黑芸苔A类水溶性叶绿素结合蛋白的克隆及功能表达

Mayuko小野¹高桥重和²柴田丽沙¹富泽Mizuki Tomizawa¹中山胜美¹还有佐藤博之^1*

¹东宝大学生物分子科学系，日本千叶船桥274-8510

²东洋大学生命科学学院，日本群马市立仓374-0193

通讯作者:: Satoh欲之
东宝大学生物分子科学系理学院，宫山2-2-1，日本千叶船桥274-8510
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收到日期:27/04/2016;接受日期:25/05/2016;发表日期:27/05/2016

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摘要

在一些十字花科植物中发现了不可光转化的水溶性叶绿素结合蛋白(WSCPs)。虽然黑芥菜(Brassica nigra)中的WSCP是Murata和Murata报道的第二个II类WSCP，但其cDNA至今尚未克隆。本研究克隆了黑芥菜WSCP (BmWSCP)的cDNA，并利用其重组表达的蛋白分析了其叶绿素结合亲和力。序列分析表明，BmWSCP cDNA成熟区全长534 bp，编码178个氨基酸残基的蛋白。重组BmWSCP在大肠杆菌中以六组氨酸融合蛋白的形式表达，并能成功与叶绿素结合，其与Chl a的亲和力最高，证实该cDNA在黑芥菜中编码了IIA类WSCP。

关键字

黑芥菜，黑芸苔，IIA类WSCP，叶绿素重组，水溶性叶绿素结合蛋白

介绍

几乎所有与光合作用相关的叶绿素(Chl)结合蛋白都具有疏水性，并嵌入叶绿体的类囊体膜中。相比之下，一些芸苔科植物，如甘蓝，黑曲霉，黑曲霉， Raphanus sativus和Lepidium具有非常具有水溶性氯结合蛋白(WSCP)，其吸收光谱不随光照射而改变(第II类WSCP) [1，2]。这些II类wscp进一步分为两个亚类:IIA类wscp对Chl a具有较高的亲和力，IIB类wscp对Chl b具有较高的亲和力[2]。II类WSCPs的生理功能被认为是在受损细胞中清除Chl [3.，4]。

虽然在黑芥菜中存在IIA类WSCP (BmWSCP)在WSCP研究的历史中很早就有报道[1]，它的分子克隆直到现在才进行。在本研究中，我们克隆了一个编码BmWSCP的cDNA，并在大肠杆菌。利用菠菜叶制备的类囊体膜对Chl进行了重构实验。

BmWSCP的分子克隆

在cDNA克隆方面，我们首先对已知的IIA类wscp的氨基酸序列进行比对，发现信号肽区的LLLAAAVCT和c端区的GLRMFPFY高度保守[5]。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，利用黑螺旋藻茎中分离的RNA和从上述保守氨基酸序列中推导出的退化寡核苷酸引物:5'-TCTCCTKTTKGCTGCARCTRTYTGCACC-3'和5'-CTAGTAGAATGGGAACATCCTYAGACC-3'扩增BmWSCP cDNA。将扩增片段克隆到pGEM T-easy质粒载体(Promega)中，测定其核苷酸序列。II类wscp含有信号和c端裂解肽[5]。我们利用引物5′-CATATGAAAGAAGAGGTGAAGGACTCCAAC-3′和5′- ctcgagagcatcatcaaccttcacg -3′，通过PCR方法切除BmWSCP cDNA的成熟区，并将该片段克隆到pET-24a(+) (Novagen)中表达大肠杆菌。

与其他ⅱ类wscp的序列相似性分析表明，该菌株的成熟区BmWSCPcDNA全长534 bp，编码178个氨基酸残基的蛋白。成熟区的核苷酸序列BmWSCPcDNA显示在图1。该序列保存在DDBJ中，登录号为LC148656。所得BmWSCP蛋白序列与花椰菜(IIA类)WSCP的序列同源性为89%，而与辣椒杂草(IIB类)WSCP的序列同源性为89%。Lepidium具有非常)提供的身份只有44%。

图1:BmWSCP成熟形式的核苷酸和推断的氨基酸序列。

重组BmWSCP蛋白的表达与纯化

的重组BmWSCP(recBmWSCP)表示为大肠杆菌菌株bl21 -密码子+和细胞超声处理，离心分离成可溶性和不溶性两部分。图2图中为表达rebmwscp的大肠杆菌的亚细胞分离。大部分rebmwscp分馏成不溶性组分;然而，在可溶性部分检测到重组蛋白的显著部分。因此，我们用Ni从可溶性部分纯化了recBmWSCP^2＋-螯合亲和层析(图3)根据先前报告的方法[4]。

图2:recBmWSCP在大鼠中的表达及亚细胞分离大肠杆菌。黑色箭头代表recBmWSCP。通过IPTG(+)或非诱导(−)诱导，recBmWSCP表达大肠杆菌。超声波的上清(Sup)和颗粒(Pet)馏分大肠杆菌SDS-PAGE分离。M表示含有蛋白标记的车道。

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图3:用Ni提纯rebmwscp - his^2＋亲和色谱法。Sup，色谱前上清的一部分;FT，通流分数;W，洗涤分数;E1-E4，一系列洗脱馏分。

类囊体膜中Chls重构recBmWSCP

迄今为止分析的WSCPs具有高度亲水性，可以在水溶液中去除类囊体膜上的Chl分子[3.-7]。一种从菠菜叶中纯化类囊体膜并用WSCP进行Chl重构的方法已经被报道过[3.，7]。简单地说，我们将recBmWSCP与分离的类囊体膜组分混合。离心后测定上清液的吸收光谱(图4）.光谱显示了典型的IIA类WSCP的吸收光谱，这是优先结合Chl a的WSCP的特征。重组的rebmwscp在红色波段的峰值波长为671 nm，略短于从黑芥菜植物中纯化的WSCP，为673 nm [1]。这种差异可能与底物类囊体膜的差异有关，也可能与黑芥WSCP基因的异质性有关。

图4:类囊体膜重构rebmwscp的吸收光谱。用菠菜类囊体膜(Chl a/b=3.3)在水溶液中重组RecBmWSCP。

因此，在发现WSCP的45年后b .黑质，我们克隆了cDNA并制备了其功能重组蛋白，以备将来分析。

参考文献

Murata T和Murata N.黑芸苔和紫堇的水溶性叶绿素蛋白。卡内基学院华盛顿年鉴。1971; 70:504 - 507。
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