分子克隆和功能表达类的活动花絮水从芸苔属植物——可溶性Chlorophyll-Binding蛋白质质

Mayuko小野¹,Shigekazu高桥²,Risa柴田先生¹,水木Tomizawa¹,克己中山¹和Hiroyuki Satoh^1*

¹东邦大学生物分子科学船桥,千叶市274 - 8510年,日本

²东洋大学生命科学学院Itakura、群马县374 - 0193,日本

通讯作者:: Satoh欲之
理学院、生物分子科学、东邦大学2-2-1 Miyama,船桥,千叶市274 - 8510年,日本
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收到日期:27/04/2016;接受日期:25/05/2016;发表日期:27/05/2016

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文摘

Non-photoconvertible水溶性chlorophyll-binding蛋白质,称为二级WSCPs,已确定在某些十字花科植物。虽然WSCP黑芥(芸苔属植物黑质)是第二个二类WSCP报告由日本村田公司和日本村田公司的cDNA克隆直到现在还没有。在这项研究中,我们克隆cDNA编码黑芥WSCP (BmWSCP)和分析其叶绿素亲和力使用其重组表达蛋白。序列分析显示,成熟的地区BmWSCP cDNA预测534年英国石油公司编码178个氨基酸残基的蛋白质。重组BmWSCP在大肠杆菌表达hexa-histidine融合蛋白质和叶绿素可以绑定成功,其亲和力最高的背影,确认cDNA编码类活动花絮WSCP黑芥。

关键字

黑芥菜、甘蓝黑质、类活动花絮WSCP,叶绿素调整,水溶性chlorophyll-binding蛋白质

介绍

几乎所有photosynthesis-related叶绿素(背影)结合蛋白表现出疏水性质和嵌入在叶绿体的类囊体膜。相比之下,几个十字花科植物,例如,芸苔属植物oleracea,黑质,显著、萝卜、Lepidium具有非常具有水溶性Chl-binding蛋白(WSCPs)的吸收光谱与光致辐照不改变(二类WSCP) [1,2]。这些二类WSCPs进一步分类两个子类:类活动花絮WSCPs的背影,拥有更高的亲和力和IIB类WSCPs展览的背影b(更高的亲和力2]。二类WSCPs的生理功能已被建议作为背影清除受损细胞(3,4]。

虽然存在一个类活动花絮WSCP黑芥末(BmWSCP)已报告在早期的历史WSCP研究[1),它的分子克隆没有执行直到现在。在这项研究中,我们克隆BmWSCP cDNA编码,并表示大肠杆菌。背影调整实验使用类囊体膜准备从菠菜叶。

分子克隆BmWSCP

cDNA克隆,我们首先对齐已知类的氨基酸序列活动花絮WSCPs和识别,信号肽地区LLLAAAVCT GLRMFPFY c端地区是高度保守的5]。BmWSCP cDNA是放大使用逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)使用RNA从黑质和退化的杆分离DNA寡核苷酸引物从上述保守氨基酸序列推导出:5“-TCTCCTKTTKGCTGCARCTRTYTGCACC-3”和5 -CTAGTAGAATGGGAACATCCTYAGACC-3,分别。扩增片段克隆到pGEM T-easy质粒向量(Promega)和核苷酸序列测定。二类WSCPs包含信号和c端乳沟肽(5]。我们切除的成熟地区BmWSCP cDNA通过PCR引物组,5“-CATATGAAAGAAGAGGTGAAGGACTCCAAC-3”和5‘-CTCGAGAGCATCATCATCAACCTTCACG-3’,和克隆片段pET-24a (+) (Novagen)表达式大肠杆菌。

序列相似性分析与其他二类WSCPs表明,成熟的区域BmWSCP互补脱氧核糖核酸是534年英国石油公司编码178个氨基酸残基的蛋白质。成熟的区域的核苷酸序列BmWSCP互补脱氧核糖核酸所示图1。下的序列存入DDBJ加入LC148656数量。蛋白质序列的身份推导BmWSCP和WSCP菜花(类活动花絮)是89%,而与IIB类WSCP从弗吉尼亚胡椒杂草(Lepidium具有非常)提供了一个身份的只有44%。

图1:核苷酸和推导的氨基酸序列BmWSCP成熟的形式。

BmWSCP重组蛋白质的表达和纯化

的重组BmWSCP(recBmWSCP)表示大肠杆菌用应变BL21-codon-plus和细胞,分级离心成可溶性和不溶性分数。图2显示了亚细胞分离的大肠杆菌表达recBmWSCP。大多数recBmWSCP分馏成不溶性分数;然而,很大一部分的重组蛋白检测可溶性分数。因此,我们使用Ni纯化可溶性的recBmWSCP分数^{2 +}螯合亲和色谱法(图3)根据之前报道的方法4]。

图2:recBmWSCP的表达和亚细胞分离大肠杆菌。黑色箭头表示recBmWSCP。表达recBmWSCP被IPTG诱导(+)或non-induced (−)大肠杆菌。上层清液(少量)和颗粒(Pet)用的分数大肠杆菌被sds - page分离。M表示包含蛋白质标记的车道。

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图3:净化recBmWSCP-His使用镍^{2 +}亲和色谱法。吃晚饭前上层清液色谱法的一小部分;英国《金融时报》,主要材料分数;W,洗分数;E1-E4,一系列的筛选了分数。

调整recBmWSCP的背影在类囊体膜

WSCPs分析到目前为止一直是高度亲水,可以删除的背影分子在水溶液(类囊体膜3- - - - - -7]。净化的方法从菠菜叶和类囊体膜的背影调整与WSCP前面描述的(3,7]。简单地说,我们混合与孤立的类囊体膜recBmWSCP分数。离心后,上清液的吸收光谱测定(图4)。频谱显示典型的吸收光谱类活动花絮WSCPs,特征的优先WSCP绑定到的背影。峰值波长671纳米的红色的纯化的重组recBmWSCP略短于黑芥植物,即。,673海里1]。这种差异可能是由于不同基质类囊体膜,或由于WSCP基因异质性黑芥基因组。

图4:吸收光谱与类囊体膜recBmWSCP重组。RecBmWSCP与菠菜重组类囊体膜的背影a / b(= 3.3)在水溶液中。

因此,45年后WSCP的发现b .黑质,我们克隆cDNA及其功能重组蛋白生产未来的分析。

引用

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高桥年代,et al。分子克隆、鉴定和分析的theintracellularlocalization水溶性chlorophyll-bindingprotein (WSCP)从弗吉尼亚pepperweed (Lepidiumvirginicum),一个独特的WSCP thatpreferentiallybindschlorophyll b体外。足底2013:238,1065 - 1080。
高桥年代,et al . c端extensionpeptide non-photoconvertiblewater-soluble chlorophyll-bindingproteins(二类WSCPs)affectstheirsolubility与稳定:comparativeanalyses thebiochemical和chlorophyll-bindingproperties recombinantBrassica,获得和LepidiumWSCPs orwithouttheir c端extensionpeptides。蛋白质j . 2014; 33, 75 - 84。
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