突尼斯马赫迪亚污水处理厂原始和处理废水中人类肠道病毒的分子检测

摘要

肠道病毒感染是世界各地常见的发病原因。本研究旨在评价污水处理对污水中肠道病毒的去除效果，并将同一地区同期检测到的环境菌株与临床菌株进行比较，以研究污水处理质量对公众健康的影响。采用RT-PCR法对2012年3月至2013年2月在突尼斯Mahdia污水处理厂出入境点采集的96份污水样本进行EV分析。在24份(25%)污水样本中检测到肠道病毒RNA，全年均有传播，秋季居多。在12.5%的样品中鉴定出菌株，属于埃可病毒亚型。检测到的环境菌株与在同一地区的无菌性脑膜炎患者中发现的菌株在遗传上相关，这表明水污染与无菌性脑膜炎之间存在相关性。

关键字

肠道病毒，废水，污水处理厂，无菌性脑膜炎。

简介

肠病毒(EV)是小型非包膜单链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科。它们表现出高度的遗传多样性，因此人类EV属包括100多种血清型，分为4种:人类EVA、EV- b、EV- c(包括PV型)和EV- d [1，2］．人体EV可引起广泛的疾病但非脊髓灰质炎肠道病毒(NPVE)引起的最严重的临床综合征是心肌炎、心包炎、弛缓性麻痹和脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹等中枢神经系统感染的临床表现[3.］．无菌性脑膜炎是与肠道病毒感染相关的最常见疾病，因此EV引起了全球约80%的病例[4，5]，并可能与大规模疫情有关[6］．

EV是水传播病毒，可从受污染的水经粪口途径传播[7，8］．它们在环境水中稳定而持久[9，10］．因此，废水处理被认为是允许消除这些病毒的关键步骤。然而，不同的研究表明它们存在于处理过的废水中[11，12从而污染灌溉植物、蔬菜和水果。未经适当处理的污水亦会污染食水[11]因此被认为是对公众健康的严重威胁。此外，同时对肠病毒进行环境和临床监测可能决定病毒传播的时间和地理格局[13，14]，并有助于血清型疾病的关联研究[15］．

本研究旨在揭示Mahdia地区STP中EV的发病率，并从污水和临床样本中分离出EV菌株。利用贝叶斯系统发育方法对编码VP1的病毒基因进行序列比对和系统发育分析，以确定环境循环毒株和EV暴发的时间轴。

材料与方法

样品收集

2012年3月至2013年2月，每周在Mahdia污水处理厂(STP)收集一个原始进水样本和一个处理过的污水样本。样品在+4°C保存至浓度。

样品浓度

病毒采用美国环境保护署推荐的吸附/洗脱方法从污水样本中浓缩[16]如上文所述，使用牛肉提取物及聚乙二醇(PEG) 6000 [17，18］．浓缩污水样品保存在-20°C，直到分析。

病毒基因组检测

用Chomczynski等人描述的Tri试剂试剂盒从100 μL浓缩样品中提取病毒核酸。[19］．处理后用50 μL不含rnase的水洗脱病毒RNA。采用Thermocycler (eppendorf mastercycler personal) RT-qPCR检测EV基因组。引物(表2)是由Zoll等人所描述的5 '非平移区域对齐发展而来的。[20.］．

肠道病毒基因组测序分型

对从污水中检测到的EV毒株进行基因分型，方法是对编码VP1的病毒基因和/或包含VP4和部分VP2(5 '端)编码基因的基因组段进行测序[21］．利用污水中提取的肠道病毒RNA进行VP1基因的完全扩增和(或)VP4和部分VP2编码序列的完全扩增。获得的PCR产物在ABI 3500 DX自动测序仪上进行核苷酸测序(应用生物系统公司，福斯特城，CA，美国)。通过将contig序列与GenBank中所有核苷酸序列进行比较分析来鉴定EV类型，并将每个污水样品中的病毒序列分配为具有最高身份评分的菌株的血清型[21］．获得的核苷酸序列保存在欧洲分子生物学实验室数据库登录号为LT883144-LT883146。

系统发育分析

在污水中测定的VP1序列与我们早期研究中无菌患者脑脊液标本中测定的同源EV类型一致脑膜炎［22]以及不同地理和时间来源的GenBank序列。病毒谱系的时间起源是通过在BEAST程序v1.8.4中实现的马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)过程，用贝叶斯系统发育方法估计的[23］．贝叶斯天际线模型[24]被用作树先验在一个放松分子时钟模式。MCMC分析进行了6000万代，每3000步对一棵树进行采样。生成最大分支可信度(MCC)树，并通过树节点的后验概率(pp)评估其统计支持度。在MCC树的相关节点上计算到最近共同祖先(tMRCA)的时间;统计不确定度估计为95%的最高后验密度区间。

结果

废水样品中EV的检测及分子表征

本研究采用RT-PCR法对96份污水浓缩液进行分析，其中24份(25%)检测到EV基因组。废水样品(表1)．与从Mahdia STP收集的原始和处理污水中检测到的EV相比，在入口点收集的样本中检测到的病毒污染频率更高。事实上，在入境点和出口点采集的污水样本中，分别有18份(37.5%)和6份(12.5%)被检测出EV RNA (表1)．

表1:在突尼斯马赫迪亚污水处理厂的原始和处理污水中检测到的EV阳性样本的数量和百分比。

用衣壳VP1序列对3/24废水样品进行病毒分型。因此，E-5、E-18和E-33类型分别在这三个样本中被鉴定出来，并分别在一个污水样本中被检测到。在21个样本中进行了针对EV基因组5 '区域的PCR检测(扩增完整的VP4和部分VP2编码序列)，其中针对VP1编码序列的PCR检测没有检测到任何病毒基因组序列，但没有VP4/VP2产物被扩增(表2)．

表2:肠道病毒基因组5’NCR引物用于RT-PCR检测。*根据柯萨奇病毒B3的全基因组(登录号AJ420884)。

季节性的变化

Mahdia污水处理厂进出口点收集的EV阳性样品的季节分布如图所示图1．从时间分布上看，除2月和5月外，全年均有毒株出现，秋季毒株最多(41.6%)。

原污水中EV的出现频率在秋季(38.8%)和夏季(27.7%)高于春季(22.2%)和冬季(11.1%)。此外，秋季在处理过的废水中检测到该病毒的频率最高(50%)。

污水与临床样本分离菌株的相关性

临床比较[22环境数据显示，两种样品均检出E-5和E-18菌株。污水与临床分离株VP1完整序列的系统发育比较[22]显示在图2．

2012年，在同一地区(Mahdia)收集的污水和临床样本感染了2011年底出现的相同E-5变异(pp=1) (图2一个)．该病毒与2013年在附近地区(突尼斯的Monastir)和遥远地区(法国)采样的毒株在基因上相关(tMRCA=2011.32)。

从Mahdia污水中提取的E-18序列与2012 - 2013年在突尼斯检测到的病毒变体有一个近期的共同祖先(pp=1, tMRCA=2011.66)。该谱系包括2012年在Mahdia收集的临床样本中发现的E-18菌株。

讨论

本研究表明，在25%的废水样本中检测到EV，这与其他报告的污水中检测到EV的频率为6.2至100%的研究结果一致[7，25-27］．EV在原污水(37.5%)和处理过的污水(12.5%)中均存在，证明它们对各种STP工艺具有抗性。通常的废水生物处理很难完全去除EV，特别是在Mahdia，以及突尼斯的其他地区，STP没有使用三级处理。因此，污水处理过程只能部分有效地去除病毒，而STP污水的排放可能会不断地将人类病毒释放到环境中海洋环境［17］．在环境中，肠道病毒具有使它们非常稳定的特性，它们可以抵抗，几个月后仍然具有传染性[28-30.］．EV随后成为环境水中的污染物，导致人类因使用污水污染的地表水进行娱乐、贝类养殖或饮用水生产而接触到[11］．

一般来说，在温带气候下，肠杆菌检测随季节而变化，夏秋两季出现肠杆菌感染。在本研究中，全年均在污水样本中零星检测到EV，秋季为高峰，这与之前在突尼斯进行的12年研究一致，并且EV检测呈季节变化，冬季为低传播期，3月至11月为高传播期，秋季为高峰[31］．

2011年至2013年在突尼斯沿海地区(Mahdia-Monastir)报告的一项研究证实，肠杆菌是涉及无菌性脑膜炎的一种常见病毒因子[22］．本研究在2012年至2013年在Mahdia进行的污水中检测到EV，表明临床和临床之间存在相关性环境在两项研究中发现的菌株。从而检测出E-5和E-18废水目前的研究结果与我们之前的结果一致，我们在无菌性脑膜炎患者中发现了这两种EV类型。

系统发育分析表明，环境样品和临床样品的E-5和E-18序列具有密切的亲缘关系。因此，在两种类型的样本中鉴定出每种E-5和E-18基因型的相同病毒变体。在系统发育组的相关节点上估计的tMRCA显示，每种类型的病毒变异在传播前不到一年出现。事实上，我们的研究结果表明，在研究人群中，环境菌株可能与无菌性脑膜炎直接相关。

总之，我们的研究表明，突尼斯使用的废水处理在病毒学上远远不够有效，这代表着通过水传播病毒的公共健康风险。这提示了EV在废水和人之间的运输以及水污染与无菌性脑膜炎之间的相关性。现在需要对更大样本进行进一步调查，以证实无菌性脑膜炎与环境中循环的菌株之间的关系，并了解病毒传播的机制。

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