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菜单ISSN: E 2347 - 226 x, P 2319 - 9857
ISSN: E 2347 - 226 x, P 2319 - 9857
1植物病理学、无人机、GKVK班加罗尔- 560065,卡纳塔克邦,印度。
2植物病理学的无人机,Dharwad - 580 005卡纳塔克邦,印度。
收到:03/03/2014修改后:13/06/2014接受:28/05/2014
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疾病的早期诊断是必要的,以减少疾病的幼苗阶段收获为了成长健康作物最高产量。检测细菌是植物病原菌的跟踪或植物材料,尤其是当他们发生潜伏地,不会引起症状。但标识意味着孤立,描述和命名的细菌。这是一个重要的步骤在细菌感染的诊断和分类研究。没有独家或可靠的简单方法识别病原体和疾病的原因。传统的识别方法是目测的病原体原位或体外在纯文化通过显微镜检查染色反应,殖民地字符,氧需求,生理特征生化字符和血清学方法。识别通过噬菌体技术可以被认为是传统和现代的。更少的特异性和更少的歧视在物种和应变水平的缺点是传统识别方法。近年来完全新的识别技术已经开发出来。这主要是由于分子生物学的发展,揭示微生物的结构和功能。 Knowledge of the composition and the place of structural elements in microorganism has made the real finger printing methods possible such as special serological methods like Immuno-electrophoresis, Monoclonal antibodies, Immunogold labeling. Identification by separation of bacterial components using chromatographic techniques (FAA Analysis by Gas chromatography), separation of bacterial protein (PAGE). The nucleic acid based identification methods are more important because it is purely on genetic basis. Fluorescent In situ Hybridization (FISH), developed by Christoph Lengauer, based on the DNA-DNA hybridization. RFLP based on the Southern hybridization. One of the important development in genomic studies is the discovery of PCR by Kary Mullis in 1985. The PCR based identification methods are RFLP-PCR, PFGE, RAPD,REP-PCR, AFLP, Real Time PCR and BIO-PCR at tracer level infection by the bacteria, especially important for quarantine.
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警惕的作物需要对每一个可能的疾病从幼苗阶段收获为了成长健康的作物最高产量。众所周知,许多疾病减少利润:然而,一些导致全毁了,如果发现太迟了。因此,疾病的早期诊断是至关重要的。高质量的照片主要农作物的重要疾病建议用于生产一些说明传单和概略植物病害的植物保护咨询服务,phytopathological社会,研究中心和大学指导农民和其他人进行正确的识别和适当的管理实践。
检测细菌是植物病原菌的跟踪或植物材料,尤其是当他们发生潜伏地,不会引起症状。但标识意味着孤立,描述和命名的细菌。这是一个重要的步骤在细菌感染的诊断和分类的研究尚还未有异或可靠的简单方法识别病原体和疾病的原因。传统的识别方法是病原体的目视检查原位或在体外在纯文化通过显微镜检查染色反应,殖民地字符,氧需求,生理特征生化人物和血清学方法。识别通过噬菌体技术可以被认为是传统和现代的。传统识别方法的主要缺点是更少的特异性和更少的歧视在物种和应变水平。
近年来完全新的识别技术已经开发出来。这主要是由于分子生物学的发展,揭示微生物的结构和功能。了解微生物的组成和结构元素的地方取得了真正的指纹识别方法和特殊的血清学方法一样,蛋白质和脂肪酸分离和核酸的手指印1- - - - - -5]。
•评估症状
•隔离的致病细菌
•分离细菌的纯培养
•识别纯文化
•致病性试验
•Reisolation从接种植物
•Reidentification的分离
•诊断报告
标识隔离手段,描述和命名的细菌。这是一个重要的步骤在细菌感染的诊断和分类研究。
•该疾病、宿主范围和症状:
•细菌细胞的形态:形状和鞭毛的特点
•殖民地特点:形式、颜色和气味的殖民地
•染色反应:革兰氏染色剂,抗酸染色、特殊污渍等。
•琼脂斜面或肉汤培养:——经济增长的质量和类型,其表面结构和特性。
•氧要求:好氧、厌氧和兼性好氧。
•生理特点:-荧光颜料,对抗生素的敏感性和毒素的生产。
•生化特征:发酵的碳、纤维素、果胶、脂肪和淀粉水解、氨生产硫化氢吲哚等,pH值的变化,凝固和生产的气体。
•血清学特点:降水试验,凝集、免疫荧光和ELISA。
•噬菌体:——太具体和应变水平识别可能因此被认为是传统和现代的识别方法和方法被称为噬菌体斑块技术。
现代的识别方法主要是由于分子生物学的发展,揭示微生物的结构和功能。知识的组成和结构元素的地方在微生物可能真正的指纹识别方法如:
1。特殊的血清学技术,最终与他人相结合:
•Immuno-electrophoresis
•单克隆抗体(单一的抗体)
•摘要标签。
2。使用色谱分离的细菌组件:
•氨基酸和细胞壁碳水化合物(纸色谱法、薄层色谱)
•脂肪酸、脂肪(气相色谱)。
3所示。在电场分离细菌的蛋白质:
•SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - page)
4所示。基于核酸识别(基于核酸的手指印)
•南部和北部杂交或DNA / RNA(点/ slot-blot杂交)
•荧光原位杂交(鱼)使用rRNA rDNA寡核苷酸探针。
•限制片段长度多态性(RFLP)分析。
•脉冲场凝胶电泳(但是脉冲场凝胶电泳的出现)。
•聚合酶链反应(PCR) - RFLP。
•随机扩增多态性DNA (RAPD)分析。
•基于重复序列的手指印PCR (REP-PCR)。
•扩增片段长度多态性(妊娠)分析。
•实时PCR。
•BIO-PCR。
•微阵列。
)Immuno-electrophoresis:——方法基于电泳的分离和鉴定的蛋白质和抗体反应。
b)单克隆抗体(单一的抗体):单克隆抗体特定的组件(如蛋白质或多糖)的细菌。乔治·科勒,塞萨尔Milstein和尼尔斯Kaj Jerne(1975)谁分享了1984年诺贝尔生理学和医学奖的发现生产单克隆抗体的杂交瘤细胞的技术。
单克隆抗体生产;第一次注射抗原在鼠标/兔子。这将产生抗体抗原。孤立的特定抗体生产B淋巴细胞与肿瘤细胞杂交(骨髓瘤细胞)。这个过程被称为杂种细胞的技术。屏幕的杂种细胞生产所需的抗体。克隆这个杂种瘤细胞在体外或在活的有机体内。
标签然后c)摘要标签:电镜下观察里和泰勒在1971年首次使用识别沙门氏菌抗原。主要用于电子显微镜。黄金标签意味着抗体胶体金颗粒附着在二级依次连接的设计主要抗体与特定蛋白或其他细胞组件。然后对电子显微镜下观察。
在这个技术的总脂肪酸的细菌进行了比较。细菌含有脂质浓度为0.2 - 50%的干重,通常5%,主要在细胞膜。的脂质重要技术是包含酯化脂肪酸,如
•磷脂,存在于细胞膜
•脂质在革兰氏阴性细菌脂多糖。
•β- polyhydroxybutyrate。
沸腾的细菌细胞溶解脂肪皂化释放脂肪酸,脂肪酸甲基化,使它们更容易挥发并提取后气相色谱法可以比较获得的概要文件(匹配)和大量的参考资料出现在数据库(库)
连接电脑。计算机识别脂肪酸,确定偏离参考脂肪酸,确定偏离参考脂肪酸混合物和细菌的鉴定和相似的百分比。
•移动阶段(或“移动阶段”)是一个载气,通常是一种惰性气体,如氦或氮。
•固定相是一个微观层液体或在惰性固体聚合物的支持,在一块玻璃或金属油管称为列。
•测试菌落应该48 - 72小时老纯培养。
•数据银行——包括图书馆的有氧、无氧临床细菌,Actinomyctes,分枝杆菌,是可用的。酵母。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE):——页面通常总蛋白的细菌进行了比较。约不同的蛋白质类可以是可见的。要提取的蛋白质首先和变性洗涤剂(钠十二烷基硫酸盐,SDS)和巯基乙醇。蛋白质失去3 -维结构和带负电荷。随后混合物变性,带负电荷的蛋白质被加载在多孔聚丙烯酰胺凝胶在电场。蛋白质会迁移到正极,较小的迁移速度比更大的。凝胶(更少的阻力。分离蛋白质染色和后蛋白质乐队可以比较。比较是视觉或以计算机为基础的分析。
南部和北部杂交或DNA / RNA(点/ slot-blot杂交)
印迹是一种方法经常用于分子生物学检测特定DNA序列的DNA样本。南方印迹转移electrophoresis-separated DNA片段结合过滤膜和随后的片段的检测探针杂交。方法是其发明者的名字命名的,英国生物学家埃德温南部。
Northern涉及使用RNA电泳分离样品的大小,和检测杂交探针互补的一部分或整个目标序列。“北方污点”一词实际上是专门从电泳凝胶毛细管转移RNA印迹膜,但是整个过程通常被称为北方的印迹。北方污点技术是1977年由詹姆斯Alwine开发的,大卫·坎普,斯坦福大学和乔治·斯塔克。
其他印迹方法(即。、免疫印迹、污点东部,西南部污点);
免疫印迹(或者,蛋白免疫印迹)是一种广泛使用的分析技术用于检测特定蛋白质在给定的示例(页面)。
东部印迹是一种生化技术用于分析蛋白质后转译修饰(天车)脂质和glycoconjugates等。它通常是用来检测碳水化合物抗原表位。
西南印迹是一种实验室技术包括识别和描述DNA结合蛋白质(蛋白质结合DNA) [2通过绑定到特定的寡核苷酸探针的能力。通过凝胶电泳分离的蛋白质,随后转移到硝化纤维膜类似于其他类型的印迹。
在这种方法短(20-30mers)寡核苷酸探针对16 s或23 s r RNA / DNA。修复植物提取物/ ti细胞微观滑动。对革兰氏阳性细菌溶菌酶一步的某个时候(酶分解peptidogycan)有必要加强渗透探测器的细胞。探测器将与互补序列杂交。当探针标记荧光染料的微生物可以通过入射光可视化荧光显微镜。
基因组DNA与限制性内切酶消化和碎片解决通过琼脂糖凝胶电泳凝胶。分离片段转移到尼龙或硝基南部印迹膜。然后,杂化膜结合核酸标记核酸探针同源的基因组区域的生物研究。可以使用的探针multicopy或单一或低拷贝。
•多份调查常用的包括rRNA操纵子的过程叫做ribotyping.eg;研究了x定和p两pathovars。
•低拷贝数探针用于评估R solanacearum的遗传多样性。
PCR技术用于检测特定的段的存在或核酸序列,可诊断为传染性病原体如细菌。的技术是基于对数放大特定的核酸片段,这样即使一分钟微量的某种病原体可以成为检测。
选择引物:——短段核酸通常20 - 30个核苷酸长度。的引物„„启动聚合过程。
b。从测试样品提取的DNA:酚提取。
c。变性的DNA:引物总是附着在ssDNA这样dsDNA生产ssDNA互相分裂。这个由加热材料90 - 95度的过程称为变性。
d。引物的退火:附件引物的特定区域的温度发生37-50度(avg: 45度C)。
e。聚合:伸长发生的酶称为聚合酶(它是来自一种叫水生栖热菌的生物archea可以由此得名),所以这个过程发生在高温、72度C。
f。放大:循环重复的次数,每个周期导致对数放大DNA的数量增加。
g。目标DNA序列的检测:
聚合酶链反应(PCR rflp)
基因位点的细菌放大与特定的寡核苷酸引物和放大产品受到RFLP分析;不同分子量的碎片产生由凝胶电泳鉴定。
例如;欧文氏菌spp。,两页,用于phytoplasma的分类学研究。
基因组DNA指纹识别方法,雇佣了罕见的减少限制内切酶消化细菌的基因组DNA,然后经过电泳使用专门的大片段DNA的分离条件。
例如;用于流行病学研究欧文氏菌amylovora。
RAPD分析是基于使用短的随机序列引物一般长度的10个基点,而杂交条件的基因组DNA低紧缩和发起随机的基因组区域的放大。然后放大产品解决琼脂糖凝胶。
如研究x定的情况下,x oryzae和r . solanacearum。
Rep-PCR正迅速成为使用最广泛的方法,细菌的遗传多样性评估(识别),特别是植物病原菌。这种基因指纹技术采用引物半推半就杂交重复元素(埃里克,代表和盒子)的基因组内细菌和放大了干预这些元素之间的区域。这些重复的元素可能发挥重要作用在细菌基因组的组织。
如研究x oryzae pv oryzae。
基因组DNA的妊娠技术涉及到限制使用两种限制性内切酶是通过为每个限制性内切核酸酶结扎双链适配器的具体使用,然后使用引物扩增特定适配器。使用的引物扩增包含额外(适配器序列)年底3„核苷酸引物,因此他们放大细菌基因组的一个子集。
例如用来评估遗传多样性的胡萝卜和大肠chrysanthemi。
它是一个量化过程,这有助于探测、PCR产物积累在PCR反应。实时定量PCR仪(Taqman R)用于PCR产物积累不断7900 ABI棱镜的措施使用双重标记fluorogenic寡核苷酸探针称为Taqman探针。这个探针标记有两种不同的荧光染料5染料和3„„终点站记者末端淬火染料。
•量化是可能的。
•不需要运行在琼脂糖凝胶。
•有助于检测PCR反应期间积累连接到电脑。
BIO-PCR方法可以结合使用隔离的媒体,在可行的目标细菌的细胞可以在液体或固体丰富媒体和检测到极低水平的种子和其他繁殖的材料。
BIO-PCR试验,植物提取物镀到琼脂或添加液体媒体和丰富了15 - 72小时,根据生物,以及由此产生的细胞生长用于直接PCR不需要DNA提取细菌由于细胞溶解在最初的变性一步放大。BIO-PCR协议开发几个细菌包括丁香p。phaseolicola, Cavibacter michigensis无性系种群。sepedonicus, r . solanacearum Acidovorax avenae无性系种群。avenae.etc
微阵列是一种多路复用芯片实验室。这是一个二维数组在固体基质(通常是一个玻璃幻灯片或硅薄膜电池),分析大量的生物材料使用高通量筛选方法。微阵列的类型包括:
•DNA微阵列,如互补脱氧核糖核酸微阵列、寡核苷酸微阵列和SNP芯片
•MMChips, microRNA种群的监测
•蛋白质微阵列
•组织微阵列
•细胞微阵列(也称为转染微阵列)
•化合物微阵列
•抗体微阵列
•碳水化合物阵列(glycoarrays)
DNA微阵列是一种多路复用技术用于分子生物学。它由一系列排列的成千上万的微小的斑点的DNA寡核苷酸,称为功能,每个都包含皮摩尔(10−12摩尔)的一个特定的DNA序列,称为探针(或记者)。这些可以一小部分基因DNA或其它元素用于杂交cDNA或cRNA样本high-stringency条件下(称为目标)。Probe-target杂交检测和量化通常是通过检测荧光团,银,或chemiluminescence-labeled目标确定在目标核酸序列的相对丰度。因为数组可以包含数以万计的探头,一个微阵列实验可以完成许多并行基因测试。因此数组极大地加速许多类型的调查。
•快速、敏感,具有成本效益的。
•集成认证和检验。
•商用标准化工具包。
•非可耕种的phytoplasma可以分析。
•不敏感突变和变异。
•歧视分类水平即菌株水平较低。
•灵敏度和重现性未知。
•实验误差和抽样误差。
•不可能歧视可行的和非可行的细胞。
•假阴性和假阳性难以验证。
•改变探针/引物酶/方法/化学品/可能产生不同的。
•贵。
有时建议被遗传的分子方法,更高,比传统方法,表型。但是没有这样的矛盾经过净化细菌和隔离他们的核酸,这些核酸不再功能。他们在凝胶固定化,切成碎片。等和他们的纯粹的表型分析。生物体能够开关基因和在实验室里,他们似乎是相似的,他们的行为完全不同的领域。所以综合方法识别即给良好的传统方法和现代方法和准确的结果。
