人类肠道病毒的分子检测原料和处理废水污水处理厂的征服马赫迪耶,突尼斯

文摘

肠病毒感染是一种常见的发病原因。本研究进行了评估的有效性为肠道病毒的去除废水和污水处理比较环境株临床菌株中发现同一地区同一时期为了研究污水处理的质量对公共卫生的影响。总共有96废水样本收集从2012年3月到2013年2月在污水处理厂的入口点和出口点征服马赫迪耶,突尼斯的电动汽车用rt - pcr分析测定。Enteroviral RNA污水样品中检测出24(25%)和循环全年优势在秋天。12.5%的菌株被确定样品和属于艾柯病毒亚型。环境菌株检测相关基因的发现无菌性脑膜炎患者在同一地区,表明相关性水污染和无菌性脑膜炎。

关键字

肠病毒、废水、污水处理厂、无菌性脑膜炎。

介绍

肠道病毒(EV)小无包膜和单链RNA病毒引起,属于家庭。他们显示较高的遗传多样性,因此人类EV属包括超过100种血清型分为4种:人类的伊娃,EV-B, EV-C(包括光伏类型),和EV-D1,2]。人类的电动车可以引起广泛的疾病但最严重的临床综合症引起的nonpolio肠道病毒(NPVE)心肌炎、心包炎、弛缓性麻痹和中枢神经系统感染的临床表现,如脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹(3]。无菌性脑膜炎,是最常见的疾病与enteroviral感染有关,因此电动汽车导致全球约80%的情况下(4,5),可以与大暴发(6]。

电动车是水传播的病毒,他们可以通过粪口途径传播从受污染的水7,8]。他们是稳定和持续的在环境水域(9,10]。因此,废水治疗被认为是作为一个关键的一步,允许这些病毒的消除。然而,不同的研究证明他们的存在在处理废水11,12),因此它可以污染灌溉植物,蔬菜和水果。未经适当处理的污水也可能污染饮用水(11),因此被认为是一个严重的公共卫生风险。此外,电动汽车的环境和临床监测同时可能会确定时间和地理的病毒循环模式(13,14和帮助在血清型疾病关联研究15]。

本研究旨在揭示电动汽车的发病率STP位于马赫迪耶,并找到其中一个关系EV菌株分离污水和临床样本。序列定位和系统发育分析病毒VP1基因编码进行了使用贝叶斯系统方法确定的时间表环境循环压力和EV暴发。

材料和方法

样品收集

一周一次,一个原始入渗样本和一个处理过的污水样品收集从2012年3月到2013年2月在污水处理厂(STP)位于征服马赫迪耶。样本储存在+ 4°C,直到他们的浓度。

样品浓度

病毒集中污水样品使用吸附/洗脱方法推荐的美国环境保护署(16)使用牛肉膏和聚乙二醇(PEG) 6000(如前所述)17,18]。集中污水样本存储在-20°C到分析。

检测病毒基因组

从100年病毒核酸提取μL集中样本的三试剂盒所描述的Chomczynski et al。19]。处理后,病毒RNA在50μL RNase-free筛选了水。RT-qPCR EV基因组进行了试验检测使用Thermocycler(埃普多夫mastercycler个人)。引物(表2)从5 'untranslated发达地区联盟被海关et al。20.]。

肠病毒基因组测序类型

基因分型的电动汽车从污水是由测序菌株检测到病毒VP1基因编码和/或基因组片段组成VP4和部分VP2(5 '末端)编码基因与先前所描述的方法(21]。Enteroviral RNA从污水中提取用于完成VP1基因扩增和/或放大的完整VP4和部分VP2编码序列。PCR产品受到核苷酸测序获得的ABI 3500 DX自动测序仪(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。电动汽车类型的识别是由比较分析与所有可用的核苷酸序列重叠群序列的基因库和病毒序列在每个污水样本被分配的血清型菌株,身份最高的分数(21]。沉积在欧洲获得的核苷酸序列分子生物学加入数字LT883144-LT883146实验室数据库。

系统发育分析

VP1序列确定污水与相应的电动汽车的类型决定在我们早期的研究在无菌患者脑脊液标本脑膜炎(22)和基因库的各种地理和时间序列的起源。病毒起源的时间血统与贝叶斯估计系统通过马尔可夫链蒙特卡罗方法(密度)过程中实现野兽计划v1.8.4 [23]。贝叶斯的轮廓模型(24)是用作树下之前放松分子时钟模式。密度分析竞选6000万代,抽样一棵树每3000步。最大进化枝的可信度(MCC)树,和统计支持树节点是由他们的后验概率评估(pp)。时间最近的共同祖先(tMRCA)估计有关MCC树的节点;统计不确定性估计后验密度最高95%区间。

结果

电动汽车废水样品中检测和分子鉴定

九十六年污水集中分析在此研究中,rt - pcr分析和EV基因组中检测出24 (25%)废水样品(表1)。收集的样本中,更高频率的病毒污染的入口点是在比较中发现电动汽车检测的原始和处理过的污水收集STP征服马赫迪耶。事实上,EV RNA中检测出18(37.5%)和6(12.5%)污水样品收集在入口点和出口点,分别为(表1)。

表1:数量和比例的EV积极的样本中检测出原始和处理过的污水污水处理厂的征服马赫迪耶,突尼斯。

病毒株序列VP1衣壳的输入3/24废水样品。因此,E-5 E-18和E-33类型确定了这三个样品和检测在一个污水样品。PCR分析针对电动车基因组的5 '地区(放大的完成VP4和部分VP2编码序列)的21个样本进行PCR试验针对VP1编码序列没有发现任何病毒基因组序列,但没有VP4 / VP2产品可以被放大(表2)。

表2:肠病毒基因组5’NCR引物用于rt - pcr检测。*根据柯萨奇病毒B3(加入AJ420884)的完整基因组。

季节性的变化

EV积极的季节性分布样本收集的污水处理厂的入口点和出口点征服马赫迪耶所示图1。这个时间分布表明,菌株被发现全年除了2月和5月和他们发生在峰值在秋季(41.6%)。

电动汽车更频繁的在未经处理的污水在秋天(38.8%)比春天和夏天(27.7%)(22.2%)和冬季(11.1%)。此外,病毒是最常发现在秋季(50%)在废水处理。

菌株分离污水和临床样本之间的相关性

临床的比较(22)和环境数据显示E-5和E-18菌株被发现在两种类型的样本。完整的VP1序列的系统发育比较确定污水和临床分离株22)所示图2。

2012年,污水和临床样本收集在同一地区(征服马赫迪耶)感染同一E-5变体(pp = 1)在2011年底出现(图2一个)。这种病毒基因相关菌株采样在附近区域(拖拉,突尼斯),但还在一个遥远的地区(法国)2013年(tMRCA = 2011.32)。

E-18序列从污水在征服马赫迪耶最近共同祖先(pp = 1, tMRCA = 2011.66)检测到病毒变体在突尼斯在2012和2013之间。这个家族包括E-18应变恢复在临床样本收集在2012年征服马赫迪耶。

讨论

目前的研究表明,电动汽车被发现在25%的污水样品同意结果中描述的其他研究,报道了电动汽车在污水检测频率范围从6.2到100%7,25- - - - - -27]。电动汽车出现在原始(37.5%)和污水处理(12.5%),证明其抵抗各种STP的过程。很难实现全部切除的电动汽车常用的废水生物治疗,尤其是在征服马赫迪耶,以及其他地区在突尼斯,STP不使用三级水平的治疗。因此污水处理过程是只有部分有效地清除病毒,和STP废水的排放可能会不断释放人类病毒进入海洋环境(17]。环境中,肠病毒有属性,使他们非常稳定,他们仍然可能抵制和传染性几个月后(28- - - - - -30.]。EV随后成为污染物在环境水域导致人类接触通过使用被污染的地表水为娱乐、贝类文化,或饮用水生产(11]。

一般来说,在温带气候,电动车检测不同季节中EV感染的发生在夏秋季节。在目前的研究中,零星的检测电动汽车在污水样本观察全年峰值在秋天与先前的研究一致在突尼斯在12年和显示季节性变化在电动汽车检测低段传输在冬季和高传播周期从3月至11月峰值在秋天31日]。

电动车被确认为常见病毒的代理参与无菌性脑膜炎的研究报道在突尼斯沿海地区(Mahdia-Monastir)在2011年和2013年之间22]。电动汽车的检测污水在目前的研究在2012年和2013年之间征服马赫迪耶建议临床和之间的相关性环境在这两项研究菌株鉴定。因此检测E-5 E-18废水在当前的研究中都是按照我们之前的结果,这两种电动汽车类型识别在无菌性脑膜炎患者。

系统发育分析表明,E-5和E-18序列决定从环境和临床样本彼此密切相关。因此相同的每个E-5和E-18病毒变种基因型是识别出两种类型的样品。tMRCA估计系统的相关节点组表明,每种类型的病毒变种出现不到一年时间,他们的传播。事实上,我们的研究结果表明,环境的压力会直接与研究人群的无菌性脑膜炎。

总之,我们的研究表明,废水处理用在突尼斯远非例病毒学有效代表水媒传播的公共卫生风险的病毒。这表明EV废水和人类之间的运输之间的相关性水污染和无菌性脑膜炎。与大样本现在需要进一步调查证实无菌性脑膜炎和压力之间的关系在环境和传播理解病毒传播的机制。

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