基质金属蛋白酶作为皂化木伤口愈合的分子靶点:硅内和体内证据

摘要

本文试图研究香蕉的创面愈合作用。50%木香乙醇提取物(MSE, 50 ~ 200 mg/kg)混悬剂对切口创面模型大鼠体内创面断裂强度呈剂量依赖性提高。在死亡空间创面模型大鼠实验中，MSE 100 mg/kg可显著增加细胞外基质结缔组织中羟脯氨酸、己糖酸、己糖胺等蛋白质和胶原成分含量。用硅片法评估了MS的活性成分——白青素在伤口愈合中的作用。在硅内研究中，采用分子对接的方法对亮氨酸作为基质金属蛋白酶抑制剂进行了评价。分子对接结果表明，亮氨酸能够抑制所有基质蛋白酶，即胶原酶(-9.67 Kcal/mol)、明胶酶(-8.67 Kcal/mol)、弹性酶(-8.27 Kcal/mol)和基质溶素(-10.17 Kcal/mol)。

关键字

亮氨酸，MMP，胶原酶，明胶酶，弹性酶，基质溶素，伤口愈合

简介

伤口愈合的目的是纠正受伤组织的结构和功能。细胞与细胞外基质(ECM)组分之间的相互作用负责组织修复。ECM调节细胞的生长、增殖、运动和分化。ECM由纤维结构蛋白(胶原蛋白和弹性蛋白)、黏附糖蛋白和蛋白聚糖组成。结构蛋白的降解是由基质金属蛋白酶实现的。基质蛋白酶分为四类:胶原酶(MMP-1、8和-13)、明胶酶(MMP-2和-9)、基质溶血酶(MMP-3、-10和-11)和一种异质组，包括基质溶血素(MMP-7)、金属弹性酶(MMP-12)、搪瓷溶血素(MMP-20)、子宫内膜酶(MMP-26)和epilysin (MMP-28) [1］．基质金属蛋白酶被一系列特定的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)迅速抑制，从而防止了这些蛋白酶不受控制的作用。这些TIMPs是一组四种蛋白质，在体内有效抑制所有MMPs [2］．TIMP对多种类型的细胞具有促进细胞生长的活性，并能保护细胞不凋亡[3.］．

抗拉强度的恢复不仅取决于胶原蛋白合成的增加，还取决于降解的减少。伤口强度是胶原蛋白合成和降解之间的平衡。在急性伤口中，蛋白酶活性与ECM沉积之间存在平衡[4］．然而，过量的MMP活性有助于慢性伤口的发展[5］．延迟愈合的特征是基质金属蛋白酶(MMPs)增加，TIMPs减少[6]。最近的证据表明，抗凝剂活化蛋白C可通过防止蛋白酶活性过高而在治疗未愈合的伤口中发挥作用[5］．

选择性控制MMP活性可能是促进慢性溃疡愈合的一种有价值的治疗方法。大多数使用合成金属蛋白酶抑制剂(Batimastat)的临床试验由于不良的副作用而被证明是不成功的[7］．草药作为含铅化合物的来源受到了广泛关注，因为它们被认为是经过时间考验的，而且相对安全。植物的这些生物活性成分中最重要的是生物碱、单宁酸、糖苷和类黄酮。未成熟的葡萄果肉被认为具有天然药用价值，例如消化性溃疡[8溃疡性结肠炎和糖尿病。从未成熟的香蕉果肉(M. sapientum vara . paradisiaca)中提取的天然类黄酮，即白色素，可保护胃黏膜免受侵蚀[9］．

本研究的目的是探索通过计算方法了解50%乙醇提取物(MSE)在大鼠体内切口(创面强度)和死空间创面模型(ECM成分的生化估计)，以及ii)硅硅法，其中从涉及创面强度的每一类MMPs中选择一个靶蛋白与白色素(MS中存在的一种类黄酮)进行分子连接。在硅毒性、药代动力学和药物似然评分等方面，对其进行了评价，以探索其作为先导化合物的可能性。

材料与方法

在活的有机体内方法

动物

近亲繁殖的查尔斯-福斯特(CF)白化大鼠(150-250克)和雌雄小鼠(25-30克)，取自印度瓦拉纳西巴纳拉斯印度大学医学科学研究所中心动物馆。实验前、实验中分别在26±20℃、相对湿度44-56%的部门动物房里饲养1周，光、暗周期分别为10和14 h。给动物提供标准的啮齿动物颗粒饲料和自由饮水。《实验动物护理原则》(美国国立卫生研究院第1号出版物)。82-23, 1985年修订)的指导方针。在实验工作之前，必须获得机构动物伦理委员会的批准(通知编号:;- Dean/ 2008-09/316 date 5/1/2009)。

植物提取物的收集与制备

皂荚(Musa sapientum, MS)果肉采集时间为9 - 3月。取MS果浆粉100 g，用500 ml乙醇提取，室温保存3天，过滤提取液。上述步骤重复两次，将得到的提取物(MS)混合并在室温下干燥。产量约为3.0% (w/w)。MSE保存在-20°C，直到进一步使用。

处理协议

采用切口创面模型和死隙创面模型进行创面愈合研究。MSE和标准药物维生素E (VTE)悬浮于1%羧甲基纤维素(CMC)蒸馏水中，从实验创面诱导后第1天、4小时开始，每日口服1次，连续10天，对照组大鼠仅给予1%羧甲基纤维素(CMC)。动物接受MSE/ VTE，在口胃管的帮助下口服悬液，体积为10 ml/kg体重。以50、100、200 mg/kg MSE为分级剂量，研究MSE增强大鼠切口创面断裂强度的最佳有效剂量。促进创面愈合的VTE (Evion, Merck Limited)以200mg/kg剂量作为标准药物，用于比较实验动物的创面愈合作用。

切口伤口[10]

在脊柱两侧全层皮肤上开2个6厘米长的椎旁切口。伤口以间断缝线缝合，间隔1cm。第7天拆除缝合线。伤后第10天测定伤口断裂强度(WBS)。在麻醉大鼠固定在手术台上测量WBS。在椎旁创面两侧距创面3mm处画一条线。两个爱丽丝钳彼此相对地牢牢地夹在绳子上。其中一个镊子是固定的，而另一个镊子通过一根绳子连接到滑轮上，连接到一个自由悬挂的轻质聚丙烯刻度容器上。水被允许从水库缓慢而稳定地流入容器。重量的逐渐增加被传递到伤口部位，将伤口边缘拉开。 As and when the wound just opened up, the water flow was arrested and the volume of water collected in the container was noted. Three readings were recorded for a given incision wound and the procedure was repeated on the wound on the contra lateral side. The average reading of the group was taken as an individual value of breaking strength.

死亡空间之伤[10]

这些伤口是通过在每只大鼠背部腰部两侧分别植入两根聚丙烯管(每根0.5 x 2.5 cm2)而形成的。伤后第10天处死动物，仔细解剖植入管上形成的肉芽组织，测定肉芽组织中胶原蛋白含量。

蛋白质和胶原蛋白的估计

从其中一个试管中收集肉芽组织，称重并在40℃下干燥，5mg干燥材料用于蛋白质估计，而其余干燥材料则在玻璃塞试管中采集。在每个试管中加入6N HCl，使其每ml HCl含有40mg干燥的肉芽组织。试管在沸水浴中保持24小时(每管12小时，为期两天)水解。然后将水解物冷却，并使用酚酞用10N NaOH中和多余的酸。用蒸馏水将中性水解液的体积稀释至干燥肉芽组织的浓度为20 mg/ml。水解产物用于测定羟脯氨酸[11]、己醛酸[12]和己糖胺[13]遵循标准程序。

急性毒性研究

实验组口服10倍有效剂量的MS (2000 mg/kg)悬于1%羧甲基纤维素(CMC)蒸馏水中(1 ml/100 g体重)，对照组口服1% CMC(每组雌雄白鼠6只，数量相等)。急性毒性研究是根据印度动物实验控制和监督委员会(CPCSEA)制定的OECD指南420 (OECD 2000)进行的。在治疗后2、4和8小时观察体重、呼吸频率、心率和行为体征，如冷漠、运动行为减少、任何ANS(流涎、流泪、眼睛、粘膜、皮肤或皮毛的任何颜色变化)、CNS(运动活动、抽搐、昏迷、行为模式，包括意识水平和步态变化)活动和单剂量试验药物给药后的死亡率。

在网上

从PDB和PubChem中分别提取了基质金属蛋白酶和亮氨酸的结构。分子对接由AutoDock4完成。Autodock实际上由Autodock和Auto Grid两个主要程序组成。Autodock将配体与一组描述目标蛋白的网格进行对接。拉马克遗传算法由随机种群生成器、基于拉马克遗传算法的对接程序和基于分子力学能量最小化的局部搜索函数组成。创建Auto Grid和Autodock的输入文件，然后运行网格映射计算，然后在Autodock中进行对接计算。这些网格图被用于Autodock对接计算，以确定配体与大分子的总相互作用能。网格盒大小设置为126、126和126 A°(x、y和z)，以包括刚性大分子中存在的所有氨基酸残基。网格点之间的间距为0.375埃。采用拉马克遗传算法(LGA)来寻找最优构象。 During the docking process, a maximum of 10 conformers were considered. The population size was set to 150 and the individuals were initialized randomly. Maximum number of energy evaluation was set to 500000, maximum number of generations 1000, maximum number of top individual that automatically survived set to 1, mutation rate of 0.02, crossover rate of 0.8, Step sizes were 0.2 Å for translations, 5.0° for quaternions and 5.0° for torsions. Cluster tolerance 0.5Aº, external grid energy 1000.0, max initial energy 0.0, max number of retries 10000 and 10 LGA runs were performed. Autodock results were analyzed to study the interactions and the binding energy of the docked structure [14-17］．对接结构的可视化使用PYMOL工具[18］．

统计分析

采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学比较。

结果

体内研究

切口创面模型-创面断裂强度(WBS)的研究

对照组口服1% CMC, WBS为338.3±13.5 g。MSE 50、100和200 mg/kg显示WBS分别为363.3±6.8、445.0±9.7和438.3±8.4g, VTE 200 mg/kg显示WBS为528.3±6.9 g。与对照组相比，各剂量MSE和VTE均显著增加WBS;因此选择MSE 100 mg/kg进行进一步研究(表1)．

死亡空间创面模型-胶原决定因子的研究

MSE和VTE均能显著提高大鼠每100 g体重组织干重和干组织蛋白含量(表1)．同样，胶原决定因子如羟脯氨酸、己糖醛酸和己糖胺在MSE治疗后也显著增加，这与VTE相当(表1)．

结果为每组6只大鼠的均值±SEM。a P< 0.05, b P< 0.01, c P< 0.001，与各自对照组比较(统计学分析采用SPSS单因素方差分析)。

急性毒性研究

急性毒性研究的结果显示，即使使用10倍于有效剂量的MSE，小鼠的ANS、CNS或死亡率也没有任何变化，直到14天的研究表明它是安全的。

白色素与胶原酶、明胶酶、弹性酶和基质溶素的Auto Dock结果

对胶原酶(Collagenase)、明胶酶(Gelatinase)、弹性蛋白酶(Elastase)和基质蛋白(Stromelysin)的目标蛋白结构进行了白青素(leucocyanidin)的对接，从它们的结合能最小值来看，AutoDock结果良好。在4个目标蛋白的活性位点上显示了白青素的最佳可能结合方式图1 a, b, c而且d其相应的能量值和抑制常数列于表2．人胶原酶对接分析结果显示，白青素在Glu 219/OE2、Pro238/O和Ala 182/HN的结合位点为一个氢键(图1一个)．图1 b显示明胶酶与亮色素的结合相互作用，其中Leu164/HN、Ile 222/O和Glu202/OE2三个氢键与亮色素相互作用。人Elastase与leucocyanidin的对接分析显示Elastase- leucocyanidin的结合相互作用，在Ala232/HN, Arg128/O和His210/O位置有三个氢键(图1 c)， Stromelysin在Asn 162/O、Glu 202/OE2和Leu218/O三个氢键位点与白青素发生结合相互作用(图1 d)．

讨论

在创面断裂强度模型中，处理后创面抗拉强度的增加可能是由于胶原蛋白浓度的增加和纤维的稳定。体内实验表明，与对照相比，木香提取物具有较强的抗拉强度。由于用MS处理的切口伤口显示出稍强的抗拉强度，可以推断这可能是由于胶原合成增加，蛋白质降解和交联减少。伤口愈合是一个复杂而动态的过程，它涉及到细胞外基质分子的协调和顺序沉积，导致抗性新组织的形成[19］．在这些分子中，糖胺聚糖(GAG)和蛋白聚糖(PG)与胶原蛋白和纤维连接蛋白是结缔组织细胞外基质的主要成分[20.］．除了它们的结构功能外，GAG和PG还在与伤口愈合有关的几个过程中发挥作用，如细胞粘附、迁移和增殖[21］．

在死空创面模型中，肉芽组织蛋白含量增加，这可能是由于蛋白酶抑制导致蛋白水解活性降低或基质蛋白表达增加所致。通过估计胶原决定因素如羟脯氨酸、己糖酸和己糖胺，对对照组和实验伤口肉芽组织中的胶原含量进行评估，清楚地表明MS促进了胶原的合成和沉积，并抑制了胶原的降解。胶原蛋白的分解释放出游离的羟脯氨酸及其多肽。因此，在本研究中，羟脯氨酸的测量已被用作胶原蛋白周转的指标。所描述的数据表1，结果部分显示，与对照组动物相比，MS处理的动物肉芽组织中羟脯氨酸含量显著增加，因此表明胶原蛋白周转增加。这一增幅在绝对值和每毫克蛋白质值方面均显著高于对照。研究发现，死亡空间伤口中羟脯氨酸含量的增加表明胶原蛋白周转更快，导致快速愈合，同时治疗伤口的抗拉强度增加。己糖胺和己糖醛酸是基质分子，它们是合成新细胞外基质的基质。本研究发现，与对照相比，提取液中糖胺聚糖成分己糖醛酸和己糖胺的浓度显著升高。已知糖胺聚糖通过增强与胶原纤维的静电和离子相互作用来稳定胶原纤维，并可能控制其最终排列和特征尺寸。伤口肉芽组织的生化分析证实，皂荚提取物增加GAG和蛋白质沉积。

随着增殖期的进展，TGF-ß减少了负责分解基质的蛋白酶的分泌，并刺激蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP) [22］．MMP-8对I型胶原蛋白具有更强的亲和力，并参与各种炎症过程[23］．对接研究发现，亮氨酸可能通过与MMP-8结合而降低胶原酶活性，从而增加细胞外基质中胶原1的含量。这在本研究的体内数据中是明显的，其中观察到在处理了樟脑的情况下蛋白质含量增加。这一发现与MMP在伤口愈合中的抑制研究结果一致。有报道称在MMP活性增加的情况下，伤口愈合延迟[24，25］．

在最近的一项临床研究中，研究人员检查了伤口是否存在MMPs和TIMPs。糖尿病创面中MMPs水平升高，TIMP水平降低。其他研究也报道了未愈合伤口中TIMPs的减少[6，26］．

MMP-2具有蛋白水解降解明胶、I型、IV型和V型胶原蛋白、弹性蛋白和玻璃蛋白的能力[27］．夏皮罗等人(2010)[28]已经证明了MMP-2诱导内皮细胞凋亡并抑制新生血管。本研究中，亮氨酸与明胶酶的对接分别与Leu164/HN、Ile 222/O和Glu202/OE2三个氨基酸残基结合相互作用。这些结合可增加明胶水平，I型，IV型和V型胶原，细胞外基质弹性蛋白含量。不同的研究小组也在MMP活性增加的伤口延迟愈合中发现了类似的结果[29，30.］．

MMP-12的主要底物是弹性蛋白，但MMP-12能够降解其他ECM成分。MMP-12水平升高已在多种疾病中得到测量[31］．通过抑制弹性蛋白酶，可增加弹性蛋白的数量，这对创面强度很重要。MMPs的过度和长时间表达和激活是慢性疾病的病因，至少部分是由于过度的组织破坏[32］．本研究结果表明，亮氨酸可与MMP-12结合，并可能降低MMP-12的活性。

MMP-3的底物特异性是广泛的，MMP-3已被描述为降解许多ECM蛋白，如纤维连接蛋白、变性胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖。MMP-3不能降解三螺旋胶原蛋白，但可以裂解IV型胶原蛋白的球状部分[33］．MMP-3似乎具有促凋亡作用[34］．MMP-3被认为是伤口愈合受损的重要因素[35］．胶原酶-1和基质溶血素-1都存在于非愈合上皮下的成纤维细胞中，基质溶血素-1的表达尤其突出[36］．急性和慢性创面基质溶血素-1、-2和TIMP升高，慢性创面TIMP降低，提示慢性创面MMP抑制剂水平降低[37］．与基质溶血素结合的亮氨酸可能作为TIMP的外源性替代品。

结论

酶是制药和生物技术行业药物发现和开发过程中的主要药物靶点。MMPs在创面愈合过程中起着重要作用，其过度表达和激活与骨关节炎、肿瘤转移、血管生成、心血管疾病和慢性创伤等一系列疾病有关。本研究着重于MMP抑制剂作为创伤治疗药物的开发。研究发现，皂荚提取物可以增加创面强度，而这种增加的创面强度可能是因为皂荚中存在的一种成分——亮氨酸抑制了基质金属蛋白酶。这种伤口强度的增加也可能是因为不同的细胞外蛋白水平的增加，如胶原蛋白和糖胺聚糖。因此，本研究试图将香蕉伤口愈合的体内发现与硅工具相关联。这些努力可能有助于开发新的药物来治疗由过度的基质金属蛋白酶活性引起的各种疾病。

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