研究与评述:微生物与生雷竞技苹果下载物技术杂志
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Tietao王1#高芬1#，康艺文1赵超1、苏涛2李慕航1，思美如2沈锡辉1*
1西北农林科技大学干旱作物胁迫生物学国家重点实验室/生命科学学院，陕西杨凌
收到日期:2015年8月20日;接受日期:2015年9月17日;发表日期:2015年9月21日
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谷氨酰胺棒状杆菌菌硫醇过氧化物酶(MPx)是一种新型的cygpx家族过氧化物酶，它使用核氧还蛋白和硫氧还蛋白还原系统作为质子供体进行过氧化物解毒。在这项研究中，我们发现MPx对酸胁迫下的细胞存活也很重要。Δmpx突变体对酸性胁迫的抗性显著降低，体内活性氧(ROS)积累和蛋白质羰基化水平显著增加。mpx的过表达通过减少ROS的积累提高了谷氨酰胺对酸胁迫的抗性。在酸性胁迫条件下，谷氨酸酵母野生型菌株mpx基因的表达持续升高，这直接促进了谷氨酸酵母对酸性胁迫的耐受性。酸诱导的mpx表达是由应激反应性胞浆外功能因子(ECF-σ)介导的。研究结果明确表明，MPx通过降低谷氨酰胺酸胁迫诱导的胞内ROS水平，对谷氨酰胺抗酸胁迫至关重要，这为CysGPx的一般生理功能增加了一个新的维度。
真菌硫醇过氧化物酶，酸胁迫，ROS，叹气，谷氨酸棒状杆菌。
微生物发酵生产生物制品，如生物燃料、生物基化学品和生物材料，越来越受到世界各国的关注。然而，在发酵过程中，大多数工业细菌在生产酸性化合物和原料预处理过程中不可避免地受到酸胁迫[1-3.]。为了在酸性胁迫下生存，细菌采用多种耐酸机制，包括限制质子进入、排出细胞内质子、产生大分子保护蛋白和伴侣蛋白以及中和细胞质[4-8]。然而，酸胁迫反应主要是在高度耐酸的革兰氏阴性肠道病原体中研究的，如大肠杆菌和沙门氏菌在摄入过程中遇到极低的胃pH值[9革兰氏阳性菌，如乳酸菌和单核细胞增多性李斯特氏菌，通常存在于酸性环境中[10-11]。酸适应机制对生态和生物技术重要性的酸敏感细菌的生长和生存至关重要。
谷氨酸棒状杆菌一种快速生长的土壤细菌，广泛用于工业生产氨基酸和核苷酸[12，13]。最近的研究集中在这种生物上，从可再生和生态高效的木质纤维素生物质中生产其他生物基化学品，如生物燃料(异丁醇和乙醇)、二胺尸胺和腐胺、糖醇木糖醇、-氨基丁酸、聚羟基丁酸和有机酸[14-18]。其对酸性pH的敏感性是已知的，但pH稳态的机制和参与驯化过程的组分尚不清楚。现有的信息仅限于编码atp基因簇的f1f0 - atp酶，在暴露于低pH和诱导酸耐受性反应时被下调，包括编码转录调节因子的基因和负责运输和代谢的蛋白质的上调。此外，基因编码谷氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶和精氨酸脱亚胺酶，这是另一种广泛分布的通过细胞质碱化的抗酸机制，在基因中缺失c . glutamicum［19]。因此，在酸敏植物中应该存在其他新的酸适应机制c . glutamicum值得调查。
酸胁迫反应的研究进展c . glutamicum基于转录组、蛋白质组和代谢组揭示了pH适应、氧化应激、铁稳态和代谢改变之间的功能联系[20.]。蜡样芽孢杆菌在酸胁迫下也发生了氧化应激，并伴有ROS的形成和氧化应激相关基因如硫氧还蛋白、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(SOD)的激活[qh]21-22]。然而，尽管酸诱导的H2O2通过添加外部过氧化氢酶促进生长c . glutamicum在中性pH条件下，添加过氧化氢酶对酸性pH条件下的生长没有显著的促进作用[20.]。这一观察结果提出了一个问题，即其他酶促抗氧化剂，如真菌硫醇过氧化物酶(MPx)，是否以及如何在生物适应中起作用c . glutamicum适应酸性pH条件
MPx是一种新型的cygpx家族过氧化物酶，在硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶(Trx/TrxR)或核氧还蛋白1/真菌硫蛋白还原酶/真菌硫醇(Mrx1/Mtr/MSH)还原体系存在下降解过氧化氢和烷基氢过氧化物。MPx可以防止多种应激源诱导的活性氧的破坏作用，并且具有比过氧化氢酶或Ohr更高的催化效率[23-25]。mpx的表达显著增强了抗c . glutamicum通过减少蛋白质羰基化和细胞内ROS积累来减少各种过氧化物[30(25)]。mpx的表达受应激反应性胞浆外功能-σ (ECF-σ)因子的直接调控[25]，据报道，它会增加细菌的抵抗力c . glutamicum应对多重应激，调控多种氧化应激抗性基因的表达[26-28]。在这项研究中，我们首次揭示了MPx在低pH条件下也对细胞存活至关重要，它通过清除酸胁迫诱导的ROS发挥作用。我们的工作提供了一个以前未知的，但重要的方面的见解c . glutamicum细胞对酸性胁迫的反应。我们的研究结果将有助于理解酸敏感菌的耐酸机制，并为提高工业菌株的耐酸性开辟一条新的途径，用于从可再生生物质中生产生物基化学品。
菌株及培养条件:本研究使用的菌株和质粒列于表S1。c . glutamicum和大肠杆菌菌株在LB (Luria-Bertani)肉汤中，在旋转摇床(220 rpm)或LB平板上，分别在30°C和37°C下进行好氧培养。必要时使用以下浓度的抗生素:氯霉素20 μg/ ml大肠杆菌10 μg/mlc . glutamicum;卡那霉素50 μg/ml大肠杆菌25 μg/mlc . glutamicum;萘啶酸，40 μg/mlc . glutamicum。
表S1:本研究使用的菌株、质粒及引物。
酸性生存试验:酸性生存试验参照Zhang等的方法进行。[29]并稍加修改如下:隔夜培养c . glutamicum将LB中的菌株适当稀释成不同pH的LB，在30℃下以100 rpm摇匀孵育1 h。酸胁迫后，将培养物依次稀释，涂于LB琼脂板上，在30℃下生长36 h后计数菌落。存活率计算公式为:[(酸激后CFU/ml)/(未酸激后CFU/ml)] × 100%。
细胞内ROS水平测定:为了检测细胞内ROS，使用荧光报告染料3 ' -(对羟基苯基)荧光素(HPF, Invitrogen)和2 '，7 ' -二氯二氢荧光素双醋酸酯(H2DCFDA, Invitrogen)，如前所述[30.]。简单地说，收集1 ml好氧培养的细胞(A600=1.6)，在1 ml 50 mM磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中洗涤和重悬，然后用10 mM HPF或H2DCFDA在28°C黑暗中预孵育20分钟。然后将细胞制成颗粒，用50 mM PBS洗涤两次，在1 ml LB (pH 4.0)中重悬，在黑暗中孵育1小时。之后，将得到的细胞悬浮液样品200ml转移到黑色96孔板上。荧光测量采用SpectraMax M2平板阅读器(Molecular Devices)，激发/发射波长分别为490/515 nm (HPF)和495/520 nm (H2DCFDA)。
细胞蛋白羰基化的测定:蛋白质羰基化实验根据Vinckx等人描述的方法进行。[31稍加修改。简单地说,c . glutamicum菌株在LB培养基中培养过夜，在pH 4.0下处理1 h，在30°C下100 rpm摇匀。然后离心收集培养物，用25 mM Tris-HCl (pH 8.0)洗涤，用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的25 mM Tris-HCl (pH 8.0)重悬(Sigma-Aldrich, Taufkirchen，德国)。超声处理获得透明的细胞裂解液。通过离心收集可溶性蛋白部分，并根据制造商的方案(Bio-Rad, Hercules, CA)使用Bradford测定浓度，以牛血清白蛋白(BSA)为标准。随后，根据制造商的说明，使用OxyBlot蛋白氧化检测试剂盒(Millipore, MA, USA)测量蛋白质羰基化水平，该试剂盒测量氧化反应产生的蛋白质的羰基。蛋白质中的羰基被2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生。将20微克的dnph衍生蛋白加载到15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上，进行电泳。电泳后，将衍生蛋白电泳到硝化纤维素膜上，用兔抗dnp抗体对dnph衍生蛋白进行免疫检测。
染色体融合报告菌株的构建及β-半乳糖苷酶活性测定将lacZ融合报告质粒pK18mobsacB-Pmpx::lacZ转化为c . glutamicum电孔法选择野生型(WT)、Δ sigH(pXMJ19)和Δ sigH(pXMJ19- sigH)，并将染色体pK18mobsacB-Pmpx::lacZ融合报告菌株镀于LBkanamycin板上[32]。将得到的菌株在LB培养基中培养至600 nm (A600)的光密度为0.9-1.0，然后在30°C不同pH条件下处理30 min。以o-硝基苯-β-半乳糖苷(ONPG)为底物测定β-半乳糖苷酶活性[33]。
定量RT-PCR分析:使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)和DNase I Kit (Sigma-Aldrich)，从指数生长的WT(pXMJ19)、ΔsigH(pXMJ19)和ΔsigH(pXMJ19- sigh)菌株中分离总RNA，并在不同的pH条件下暴露30分钟。用随机的9-mer引物和MLV逆转录酶(TaKaRa，大连，中国)对纯化的RNA进行逆转录。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析使用7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司，福斯特城，CA)进行，如前所述[26]。用于qRT-PCR分析的引物列于表S1。根据周期阈值量化目标mrna的相对丰度。为了使结果标准化，以16S rRNA的相对丰度作为内标。
统计分析:所示的结果代表一个代表性的三次试验的平均值，误差条代表标准偏差(SD)。统计学分析采用Student’s t检验。
的生存反应c . glutamicum对酸性胁迫:的生存反应c . glutamicum以野生型菌株为研究对象，在pH值为6.0 ~ 3.0的条件下，用HCl (图1)。在不同的酸冲击下，固定相野生型的存活率c . glutamicum有显著性差异。pH值为6.0时c . glutamicum成活率100%。当暴露于pH 5.5, pH 5.0, pH 4.5和pH 4.0时c . glutamicum与未处理菌株相比，野生型菌株的存活率分别约为90%、80%、70%和50%。该菌株在低于pH 3.5的环境下无法存活，在30°C下孵育36小时的LB板上无法形成菌落。这种反应下文称为失活表型，条件为杀菌。
图1:生理反应c . glutamicum暴露在不同的酸性pH值下野生型c . glutamicum在LB培养基中培养到A600处理后依次稀释，铺在LB板上，30℃孵育36 h。存活率计算公式为[(有胁迫的CFU/ml)/(无胁迫的CFU/ml)] × 100。显示了至少三次重复的平均值和标准差(误差条)。
酸胁迫诱导的ROS形成c . glutamicum：据报道，在蜡样芽孢杆菌中，酸胁迫可诱导有害活性氧(ROS)的产生，包括通过芬顿化学产生的极具破坏性的羟基自由基(OH·)[22]。这一发现促使我们研究ROS是否在c . glutamicum活性氧的形成c . glutamicum野生型细胞暴露于选定的pH水平(pH 6.0, pH 5.5, pH 5.0, pH 4.5, pH 4.0和pH 3.5)后，使用ros敏感荧光探针，2 '，7 ' -二氯荧光素(H2DCFDA) (图2一个)。c . glutamicum在pH 5.5, pH 5.0, pH 4.5, pH 4.0和pH 3.5下观察到的存活率对应过量的ROS形成。在pH 6.0时，该菌株不受影响，没有检测到过量的ROS形成。此外，细胞内ROS水平随着pH值的降低而升高(图2一个)。
图2:体内ROS的形成c . glutamicum细胞内ROS和OH·水平的定量分析c . glutamicum用荧光探针H2DCFDA和HPF分别处理不同酸性pH 1 h后的野生型培养物。显示了至少三次重复的平均值和标准差(误差条)。* p≤0.05。
接下来，我们使用OH·特异性荧光探针3 ' -(对羟基苯基)荧光素(HPF)监测羟基自由基(OH·)的产生，OH·是酸性pH暴露下产生的毒性最大的ROS。图2 b)。OH·的含量明显高于c . glutamicum在酸处理的野生型细胞中，OH·的产生随着ph的降低而增加。综上所述，这些数据提供了酸胁迫诱导活性氧过量形成的证据c . glutamicum，这有助于在酸胁迫下细胞毒性。
MPx保护c . glutamicum抗酸性细胞:解决MPx是否可以保护c . glutamicum将抗酸应激细胞、野生型、Δ mpx突变株和互补株分别在pH 4.0和6.0条件下激发1 h，采用细胞活力测定法(图3)。pH 4.0处理降低了野生型的存活率，导致约50%的死亡率(图1)。如图所示图3在pH 6.0处理下，Δ mpx突变体的存活率与野生型几乎相同，但在pH 4.0处理下，Δ mpx突变体的存活率比野生型下降了37.9%。然而，Δmpx突变体的酸敏表型在互补菌株Δmpx (pXMJ19-mpx)中完全恢复。此外，mpx过表达增加了野生型菌株对酸性胁迫的抗性(图3)。此外，在没有酸胁迫的正常条件下，mpx基因的缺失不影响细菌的生长(图S1)，进一步支持了MPx对酸性胁迫具有保护作用的结论c . glutamicum。
图3:细胞抗酸性胁迫需要MPxc . glutamicum。表示c . glutamicum在30°C条件下，将菌株置于酸胁迫(pH 4.0和6.0)下1 h。用活力法测定细胞存活率。显示了至少三次重复的平均值和标准差(误差条)。* p≤0.05。
图S1:删除mpx在没有酸胁迫的正常条件下，基因对细菌生长没有影响。通过测定OD来监测菌株在LB中的生长情况600在指定的时间点。所示数据为三个独立实验的平均值;误差条表示三个独立实验的标准差。
MPx能够降低酸胁迫下细胞内产生的ROS水平:以上数据表明，酸胁迫可诱导氧化应激，导致活性氧的产生c . glutamicum。有趣的是，最近有报道称MPx在抵抗多种应激源产生的氧化应激和清除活性氧中发挥重要作用c . glutamicum［23，25]。
这些发现促使我们研究是否耐酸胁迫c . glutamicumMPx所赋予的与酸性胁迫诱导的有害活性氧水平的降低有关。因此，我们分别用H2DCFDA和HPF检测了酸胁迫处理后细胞内ROS和OH·水平。数据显示，正如预期的那样，Δ mpx突变体在pH 4.0 (图4一)。互补菌株Δ mpx (pXMJ19-mpx)的ROS和OH·水平几乎完全降低到野生型菌株的水平(图4一)，表明mpx与突变体中ROS清除密切相关。这些数据表明MPx具有保护作用c . glutamicum通过清除在酸性胁迫下通过芬顿化学产生的活性氧，尤其是高毒性的OH·来对抗酸性胁迫。因此，我们推测，在酸胁迫下，Δ mpx突变体的存活率可以通过2,2 ' -二吡啶基或硫脲阻断Fenton反应介导的羟基自由基形成而恢复到野生型水平，这两种已知的药物可以有效减轻羟基自由基的破坏作用[34]。不出所料，当添加到酸胁迫下的细菌培养物中，这两种化学物质中的每一种都能将Δ mpx突变体的存活率提高到几乎与野生型菌株相当的水平(图4 b)，进一步证实了MPx在清除细胞中积累的有害活性氧方面至关重要c . glutamicum在酸性胁迫条件下。
图4:缺乏MPx的突变体在酸胁迫下ROS产量增加。(A) WT(pXMJ19)细胞内ROS和OH·水平;Δmpx(pXMJ19)和Δmpx(pXMJ19-mpx)菌株暴露于pH 4.0时，采用H2分别为DCFDA和HPF。(B)羟基自由基缓释剂对酸胁迫杀灭效率的影响。20 μM 2,2′-二吡啶或6.5 mM硫脲对小鼠的存活无影响Δmpx突变体(上图)。加入20 μM 2,2′-二吡啶基或6.5 mM硫脲后Δmpx突变体暴露于pH 4.0，存活率Δmpx突变体几乎恢复到野生型(下图)。显示了至少三次重复的平均值和标准差(误差条)。** p≤0.01;* p≤0.05。
从抗氧化防御系统中逸出的ROS更容易与蛋白质的半胱氨酸巯基发生反应，产生不可逆的亚砜化产物，蛋白质间或蛋白质内二硫化物(PrSSPr, PrSSPr)，以及与低分子量硫醇混合的二硫化物，最终导致蛋白质羰基化[35，36]。鉴于MPx能够减少ROSc . glutamicum，我们假设MPx也可能在酸胁迫条件下保护蛋白质不发生羰基化。为了验证这一假设，我们采用了一种完善的方法来测量蛋白质羰基化使用OxyBlot测定。提取pH 4.0处理的野生型和Δ mpx突变细胞的总蛋白，并在OxyBlot处理前后进行SDS-PAGE (图5)。大量的蛋白质被发现含有羰基c . glutamicum野生型和Δ mpx突变细胞在pH 4.0处理下的蛋白质提取物。此外，与Δ mpx突变体相比，暴露于pH 4.0 (图5)。综上所述，这些数据提供了证据，证明MPx对酸性胁迫具有保护作用c . glutamicum通过去除酸胁迫诱导的活性氧生成。
图5:缺乏MPx的突变体在酸性胁迫下蛋白质羰基含量增加。蛋白羰基含量用抗二硝基苯抗体(上图)进行Western blotting分析。平行运行染色考马斯亮蓝(下面板)。总蛋白分别从野生型和Δmpx突变细胞。
酸诱导的mpx表达由叹息介导;我们已经证明MPx参与清除由酸性胁迫诱导的细胞ROS。接下来，我们进行了RT-PCR和LacZ活性分析，以检查mpx表达是否在转录水平上对酸胁迫诱导剂有反应。Pmpx:: LacZ染色体启动子融合报告基因的LacZ活性c . glutamicum在未处理或pH 5.0和pH 5.5 (图6)。在pH 5.0和pH 5.5处理的野生型菌株中，mpx的表达水平分别比未处理的样品增加了约1.46倍和1.23倍(图6)。此外，Pmpx::lacZ融合的表达在酸性环境条件下表现出H+浓度依赖性的增加(图6)。在qRT-PCR分析中也观察到类似的H+浓度依赖性mpx表达模式(图6 b)。这些结果清楚地表明，酸性胁迫诱导了mpx的表达，而mpx的表达反过来又直接促进了对酸性胁迫的耐受性c . glutamicum适应酸性胁迫条件。
图6:酸胁迫下，叹息对谷氨酰胺mpx表达的正向调节。(A) β-半乳糖苷酶分析mpx启动子活动利用转录Pmpx：：lacZ染色体融合报告基因的表达表明c . glutamicum菌株。显示了至少三次重复的平均值和标准差(误差条)。**: p≤0.01。(B) qRT-PCR检测显示mpx在酸性胁迫下受到严格的正调控。指数增长的c . glutamicum细胞分别暴露于pH 5.0和pH 5.5中30分钟mpx用定量RT-PCR法检测其表达。相对于未经处理的野生型细胞的mRNA水平。显示了至少三次重复的平均值和标准差(误差条)。** p≤0.01。
据报道，应激反应性胞浆外功能-σ因子(ECF-σ)可响应巯基氧化应激并调节多种抗性基因的表达[27，28]，我们通过测量染色体Pmpx::lacZ融合的转录来检测mpx的表达是否受到叹息的调节。指数生长的Δ叹息突变体在pH 5.0和pH 5.5条件下暴露30分钟，与野生型(图6)。在酸诱导和非诱导条件下，ΔsigH突变体中mpx的表达量在互补菌株ΔsigH (pXMJ19- sigH)中完全恢复(图6)。qRT-PCR分析也证实了sig依赖性mpx激活(图6 b)。这些数据表明，叹息正调控mpx的表达。
c . glutamicum是一种对酸敏感的革兰氏阳性工业细菌，是生产氨基酸和其他生物基化学物质的生物技术中的主力。[37，38]。因此,c . glutamicum易受酸性胁迫，并增强耐酸性c . glutamicum是发酵过程中的关键参数。尽管多种高耐酸细菌的耐酸机制已经得到了很好的描述，包括质子泵、调节因子、代谢改变、蛋白质和DNA修复、细胞包膜改变和碱产生的作用，但大多数这些重要的一般机制在酸敏感细菌中缺失或无效c . glutamicum表明该细菌可能存在一些新的酸适应机制。
最近，Mols等人发现，在低pH胁迫条件下，酸胁迫诱导的ROS的形成可能是蜡样芽孢杆菌细胞死亡的一种机制，并且在低pH条件下，SOD和过氧化氢酶等抗氧化酶被显著诱导[21，22]。研究表明，初级活性氧清除酶在保护细胞免受酸胁迫诱导的氧化应激中起着至关重要的作用。然而，过氧化氢酶的含量和活性在酸性pH条件下显著降低，烷基氢过氧化物还原酶(Ahp)缺失c . glutamicum，两个初选H2O2细菌中的清除酶[20.]。最近有报道称，MPx可以防止多种应激源诱导的ROS的破坏作用，是一种比过氧化氢酶或Ohr更有效的清除剂，尽管MPx的保护能力较弱c . glutamicum抗酸胁迫的能力仍然未知[23-25]。在这里，我们研究了MPx的生理作用和潜在机制c . glutamicum在酸胁迫下。
作为主要的活性氧清除酶c . glutamicum我们推测MPx对酸胁迫的保护作用与其清除ROS的能力有关。在枯草芽孢杆菌中，酸胁迫下ROS的形成已被实验证实。此外，越来越多的数据表明，微生物暴露于各种压力下，如重金属、抗生素、异种生物、热和盐，也可以增加ROS的产生并诱导二次氧化应激[21，30.，34，39]。正如预期的那样，酸胁迫诱导了活性氧的形成c . glutamicum由于丧失了清除ROS的能力，mpx缺陷突变体的细胞存活率明显低于野生型，蛋白质羰基化受损程度也高于野生型(图3)。MPx在抗酸性胁迫中的生理作用也通过诱导MPx的表达得到证实c . glutamicum在酸性胁迫下，由应激响应的ECF-sigma因子直接调控，图6)。这些结果强烈提示MPx的表达对酸性胁迫下细菌的生长很重要。
总之，我们描述了MPx在保护的作用c . glutamicum通过降低酸处理诱导的细胞内ROS水平来对抗酸胁迫。据我们所知，这是第一个描述菌硫醇过氧化物酶的耐酸作用的报告。因此，我们的工作提供了一个以前未知的，但重要的，细胞对酸胁迫反应的方面，可以用来发展c . glutamicum作为未来高效的生物基化工生产菌株。
国家高技术研究发展计划(863计划，资助2013AA102802)、国家自然科学基金(No. 31270078和31500087)、陕西省科技重点发展计划(No. 2014K02-12-01)和中国科学院微生物研究所微生物资源国家重点实验室开放项目(No. 863)资助;sklmr - 20120601)。
