比较的伤口愈合实验动物的行为。

切口伤口[10]

两个脊椎旁切口(6厘米长)通过完整的皮肤厚度脊柱的两侧。与打断缝合伤口被关闭,1厘米。在第7天缝合线被移除。伤口强度(WBS)测量post-wounding第十天。WBS在麻醉大鼠测量了手术台。一条线是两侧的脊椎旁远离伤口伤口3毫米。两个Allice钳坚决应用于面对面。的一个钳固定,而另一个是连接到一个自由悬浮轻量级聚丙烯容器通过毕业字符串运行到一个滑轮。水从水库获准流动缓慢而稳步进入容器。逐渐增加的体重是传播给伤口伤口边缘网站拉开。 As and when the wound just opened up, the water flow was arrested and the volume of water collected in the container was noted. Three readings were recorded for a given incision wound and the procedure was repeated on the wound on the contra lateral side. The average reading of the group was taken as an individual value of breaking strength.

死腔伤口[10]

这些伤口是由植入两个聚丙烯管(0.5 x 2.5每平方厘米),一个在腰部两侧背表面的老鼠。post-wounding第十天,动物被牺牲和肉芽组织形成的植入管仔细解剖了估计肉芽组织中胶原蛋白含量。

估计蛋白质和胶原蛋白

肉芽组织的收集管,重和干40 o c . 5毫克干材料用于蛋白质的估计其余的干物质摄于玻璃塞试管。6 n HCl添加在每个管,包含40毫克每毫升盐酸肉芽组织干的。管是保存在沸水浴24小时(两天每12小时)水解。酸的水解是冷却和过度被10 n氢氧化钠中和用酚酞。中性水解物的体积是稀释的浓度为20毫克/毫升的干肉芽组织在最后用蒸馏水水解。水解是用于估计羟脯氨酸(11),hexuronic酸(12)和己醣胺(13按照标准程序。

急性毒性研究

10倍的有效剂量(2000毫克/公斤)女士悬浮在1%羧甲基纤维素(CMC)蒸馏水(1毫升/ 100克体重)的口服药物的测试组,对照组收到1% CMC口头(6小鼠相同数量的男女每组)。进行了急性毒性研究根据经合组织420年指南(经合组织2000)由委员会为目的的实验动物的管理和监督,印度(CPCSEA)。观察了在2、4和8小时治疗后体重、呼吸率、心率和行为像冷漠迹象,减少运动行为,任何ANS(唾液分泌,流泪,任何颜色变化的眼睛,粘膜、皮肤或皮毛),中枢神经系统(电机活动、抽搐、昏迷、行为模式包括的意识水平和步态变化)活动和死亡率在单剂量测试药物管理局。

在网上

基质金属蛋白酶的结构和leucocyanidin分别从PDB和PubChem检索。分子对接是由AutoDock4完成的。Autodock实际上包含两个主要项目Autodock网格和汽车。Autodock执行一系列的配体的对接网格描述目标蛋白质。拉马克学说的遗传算法是由人口随机发生器、对接程序基于拉马克的遗传算法,基于分子力学和本地搜索功能(MM)能量最小化。输入文件的自动网格和Autodock被创建,然后是网格地图计算运行,其次是对接Autodock计算。这些网格地图是用于Autodock对接计算来确定总与高分子配位体的相互作用能。网格框大小设定在126年,126年和126°(x, y, z)包括所有出现在刚性大分子的氨基酸残基。网格点之间的间距为0.375埃。拉马克学说的遗传算法(LGA)选择寻找最好的矫形器。 During the docking process, a maximum of 10 conformers were considered. The population size was set to 150 and the individuals were initialized randomly. Maximum number of energy evaluation was set to 500000, maximum number of generations 1000, maximum number of top individual that automatically survived set to 1, mutation rate of 0.02, crossover rate of 0.8, Step sizes were 0.2 Å for translations, 5.0° for quaternions and 5.0° for torsions. Cluster tolerance 0.5Aº, external grid energy 1000.0, max initial energy 0.0, max number of retries 10000 and 10 LGA runs were performed. Autodock results were analyzed to study the interactions and the binding energy of the docked structure [14- - - - - -17]。对接结构的可视化是使用PYMOL工具(18]。

统计分析

是由SPSS统计比较使用单向方差分析(方差分析)。

结果

体内研究

切口创伤模型,研究创伤强度(WBS)

控制老鼠收到1% CMC口头WBS 338.3±13.5克。MSE 100和200毫克/公斤显示WBS 363.3±6.8, 445.0±9.7, 438.3±8.4 g分别静脉血栓栓塞200毫克/公斤显示WBS 528.3±6.9 g。所有剂量的MSE和静脉血栓栓塞显示显著增加WBS与控制;因此MSE 100毫克/公斤被选为进一步研究(表1)。

死腔伤口模型——胶原蛋白决定因素的研究

MSE和静脉血栓栓塞显著提高干体重的组织每100克老鼠的体重以及蛋白质含量毫克/克干组织(表1)。同样像hydroxylproline胶原蛋白决定因素,hexuronic和己醣胺也显著增加治疗后与MSE相当与静脉血栓栓塞(表1)。

结果均值±SEM 6在每组大鼠。b P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001加元相对于各自的对照组(统计分析是由通过SPSS单向方差分析)。

急性毒性研究

急性毒性研究的结果即使有效剂量的10倍MSE ANS没有任何变化,直到14天小鼠中枢神经系统或死亡率的研究表明它是安全的。

汽车码头leucocyanidin胶原酶,结果白明胶酶、弹性蛋白酶和Stromelysin

胶原酶的目标蛋白质结构、白明胶酶、弹性蛋白酶和Stromelysin leucocyanidin对接,提供优秀的AutoDock结果被他们的结合能的最小值。最好的绑定模式leucocyanidin的四个目标蛋白质的活性显示在网站图1 a, b, c和d和相应的能源价值和抑制常数中列出表2。人类胶原酶对接分析结果显示,作为一个氢键结合位点在Glu 219 / OE2 Pro238 / O和阿拉巴马州182 / HN leucocyanidin (图1一个)。图1 b显示绑定交互与leucocyanidin白明胶酶,其中三个氢键在Leu164 / HN, Ile 222 / O和Glu202 / OE2被发现与leucocyanidin交互。对接分析人类的弹性蛋白酶和弹性蛋白酶- leucocyanidin leucocyanidin显示绑定交互,三个氢键在Ala232 / HN, Arg128 / O和His210 / O位置(图1 c),同时,Stromelysin显示绑定交互三个氢键Asn 162 / O, Glu 202 / OE2和Leu218 / O leucocyanidin (图1 d)。

讨论

在伤口强度模型中,治疗伤口的抗拉强度的增加可能是由于胶原蛋白浓度的增加和稳定的纤维。体内研究表明,穆萨sapientum提取增加抗拉强度比控制。自切口创伤治疗显示女士略大的抗拉强度,它可以推断可能是由于胶原蛋白合成增加,减少蛋白质的降解和交联。伤口愈合是一个复杂的动态过程,包括细胞外基质分子的协调和连续的沉积,导致耐药的形成新组织(19]。在这些分子,粘多糖(GAG)和蛋白聚糖(PG),胶原蛋白和纤连蛋白,结缔组织细胞外基质的主要成分(20.]。除了其结构功能,呕吐和PG参与几个流程与伤口愈合,如细胞粘附、迁移和增殖21]。

在死亡空间伤口模型有肉芽组织中的蛋白质含量的增加可能是由于因为蛋白酶抑制蛋白水解活性降低或增加基质蛋白的表达。评估肉芽组织中胶原蛋白含量的控制和实验的伤口评估胶原蛋白决定因素如羟脯氨酸,hexuronic酸和己醣胺明显显示,增强胶原蛋白的合成和沉积和女士还发现抑制退化。分解胶原蛋白释放自由羟脯氨酸肽。羟脯氨酸的测定,因此,本研究中使用的索引胶原营业额。中描述的数据表1在结果部分显示,羟脯氨酸含量的动物的肉芽组织对待女士的对照组相比显著增加动物,因此表明胶原蛋白增加营业额。这个增加是明显高于控制的绝对值以及每毫克蛋白值。死者的羟脯氨酸含量增加空间的伤口被发现表明更快胶原营业额与并发增加导致快速愈合伤口治疗的抗拉强度。己醣胺和hexuronic酸分子矩阵,作为地面基础新细胞外基质的合成。在目前的研究中,hexuronic酸和己醣胺浓度的组件葡糖氨基葡聚糖被发现是在提取与控制相比显著增加。粘多糖是已知稳定胶原纤维增强静电离子相互作用,可能控制最终的校准和特征尺寸。伤口肉芽组织的生化分析证实,穆萨sapientum提取呕吐和蛋白质沉积增加。

增殖阶段进展,TGF-ß减少蛋白酶的分泌负责矩阵的分解也会刺激蛋白酶抑制剂,组织抑制剂metallo-protease (TIMP) [22]。MMP-8亲和力较强,对I型胶原蛋白,参与各种炎症过程23]。对接研究显示,leucocyanidin可能会降低胶原酶活动通过与MMP-8绑定,从而增加细胞外基质的胶原蛋白1内容。这是明显的体内数据本研究观察中增加蛋白质含量的穆萨sapientum治疗组。研究结果与获得的结果一致性的MMP抑制伤口愈合的研究。有报告延迟伤口愈合的MMP的活动增加(24,25]。

在最近的临床研究中,对基质金属蛋白酶和TIMPs伤口检查。有增加基质金属蛋白酶水平和减少TIMP水平在糖尿病伤口。减少在非TIMPs愈合伤口也在其他研究报告(6,26]。

MMP-2 proteolytically能力降低明胶,I型,IV和V胶原蛋白、弹性蛋白和vitronectin [27]。夏皮罗et al。(2010)28)表明,MMP-2内皮细胞发生凋亡,抑制新生血管形成。在目前的研究中,对接的leucocyanidin白明胶酶显示绑定交互三个氨基酸残基,Leu164 / HN, Ile 222 / O和Glu202 / OE2分别。这些绑定可能增加的明胶,I型,IV和V胶原蛋白,弹性蛋白细胞外基质的内容。类似的发现与MMP的活动增加延迟伤口愈合也由不同的研究小组(29日,30.]。

的主要基质MMP-12弹性蛋白,但MMP-12能够降解ECM成分。MMP-12水平升高已经以各种疾病(31日]。通过抑制弹性蛋白酶,leucocyanidin可能增加对伤口弹性蛋白的重要力量。过度和长时间的表达和激活基质金属蛋白酶的病原学的原因是慢性疾病,至少部分,过度的组织破坏32]。本研究的结果表明,leucocyanidin可以绑定MMP-12和可能减少MMP-12的活动。

MMP-3广泛的底物特异性和MMP-3被描述许多ECM降解纤连蛋白等蛋白质变性胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖。MMP-3无法降解triple-helical胶原蛋白,但可以打通的球状部分IV型胶原蛋白(33]。MMP-3似乎pro-apoptotic效应(34]。MMP-3被描述为受损的伤口愈合的重要因素[35]。collagenase-1和stromelysin-1都成纤维细胞中发现的愈合的上皮细胞,和stromelysin-1表现尤其突出36]。有增加stromelysin-1和2和TIMP在急性和慢性伤口但减少TIMP在慢性伤口表明减少慢性伤口的MMP抑制剂水平(37]。leucocyanidin通过绑定stromelysin可能作为外源性TIMP的替代品。

结论

酶是主要的药物靶点的药物发现和开发过程在制药和生物技术产业。在伤口愈合过程中基质金属蛋白酶中扮演一个重要角色,基质金属蛋白酶的表达和激活一系列的疾病有关,包括骨关节炎、肿瘤转移、血管生成、心血管疾病和慢性伤口。本研究强调对MMP抑制剂的发展在伤口治疗药物。穆萨sapientum提取发现增加伤口的力量和伤口强度的增加可能是由于抑制基质金属蛋白酶的leucocyanidin,穆萨sapientum成分存在。伤口强度的增加也可能是由于增加的水平不同的细胞外蛋白质胶原蛋白和粘多糖等。因此,本研究试图关联对伤口愈合的体内发现穆萨sapientum(香蕉)在网上工具。这些努力有助于在建设发展新的药物来治疗不同疾病的可能性造成过度的基质金属蛋白酶活动。

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