研究与评论:微生物学与雷竞技苹果下载生物技术杂志
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Ji-Feng王1，杨世玲1， Qiang孟1，刘淑文1，2，3.#＊和何凌4#＊
4学院园艺西北农林科技大学，陕西咸阳杨凌712100
收到日期:13/06/2017;接受日期:25/07/2017;发表日期:31/07/2017
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本研究的目的是对影响葡萄酒芳香特性的β-糖苷酶(BGL)和磷酸-β-糖苷酶(PBGL)进行表征。六个Oenococcus oeni对菌株进行酶活性测定p-硝基苯-β- d -吡喃葡萄糖苷(pNPG)法。的序列BGL和PBGL采用生物信息学技术对基因进行分析，采用实时定量逆转录聚合酶链反应技术(qRT-PCR)对基因进行验证。葡萄酒相关β-糖苷酶的遗传密码o . oeni并与其他菌株进行比较分析。人们发现o . oeni其中CS-1b活性最高。从完整培养菌株获得的上清液中酶活性较低，而在被破坏的细胞溶液中酶活性较高。说明糖苷酶可能主要以胞内或胞内形式存在。GC-MS结果表明，基因表达水平较高的菌株CS-1b和SD-1f可以产生更多种类的芳香，其中一些与β-葡萄糖苷酶相关的芳香明显增加。
Oenococcus oeni;糖苷酶;中存在;味道;酒
葡萄酒的香气是影响葡萄酒品质的最重要的感官因素之一。1，2]。在酿酒中，二次发酵，即苹果酸-乳酸发酵(MLF)发生在酒精后发酵主要由乳酸菌(LAB)进行，尤其是o . oeni(3.-6]。o . oeni是一种理想的主导MLF过程的生物，因为它具有很高的耐应力性，并且对葡萄酒香气的复杂性有显著的积极影响[7-9]。因此，它已被广泛应用于葡萄酒生产的商业发酵剂[10，11]。
一些葡萄酒中香气物质的前体大多在葡萄皮中糖基化后，才被相应的糖苷酶或酸释放出来[2，12，13]。换句话说，这些芳香化合物可以通过酸性或酶水解为葡萄酒提供更复杂的感官特征[14，15]。然而，在工业规模上，可以通过增加β-糖苷酶的反应来优化上述两种水解方法，以获得良好的性能真菌起源(16]没有副作用或副作用，导致葡萄酒中花青素的损失[17]。令人担忧的是，如果酸水解没有得到很好的控制，苷元结构似乎会重新排列，形成不理想的风味[14，18]。糖苷酶，特别是β- d -糖葡萄糖苷酶，是无臭糖苷香气前体的糖苷键的裂解酶，具有很高的特异性和效率。因此，它们通常被认为是释放葡萄酒香气的合适工具。19-21]。而葡萄内源β-葡萄糖苷酶或商业真菌β-葡萄糖苷酶在很大程度上受到低糖、高酸度、乙醇浓度等发酵物理化学环境的抑制。β-葡萄糖苷酶主要来源于与葡萄酒有关的乳酸菌(LAB)o . oeni，在MLF过程中有助于香气前体的水解[22-25]。
尽管大量发表的研究已经证实了BGL年代从o . oeni菌株可以提高葡萄酒的风味、口感甚至最终品质[13，14]，本研究试图在DNA水平上通过表达揭示发现的机制BGL和PBGL基因在o . oeni菌株。通过qRT-PCR技术研究了菌株种类与β-糖苷酶在细胞中的位置之间的关系，揭示了糖苷酶活性及其表达水平的可能参与。本研究的结果将有助于充分理解葡萄糖苷酶在MLF过程中的作用，并有助于探索葡萄糖苷酶在MLF中的应用潜力o . oeni在酿酒。
细菌分离物及培养条件
六个中的五个o . oeni本研究中使用的菌株(c-1b, NM-2c)来自我们的实验室收藏(西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌)，源自中国种植的不同葡萄园或葡萄品种。o . oeni31 dh (o . oeniCICC 6066)是由Su等人描述的中国工业文化收藏中心(CICC)提供的一个商业品系。所有菌株在含有10 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母膏、0.5 g/L半胱氨酸/HC1、0.2 g/L MgSO的酸性番茄肉汤(ATB)中活化4•7 h2O, 0.05 g/L MnSO4•4 h2O中加入250 mL/L番茄汁，最终培养基pH值为4.8。培养温度调整为25ºC。通过测量600 nm光密度值(OD600)监测所有菌株的细胞生长情况。在指数生长期，以5000 g在4ºC下离心10 min收集细胞，OD600值约为1.00。
板筛选
在琼脂板上筛选出β-糖苷酶活性高的菌株。除了添加1 g/L琼脂粉和5 g/L熊果苷(β-葡萄糖苷的模拟底物)外，这些琼脂板的组成与ATB肉汤相似。121ºC灭菌20 min后，用ATB琼脂培养基制备含有0.02% (W/V)柠檬酸铁铵的特定平板，该物质在熊果苷消耗或分解时起显色试剂的作用。将上述收获的细胞接种于10 mL新鲜ATB肉汤中，随后在25°C下培养，直到OD600值约为1.00。取10 μL液体培养液滴在指示表面的琼脂平板上。最后将所有6株分离株接种于每个平板，25°C在黑暗中接种8-10天进行筛选。在指示琼脂板上，菌落周围呈深棕色圆圈的分离株表明其具有较高的β-葡萄糖苷酶活性。
目的基因的克隆、检测和分析
鉴定磷酸-β-葡萄糖苷酶(bglB)和β-葡萄糖苷酶(bgl)基因o . oeni为验证PCR扩增片段，在筛选结果的基础上筛选出4株菌株(SD-1d、SD-2gf、31-DH、NM-2c)进行PCR检测和测序。
提取基因组DNAo . oeni使用Ezup柱细菌基因组DNA纯化试剂盒(生工生物技术，中国)分离。按照厂家建议的操作说明进行提取。
设计的引物[26]进行PCR扩增bglB和bgl基因被列在表1。PCR扩增体系为:10 ×缓冲液(2.5 μL)，每个引物2.5 μM (1 μL)， 2.5 mM dNTP混合物(2 μL)， 5 U/μL ExTaq DNA聚合酶(0.2 μL)， Genomic DNA (2 μL)，以蒸馏水为终体积25 μL。这些混合物在PCR扩增装置(Bio-Rad, USA)中循环，顺序编程如下:94°C 4 min，然后94°C 1 min, 59°C 50 (bgl基因)和57°C 50 (bglB基因)，72℃1.5 min，最后在72℃延伸10 min。pcr扩增片段用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像系统(ChampGe I 5000，中国)拍照。目标片段使用SanPrep柱DNA凝胶提取试剂盒(Sangon, China)进行回收。
| 底漆 | 引物序列(5 '→3 ') | 羊痘疮 | 基因 | 长度 |
|---|---|---|---|---|
| bgl- f | GTGACTATGGTAGAGTTTCC | oeoe - 1569 | bgl | 2215个基点 |
| bgl- r | TCAAAACCCATTCCGTTCCCCA | |||
| p -bgl- f | TTGAATAAACTTTTTTTGCCGAA | oeoe - 0224 | bglB | 1443个基点 |
| p -bgl- r | TTAATCTAATTGACTGCCGTTTGA |
表1:PCR检测中使用的引物。
回收产物与pcm - t载体(Sangon, China)进行重组。然后重组体转化为大肠杆菌TOP10细胞(天根，中国)，以产生多个目标DNA副本。然后在Luria-Bertani (LB)琼脂板(含100 μg/mL氨苄西林，48 μg/mL异丙基-β- d -硫代半乳糖苷，40 μg/mL X-gal)上37ºC孵育24 h进行蓝白点筛选，4ºC培养阳性克隆并显色。白斑菌落用SanPrep Column质粒Mini-Preps Kit (Sangon, China)按照厂家要求提取质粒，限制性特异消化后，用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测阳性菌落酶太平洋标准时间我(生工，中国)。最后将阳性重组质粒送至中国生工生物技术有限公司进行DNA测序并执行。
获得的bgl和bgl将B基因序列提交到GenBank数据库，以获得其登录号，并与数据库中可用的基因序列进行同源性比对。然后，用生物信息学软件(表2)。o . oeni调心分析时以PSU-1为参考应变。
| 名字 | 工具 | 网站 | 函数 |
|---|---|---|---|
| 基因库 | BankIt | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank | 获取银行ID |
| NCBI | 子仪 | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ | 寻找开放的阅读框架 |
| blastp | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | 搜索与查询高度相似的蛋白质 | |
| 大型 | 大型6.06 | http://www.megasoftware.net/ | 多序列比对 |
| ExPASy | ProtParam | http://web.expasy.org/protparam/ | 描述蛋白质的理化参数 |
| 胺基 | http://web.expasy.org/protscale/ | 分析蛋白质亲水性或疏水性 | |
| TMpred | http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html | 跨膜区域预测 | |
| 瑞士模式 | https://swissmodel.expasy.org/ | 预测和可视化蛋白质的三维结构 | |
| ScanProsite | http://prosite.expasy.org/scanprosite/ | 扫描特定的蛋白质基序 | |
| MyHits | 图案扫描 | http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan | 检查保守域 |
| 哥伦比亚广播公司 | SignalP 4.1服务器 | http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ | 预测信号肽裂解位点的存在和位置 |
| BioGem | CFSSP服务器 | http://www.biogem.org/tool/chou-fasman/ | 二级结构预测 |
| Cell-PLoc | Gpos-PLoc | http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Gpos/ | 预测蛋白质的亚细胞定位 |
表2:分析基因及其编码产物的生物信息学技术。
表达bgl和bglB基因
的表达式bgl和bgl实时定量RT-PCR检测B基因的转录水平。这里使用的引物列在表3。
| 引物名称 | 序列(5 '→3 ') | 函数 | 长度 |
|---|---|---|---|
| RT -bgl- f | AAGTCCTGTTTCCTTTTGGTCA | β-葡糖苷酶 | 195个基点 |
| RT -bgl- r | TTAGTTCCTTCAGCGGTTTTTC | ||
| RT-pbgl- f | GACGAGGATCTTTCCCAATG | 含磷的β葡糖苷酶 | 102个基点 |
| RT-pbgl- r | GGTTCGATACCGTACTTGTG | ||
| ldhD-F | GCCGCAGTAAAGAACTTGATG | D-lactate脱氢酶 | 102个基点 |
| Idhdr | TGCCGACAACACCAACTGTTT |
表3:qRT-PCR所用引物。
通过1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测合成引物对基因组DNA扩增产物的特异性。为了提取总RNA，采集在ATB肉汤中生长的细胞作为酶活性测定的样本。根据RNAprep pure Cell/Bacteria Kit (TianGen, China)的说明进行提取。反转录也由快速定量RT试剂盒(gDNase)制造商(天根，中国)详细进行。的ldhD基因o . oeni根据以往的研究选择作为内部控制[6，27-30.]。qRT-PCR前的初步处理和准备是在SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒(TianGen, China)上进行的，如下所示:用ddH稀释反转录产物2O (RNase-free)至终浓度为100 ng/μL;反应体系含有12.5 μL 2 × SuperReal PreMix Plus缓冲液，每个引物0.6 μL (10 μM)， 1 μL cDNA (100 ng/μL)， 5.3 μL ddH2O (RNase-free)。最终qRT-PCR反应程序为表4在Bio-Rad IQ5实时PCR系统(Bio-Rad, USA)上进行。o . oeni31-DH作为参比菌株。无模板反应混合物作为对照。每个试验重复三次。
| o . oeni应变 | 平均酶活性 |
|---|---|
| CS-1b | 7.20±0.22一个 |
| SD-1f | 6.43±0.30B |
| 31-DH | 6.12±0.21B |
| NM-2c | 4.66±0.32C |
| SD-1d | 4.27±0.15CD |
| SD-2gf | 3.89±0.10D |
表4:β-糖苷酶活性o . oeni*不同字母在不同菌株间有显著差异(但各P≤0.01)。
核苷酸序列接入号
的核苷酸序列bgl基因o . oeniSD-1d、SD-2gf、31-DH、NM-2chad存入Gen Bank数据库，登录号分别为KM435262、KM435263、KM435264、KM435265。,对于bgl同一株B基因分别添加编号为KM435258、KM435259、KM435260、KM435261。基因组DNA中关于两种基因的信息o . oeniPSU-1显示为编号CP000411。
ATB条件下β-糖苷酶活性测定
根据Barbagallo等人描述的方案进行糖苷酶活性的测量，并进行了微小的修改。将6株菌株在ATB肉汤中培养，研究其在葡萄酒工业中的实际应用潜力。通过测量OD600值监测分离株的生长，直到指数期(OD600≈1.5)o . oeniSD-1d, 52 h foro . oeniSD-2gf, 58 h foro . oeni31-DH和65 h为o . oeniNM-2c)。全部细胞立即从1 mL细菌培养物中通过离心(5000 × g, 4ºC, 10分钟)获得，用0.85% NaCl洗涤2次，然后悬浮在0.5 mL 0.85% NaCl溶液中，然后与等体积的2 ×柠檬酸磷酸盐/混合pNPG溶液(pH 5.0，含5mmpNPG)。该反应在37ºC下维持1小时，加入2 mL 1M Na结束2有限公司3.。每个样品离心15分钟(5000 x g, 4ºC)后，将200 μL上清液转移到96孔板上的孔中，使用Multiskan光谱仪(Spectra Max 190, USA)在400 nm处测量每个吸光度。以不含细胞的0.85% NaCl溶液为对照。这种活性被定义为微摩尔p每分钟产生的NPp单位细胞质量NPG， μmol•(g•min)1。
用GC-MS评价β-糖苷酶活性对葡萄酒香气的影响
从6株菌株中筛选出两株活性最强的CS-1b和SD-1fo . oeni以商品菌株31-DH为对照。赤霞珠葡萄酒被用来进行酒精发酵按照Wine Technology的要求，将酒罐装满并密封，保存在4ºC。
酒精发酵后，每瓶取40 mL在ATB培养基上生长，达到对数相(OD600≈1.5)。然后将培养物离心(5000 g, 4ºC, 15 min)，用0.85%的无菌NaCl洗涤。然后，将酒中的上清液(加入60mg /L SO2未接种的作为对照。实验被重复了。将密封的瓶子放置在22ºC，每24小时检测一次苹果酸，直到检测不到为止。
用0.45 μm膜过滤10ml MLF酒样品。滤液加入20ml瓶中，加入2 g NaCl、50 μL (0.234 g/L) 2-辛醇内标混合。采用SBSE搅拌棒进行气相色谱提取。
气相色谱条件为DB-MAX × 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm色谱柱，He为载气，流速为1 mL/min。柱温程序在40ºC保持3min，以4ºC/min的速率加热至160ºC，以7ºC/min的速率加热至230ºC 8 min，进样解吸速率为45 mL/min，温度为245ºC。质谱扫描范围为45 ~ 450 amu，离子源温度230ºC，电子电压70eV
数据处理与分析
使用NIST02地图库进行检索，进行识别和定量。待测成分含量的计算公式为:各组分浓度(mg/L)=各组分峰面积*内标浓度(mg/L)*f/内标峰面积表示各组分的内部校准因子。
板筛选
每个菌株菌落周围形成一个深棕色的圆圈，能够合成β-糖苷酶并具有酶活性。如在图1，所有被检测的菌株在菌落周围都清晰地显示出不同程度的棕色圆圈。经PCR检测，β-糖苷酶基因(bgl)和磷酸-β-糖苷酶(bglB)从6个菌株中的4个中鉴定出来o . oeni以便进行下一个实验。
图1:1 - 6表示o . oeniSD-1d, SD-1f, SD-2gf, CS-1b, 31-DH和NM-2c。
目的基因的克隆、检测和分析
单次PCR产物2215 bp (bgl)及1443 bp (bglB)，这是观察到所有o . oeni经PCR扩增成功。两个靶基因经琼脂糖凝胶电泳验证(图2)。在核苷酸序列方面，MEGA 6.06比对结果显示，5株菌株的核苷酸序列一致性为99.9%bgl(没有显示)。至于bglB,o . oeniNM-2c与o . oeni其余3株与参比株的同源性为97.8%。然而，与参考菌株相比，BGL蛋白和PBGL蛋白的序列相似性上升到99%。因此，商业紧张o . oeni以31-DH为例进行进一步研究生物信息学预测研究BGL和PBGL。
图2:M: DNA标记DL 5000;1-4:分别基于O. oeni SD-1d、SD-2gf、31-DH和NM-2c基因组DNA的PCR产物。
根据ProtScale在线分析，这两种酶的疏水性都较弱，PBGL和BGL的疏水性得分分别为-2.94 ~ 1.90和-3.37 ~ 2.00o . oeni分别为31-DH(未显示)。SignalP 4.1 Server和TMpred提示这两种蛋白中均不存在信号肽切割位点和膜跨区(图中未显示)。PBGL表达的BLAST蛋白o . oeni31-DH可能包含保守结构域bglB(显示为双向麻雀在图3一)负责碳水化合物的运输和代谢，并可能包含其他结构域，如ecela, BGL, PLN02814和糖基水解酶家族1(图3 b)结果显示，该蛋白可能存在一个由多个氨基酸(aa)组成的结构域-纤连蛋白iii型样结构域(预测未知)，可能是糖基水解酶家族3的n端结构域和糖基水解酶家族3的c端结构域(参与催化作用，可能与β -葡聚糖结合)，分别位于蛋白的577 - 647 aa、33 - 280 aa和313 - 546 aa。此外，通过ScanProsite预测，PBGL中存在一个特定的糖基水解酶家族3的n端识别区(10-24 aa, FLWGGAVAANQLEGG)和一个催化活性位点(373-381aa, LFIVENGLG)。BGL仅观察到一个催化活性位点(214-231aa, ILREEWGFKGLVMSDWGT)。根据在线亚细胞定位预测，两种蛋白均可能分布在细胞质中。
图3:分别用blast扫描和motif扫描检查PBGL (a)和BGL (b)的保守域。
表达bgl和bglB基因
采用qRT-PCR技术研究β-糖苷酶活性与两种不同基因表达水平的关系(图4)。6种不同糖苷酶基因的相对表达量o . oeni应变显示在图5。表达水平bglB略高于的bgl同样的菌株。这两个bglB和bgl在不同菌株中表达不同，相对值为1.8。的o . oenisd -1f的表达活性最高bglB在菌株中，接着是o . oeniCS-1b，显示相对值为1.5。的表达水平bgl，其他5个相对值均低于1的菌株表现较差o . oeni31-DH
图4:同一葡萄糖苷酶基因在不同葡萄糖苷菌株中的相对表达量，*Capitals表示在1%水平上存在显著差异。
图5:qRT-PCR引物扩增特异性。M: D2000 DNA梯子;1-3: O. oeni SD-1f中的ldhD、OEOE-0224、OEOE-1569基因。
ATB条件下β-糖苷酶活性测定
在ATB培养基中测定所有被试菌株的ß-葡萄糖苷酶活性(表4)。其中,o . oeniCS-1b和SD-1f的酶活性最高可达7.20 μmol•(g•min)。16.43 μmol•(g•min)1,分别。此外，不同菌株间存在显著差异。
| 酒精 % (v / v) |
还原糖(g/L) | 总酸(以酒石酸为单位，g/L) | 挥发性酸(g/L) | pH值 | 所以总2(毫克/升) | 所以自由2(毫克/升) | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 12.98 | 3.76 | 6.09 | 0.20 | 3.30 | 19.20 | 12.80 | |
表5:研究了酒样经AF处理后的理化性质。
实验葡萄酒理化性质的测定
实验酒在酒精发酵后的物理化学性质如下表5所示。
GC-MS鉴定及结果分析
从GC-MS的结果我们发现o . oeniSD-1f和CS-1b具有较高的酶活性和较高的基因表达，可产生较高水平的香气。一些高产量的香气可以看到表6这是高水平基因和基因表达的结果。
| 保留时间 | 化合物名称 | 分子式 | 浓度(毫克/升) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 控制 | CS-1b | 31-DH | SD-1f | |||
| 7.75 | 3-Methoxybutyl醋酸 | C7H14O2 | 0.504 | 1.177 | 0 | 5.705 |
| 10.74 | 己酸乙酯 | C8H16O2 | 0.367 | 1.326 | 0.009 | 0.395 |
| 15.99 | 辛酸乙酯 | C10H20.O2 | 0.058 | 0.551 | 0 | 0.041 |
| 34.64 | 酞酸二丁酯 | C16H22O4 | 0.15 | 0.398 | 0 | 0.104 |
| 33.82 | 3,4 -二甲氧基苯乙酸 | C10H12O4 | 0 | 0.009 | 0 | 0.025 |
| 13.99 | 己醇 | C6H14O | 0 | 0.682 | 0 | 0.251 |
| 25.33 | 苯乙醇 | C8H10O | 1.599 | 5.978 | 0.853 | 2.582 |
| 24.37 | 橙花醇 | C10H18O | 0 | 0.051 | 0 | 0.022 |
表6:CS-1b和SD-1f的高产香气。
比较各种化合物的结构特征与NIST谱库标准化合物的地图,我们发现控制没有MLF 31香气总含量为12.391 mg / L:样品与MLF CS-1b有45个香气总含量为14.088 mg / L:样品与MLF 31-DH已经33香气总含量为17.847 mg / L:样本由SD-1f MLF 32香气的总含量为16.289 mg / L(日期没有显示)。苹果、香蕉、菠萝、葡萄、白兰地和玫瑰等香气物质对葡萄酒香气品质的贡献较大。结果表明，3-甲氧基乙酸丁酯的含量达到5.705 mg/L，这可能与高水平的农药含量有关基因表达。总体而言，CS-1b生产的葡萄酒酯类种类最多，辛酸乙酯含量较高，具有白兰地的香气和苹果、葡萄的己酸乙酯[31]。苯乙醇具有甜玫瑰的香味，CS-1b处理组苯乙醇含量可达5.978 mg/L。橙花有玫瑰的味道，橙花也有新鲜柠檬和柑橘的味道，比香叶醇更温和。
挥发性香气化合物对葡萄酒的感官品质非常重要。32]。然而，一些香气物质是自由状态，而不是键合状态，通常不会挥发，消费者无法直接感知。然而，它们可以被释放为芳香化合物后，一些新陈代谢方法，如酶法水解微生物在MLF期间[33]。因此，对葡萄酒行业来说，分离和鉴定与葡萄酒有关的微生物，以提高葡萄酒的最终质量，是一个很好的做法。
在这项研究中，六o . oeni分别对编码的BGL和PBGL进行描述bgl和bglB基因来预测其可能的结构和功能特征。ATB条件下的酶活性测定表明，β-糖苷酶活性较高与特定菌株有关。先前的研究也表明β-葡萄糖苷酶活性谱具有高度的菌株依赖性[9，20.，34]。本研究结果表明，β-糖苷酶活性在不同菌株的细胞中表现出明显的差异o . oeni有高度的菌株特异性或不同的来源，如。PBGL和BGL。尽管一些研究报道细胞外活动o . oeni观察到[6，22]，尚未发现编码细胞外β-葡萄糖苷酶的基因。与之前的预测一致(见3.2节)，我们的结果有趣地揭示了bgl在单个菌株中与细胞破坏上清中葡萄糖苷酶活性高度相关。在上清液中检测到的酶活性取决于酶的表达水平bgl在o . oeni。此外，很明显，秩序bglB基因表达水平与相应完整细胞和球团酶活性水平顺序一致。在完整细胞和球团中检测到的酶活性可能与酶的表达水平有关bglB基因o . oeni。此前，许多研究提出，磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷转移酶系统(PEP-PTS)的存在可以揭示完整LAB细胞的糖苷活性[35]。PTS将底物(如β-葡萄糖苷)通过质膜转移到细胞内，然后以PEP为代价进行磷酸化，最后被细胞内磷酸-β-葡萄糖苷酶消耗[35-37]。因此，可以解释为糖苷活性完整o . oeni细胞主要由磷酸-β-葡萄糖苷酶活性贡献，如在颗粒中观察到的活性。此外，未磷酸化的pNP-β- d -葡萄糖苷不能被磷酸-β-葡萄糖苷酶水解[36]，这与之前从其近亲同源物如6-磷酸-β-葡萄糖苷酶中对其三维结构的研究一致Lactococcus lactis这是从乳酸菌杆菌的，其中含有磷酸分子的磷酸结合位点[38，39]。幸运的是，在我们的研究中，来自31-DH的PBGL与来自6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的同源性为31%Lactococcus lactis(PDB代码1PBG)，与6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(PDB代码3QOM)相比，甚至达到63%乳杆菌(数据未显示)。根据CS-1b、SD-1f和31-DH在结构和功能上的保守性，可以推测，这三株菌株可能具有与BGL相同的水解不同寡糖的潜力乳杆菌第748t条[40]。GC-MS结果表明，葡萄酒主要挥发性香气包括酯类、酸类、醇类、萜类、酮类和酚类。MLF增强葡萄酒香气的顺序为:CS-1b(45种)>SD-1f(34种)>31-DH(32种)。的水平相对较高bglB和bgl基因导致β-葡萄糖苷酶相对高表达;菌株CS-1b和SD-1f发酵剂对酒香的贡献显著，且对酒香的增强与其他研究相似[41-43]。本研究的发现可以引导更好的实际应用o . oeni葡萄酒行业的压力。
本工作得到宁夏回族自治区科技重大计划项目(2016BZ0603)、国家重点研发计划项目(2016YFD0400504)和中国科技农业研究体系(CARS-30-jp-3)的资助。我们也非常感谢李亚辉为qRT-PCR引物设计提供的技术支持。
