研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
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P - ISSN: 2347 - 2286
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Tietao王1#,分高1#谊文,康女士1,曹国伟赵1道,苏2,Muhang李1,Meiru Si2和Xihui沈1*
1压力作物生物学国家重点实验室为干旱地区和生命科学学院陕西杨凌西北农大学公关中国
收到日期:2015年8月20日;接受日期:2015年9月17日;发表日期:2015年9月21日
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棒状杆菌属glutamicum mycothiol MPx(过氧化物酶)是一种新型CysGPx家庭使用mycoredoxin和硫氧还蛋白过氧化物酶减少系统作为过氧化氢质子捐助者解毒。在这项研究中,我们发现MPx对细胞生存压力酸也很重要。Δmpx突变体表现出显著降低酸性压力和阻力显著增加活性氧的积累(ROS)和体内蛋白质羰基化水平。mpx过度增加c . glutamicum的抗酸压力通过减少活性氧积累。mpx基因的高表达一直观察到当c glutamicum野生型菌株被暴露在酸应力条件,从而直接导致了耐酸性压力。一段表达mpx介导了逆境应答extracytoplasmic function-sigma (ECF-σ)因素,叹息。结果明确显示MPx必不可少的打击酸引起的压力通过减少细胞内ROS水平酸c . glutamicum压力再增加一个维度CysGPx的一般生理功能。
Mycothiol过氧化物酶、酸压力,ROS,叹息,棒状杆菌glutamicum。
微生物发酵生产生物制品,如生物燃料、生物化学和生物材料,吸引了全世界的关注。然而,在发酵过程中,大多数工业细菌是不可避免地接触到酸酸性化合物的生产过程中压力和原料预处理1- - - - - -3]。酸生存压力,细菌采用各种耐酸机制,包括质子入境限制,驱逐胞内质子,生产高分子保护蛋白质和陪伴,中和的细胞质4- - - - - -8]。然而,酸应激反应主要研究高耐酸革兰氏阴性肠道病原体,如大肠杆菌和沙门氏菌期间遇到的极低的pH值胃摄入(9),在选择的革兰氏阳性细菌,如乳酸细菌和单核细胞增多性李斯特氏菌,通常在酸性环境中持续10- - - - - -11]。酸适应机制的核心acid-sensitive细菌的生长和存活的生态和生物技术不容易理解的重要性。
棒状杆菌属glutamicum我年代一家快速成长的土壤细菌广泛用于工业生产的氨基酸和核苷酸(12,13]。最近的研究集中在这种生物的生产从木质生物质可再生能源和eco-efficient其他生物化学物质,如生物燃料(异丁醇和乙醇)、二元胺的尸胺、腐胺、糖醇木糖醇,gamma-amino丁酸,polyhodroxybutyrate,有机酸(14- - - - - -18]。其敏感性对酸性pH值是已知的,但是体内平衡pH值的机制和组件参与驯化过程并不知名。可用的信息仅限于F1F0-ATPase编码atp基因簇,则被抑制在低pH值和诱导的耐酸碱反应,包括上调基因编码转录监管机构和蛋白质负责运输和代谢。此外,基因编码谷氨酸脱羧酶,精氨酸脱羧酶和精氨酸deiminase,代表另一个广泛分布的耐酸性机制通过细胞质的碱性化,失踪c . glutamicum(19]。因此,应该有其他小说acid-sensitive酸适应机制c . glutamicum,值得研究。
最近的研究在酸应激反应c . glutamicum基于转录组、蛋白质组和代谢组瓦解之间的功能联系pH驯化,氧化应激,铁体内平衡和代谢改变20.]。氧化应激的发生酸胁迫下也观察到在蜡样芽胞杆菌,伴随着活性氧的形成和氧化跟压力基因的激活,如硫氧还蛋白、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(SOD) (21- - - - - -22]。然而,尽管消除段H2O2通过添加外部过氧化氢酶促进的发展c . glutamicum在中性pH值,添加过氧化氢酶没有明显的有益影响生长在酸性条件下(20.]。这一观点提出的问题是否和其他酶的抗氧化剂,如mycothiol过氧化物酶(MPx),函数的适应c . glutamicum酸性pH值条件。
MPx是小说CysGPx家庭过氧化物酶分解过氧化氢和烷基氢过氧化物的存在的硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶(硫氧还蛋白/ TrxR)或mycoredoxin 1 / mycothione还原酶/ mycothiol(要看更多有关憩苑Mrx1 /地铁/)减少系统。MPx防止活性氧诱导的破坏性影响多个压力和催化效率高于过氧化氢酶或Ohr [23- - - - - -25]。mpx的表达显著增强的阻力c . glutamicum各种过氧化物减少蛋白质羰基化反应和细胞内活性氧积累[30 (25)]。mpx的表达是直接由stressresponsive extracytoplasmic function-σ(ECF-σ)因素叹息25),据报道,增加阻力c . glutamicum到多个压力和调节许多氧化胁迫抗性基因的表达(26- - - - - -28]。在这项研究中,我们首次揭示MPx也是至关重要的细胞生存在低pH值条件下,代理通过清除ROS酸引起的压力。我们的工作提供了洞察一个前所未知的,但重要的是,的方面c . glutamicum细胞反应酸压力。我们的结果将帮助在酸耐受性机制的理解acid-sensitive细菌和打开一个新途径提高耐酸工业生产菌株的生物化学物质可再生生物质。
菌株培养条件:细菌菌株和质粒用于本研究中列出表S1。c . glutamicum和大肠杆菌菌株在Luria-Bertani耗氧培养(磅)汤在一个旋转瓶(220 rpm)或磅板块在30°C和37°C,分别。在需要的时候,使用抗生素浓度:氯霉素,20μg /毫升大肠杆菌和10μg /毫升c . glutamicum;卡那霉素,50μg /毫升大肠杆菌和25μg /毫升c . glutamicum;萘啶酸、40μg /毫升c . glutamicum。
表S1:菌株、质粒和引物用于这项研究。
酸生存分析:酸进行生存分析根据张的方法等。29日)与小修改,如下:隔夜的文化c . glutamicum磅的压力适当稀释到磅(不同的pH值)和孵化30°C用颤抖的在100 rpm 1 h。酸压力后,文化是连续稀释和镀上磅琼脂板,和36 h后殖民地数增长30°C。生存比例计算如下:[(CFU /毫升后酸挑战)/ (CFU /毫升没有酸挑战)]×100%。
测量细胞内ROS水平:检测细胞内ROS,荧光记者染料3 ' - (p-hydroxyphenyl)荧光素(高通滤波器,英杰公司)和2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA英杰公司)被使用,如前所述[30.]。简单,1毫升细胞耗氧(A600 = 1.6)收集,清洗和resuspended 1毫升50 mM phosphatebuffered盐水(PBS, pH值7.4)之前与10毫米pre-incubation高通滤波器或H2DCFDA 28°C在黑暗中20分钟。然后细胞颗粒状,洗两次50 mM PBS, resuspended 1毫升磅(pH值4.0),和1 h在黑暗中孵化。之后,200毫升的合成细胞悬液样本被转移到一个黑色的96孔板。荧光测量使用SpectraMax M2板读者(分子设备)与激发/发射波长的490/515 nm(高通滤波器)和495/520 nm (H2DCFDA)。
测定细胞蛋白质羰基化反应:蛋白质羰基化反应进行分析基于Vinckx描述的方法等。31日与一些细微的修改。简单地说,c . glutamicum株种植在一夜之间在pH值为4.0磅中等和治疗1 h用颤抖的在100 rpm 30°C。文化是通过离心收集,用25毫米Tris-HCl (pH值8.0)和25毫米resuspended Tris-HCl (pH值8.0)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich Taufkirchen,德国)。声波降解法是获得一个清晰的细胞溶解产物。可溶性蛋白质分数是通过离心收集,浓度是衡量使用布拉德福德试验根据制造商的协议(Bio-Rad大力神,CA)与牛血清白蛋白(BSA)作为标准。随后,蛋白质羰基化水平测量一种OxyBlot蛋白质氧化检测设备(美国微孔,MA)根据制造商的指示,该措施所产生的蛋白质羰基化合物氧化反应。在蛋白质羰基化合物derivatized 2, 4-dinitrophenyl肼(DNPH)。20微克的DNPH-derivatized蛋白质被加载到15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)凝胶电泳。电泳后,在硝化纤维膜electroblotted derivatized蛋白质,immunodetection DNPH-derivatized蛋白质执行使用一只兔子anti-DNP抗体。
建设染色体融合记者菌株和β-galactosidase活动分析:lacZ融合记者质粒,pK18mobsacB-Pmpx: lacZ,变成了c . glutamicum野生型(WT)Δ叹息(pXMJ19)和Δ叹息(pXMJ19 -叹息)通过电穿孔,和染色体pK18mobsacB-Pmpx:: lacZ融合记者应变被镀上LBkanamycin板(32]。由此产生的菌株是生长在磅介质光学密度在0.9 - -1.0 600海里(A600),然后对不同pH条件下30°C 30分钟β-galactosidase活动与o - nitrophenyl-β-galactoside化验(ONPG)作为底物(33]。
定量rt - pcr分析:总RNA分离指数增长的WT (pXMJ19)ΔsigH (pXMJ19)和ΔsigH (pXMJ19-sigH)菌株暴露在不同pH条件30分钟使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)随着DNase我工具包(Sigma-Aldrich)。纯化RNA reverse-transcribed 9 mer随机引物和MLV逆转录酶(豆类,大连,中国)。定量逆转录聚合酶链反应(存在)分析使用7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)如前所述[26]。使用的引物中存在分析中列出表S1。目标mrna的相对丰度是基于循环阈值量化。标准化结果,16 s rRNA的相对丰度作为内部标准。
统计分析:结果显示代表一个代表的意思是分析执行一式三份和误差代表标准偏差(SD)。统计分析是利用学生的学习任务。
生存的反应c . glutamicum酸压力:生存的反应c . glutamicum酸压力进行了研究使用野生型菌株处理酸碱值从6.0 - 3.0 pH值调整与盐酸(图1)。接触不同的酸冲击后,固定相野生型的存活率c . glutamicum表现出显著差异。在pH值为6.0,c . glutamicum存活率是100%。在暴露在pH值为5.5,pH值5.0,pH值4.5,和pH值4.0c . glutamicum野生型菌株存活率约90%,80%,70%和50%相比,未经处理的菌株,分别。这个压力是无法生存在酸碱低于3.5,无法形成如图所示的殖民地在30°C 36磅盘子孵化h。这种反应以后被称为失活表型和杀菌条件。
图1:生理反应的c . glutamicum在接触不同的酸性pH值。野生型c . glutamicum是生长在一磅中等600年1.6 - -1.7和暴露在酸性pH值在30°C 1 h。治疗后,连续稀释文化,传播到磅盘子和孵化30°C 36 h。生存百分比计算如下:[与压力(CFU / ml) / (CFU /毫升没有压力)]×100。平均值和标准偏差(误差)至少三个重复。
酸压力诱导活性氧的形成c . glutamicum:蜡样芽胞杆菌、酸压力报道诱导有害活性氧簇(ROS)的生产,包括高度破坏性的羟基自由基(OH·),通过芬顿生成化学(22]。这一发现促使我们调查是否产生活性氧c . glutamicum处理低博士活性氧的形成c . glutamicum野生型细胞接触后检查选择的pH值(pH值6.0,pH值5.5,pH值5.0,pH值4.5,pH值4.0,和pH值3.5)使用ROS-sensitive荧光探针,2 ',7 '二氯荧光素二乙酸(H2DCFDA) (图2一个)。c . glutamicum显示多余的活性氧形成对应生存率观察到pH值5.5,pH值5.0,pH值4.5,pH值4.0,pH值3.5。在pH值为6.0,这一毒株的pH值不受影响,没有多余的活性氧形成测量。此外,细胞内ROS水平增加细胞暴露于降低pH值(图2一个)。
图2:ROS形成c . glutamicum在暴露于低博士量化细胞内ROS和哦·水平c . glutamicum野生型文化治疗后在不同酸性pH值1 h和荧光探针H2DCFDA高通滤波器,分别。平均值和标准偏差(误差)至少三个重复。* P≤0.05。
接下来,我们监控的生成羟基自由基(OH·),最有毒活性氧产生酸性pH值曝光后,使用哦·特殊荧光探针,3 ' - (p-hydroxyphenyl)荧光素(高通滤波器)(图2 b)。更高的哦·被观察到c . glutamicum野生型细胞处理酸,哦·生产增加反应减少博士综上所述,这些数据提供了证据表明,酸诱导形成活性氧过剩压力c . glutamicum对酸,导致细胞毒性的压力。
MPx保护c . glutamicum对酸细胞压力:为了解决MPx能否保护c . glutamicum对酸细胞压力,野生型,Δmpx突变和互补菌株挑战在pH值4.0和6.0 1 h,并使用一个细胞存活率进行了评估可行性分析(图3)。pH值4.0治疗的存活率降低野生型和导致的死亡率约为50% (图1)。所示图3的存活率,而Δmpx突变体与野生型几乎相同的pH值6.0下治疗,存活率的Δmpx突变体与野生型相比下降了37.9%在pH值4.0治疗。然而,酸敏感的表型Δmpx突变完全获救的互补菌株Δmpx (pXMJ19-mpx)。此外,mpx超表达野生型菌株的抗酸增加压力(图3)。此外,删除mpx基因并不影响细菌生长在正常情况下没有酸压力(图S1),进一步支持结论MPx对酸性压力起到保护作用c . glutamicum。
图3:MPx细胞抗酸所需的压力c . glutamicum。表示c . glutamicum菌株暴露在酸压力(pH值4.0和6.0)1 h在30°C。细胞存活率测定的可行性分析。平均值和标准偏差(误差)至少三个重复。* P≤0.05。
图S1:删除的mpx基因并不影响细菌生长在正常情况下不酸的压力。磅表示菌株的生长是通过测量OD监控600年在表示时间点。数据显示的是三个独立实验的平均值;误差线表明SD从三个独立的实验。
MPx能够降低细胞内ROS水平产生酸胁迫下:以上数据表明,酸的压力会引起氧化应激,导致活性氧产量c . glutamicum。有趣的是,最近有报道称MPx抵抗氧化应激中发挥了重要的作用由多个压力和清除活性氧的生成c . glutamicum(23,25]。
这些发现促使我们检查是否酸应力宽容c . glutamicum授予由MPx与减少酸应激引起的有害活性氧的水平。我们检查了细胞内ROS和哦·酸后压力治疗H2DCFDA和高通滤波器,分别。数据显示,正如所料,Δmpx突变了ROS和哦·水平显著高于野生型菌株在pH值4.0 (图4一)。ROS和互补菌株哦·水平,Δmpx (pXMJ19-mpx),几乎完全变成野生型菌株的水平(图4一),这表明mpx突变ROS清除有紧密的联系。这些数据表明,MPx保护c . glutamicum对酸性压力清除ROS,特别是剧毒哦·,通过芬顿化学酸胁迫下产生的。因此,我们推测的存活率Δmpx突变体与野生型恢复水平酸胁迫下的阻塞芬顿reaction-mediated氢氧自由基形成,2,2’-联吡啶或硫脲,代理有效减轻羟基自由基的破坏性影响34]。正如所料,当添加到细菌培养受到酸的压力,这两种化学物质能够提高生存率的Δmpx突变体的水平几乎与野生型菌株(图4 b),进一步验证了这种观点,即MPx在去除有害活性氧积累是至关重要的c . glutamicum酸胁迫条件。
图4:突变体缺乏MPx ROS增加生产酸胁迫。(一)细胞内ROS和哦·WT (pXMJ19)的水平,Δmpx(pXMJ19)和Δmpx(pXMJ19-mpx)菌株接触pH值4.0测量使用H2分别DCFDA和高通滤波器。(B)的氢氧自由基上缓解代理酸的杀人效率的压力。20μM 2,2 ' -dipyidyl或6.5毫米硫脲对生存的没有影响Δmpx突变体(上半部分)。之后的20μM 2 2 -dipyidyl或6.5毫米硫脲Δmpx突变体暴露在pH值4.0,的存活率Δmpx突变体几乎是恢复野生型(下图)。平均值和标准偏差(误差)至少三个重复。* * P≤0.01;* P≤0.05。
ROS逃离抗氧化防御系统更倾向于与半胱氨酸巯基共同的蛋白质发生反应,导致不可逆sulfoxidation产品,国际米兰——或者intra-protein二硫化(PrSSPr PrSSPr)和低分子量硫醇和混合二硫化,最终导致蛋白质羰基化反应(35,36]。鉴于MPx能够减少ROSc . glutamicum,我们假设MPx也可能功能防止酸应激条件下蛋白质羰基化。为了验证这个假设,我们应用一个行之有效的方法来测量使用OxyBlot测定蛋白质羰基化。总蛋白的野生型和Δmpx突变细胞治疗pH值4.0提取和之前和之后进行sds - page OxyBlot治疗(图5)。大量的蛋白质被发现港口羰基化合物c . glutamicum野生型蛋白提取和Δmpx突变细胞治疗pH值4.0。此外,蛋白质提取的羰基化水平显著低于野生型相比Δmpx突变接触pH值4.0 (1 h后图5)。综上所述,这些数据提供了证据表明MPx扮演保护角色对酸压力c . glutamicum通过去除酸压力诱导活性氧的生产。
图5:突变体缺乏MPx增加了蛋白质羰基含量下酸的压力。分析了蛋白质羰基含量与anti-dinitrophenyl抗体免疫印迹(上半部分)。一个并行运行与考马斯亮蓝染色(下图)。从野生型和总蛋白的提取Δmpx突变细胞。
段时间mpx表达式是由叹息:我们已经表明,MPx参与清除细胞ROS酸引起的压力。我们接下来进行rt - pcr和LacZ活动分析检查是否mpx表达对酸应激诱导的转录水平。的LacZ活动Pmpx: LacZ染色体启动子融合的记者c . glutamicum野生型菌株在细菌细胞定量测量未经处理或处理酸碱5.0和5.5 (图6)。mpx表达水平增加了大约1.46 - 1.23倍,野生型菌株处理酸碱5.0和5.5,分别,而未经处理的样品(图6)。进一步的表达Pmpx: lacZ融合显示H +浓度增加对酸性环境条件(图6)。类似的H + concentrationdependent mpx表达式模式以应对酸压力也观察到存在分析(图6 b)。这些结果清楚地表明,酸应激诱发mpx表达式,进而直接导致的宽容c . glutamicum酸性压力条件。
图6:积极的监管c glutamicum mpx叹了口气酸胁迫下表达。(一)β-Galactosidase分析mpx使用转录启动子活动Pmpx::lacZ在表示染色体融合记者表示c . glutamicum菌株。平均值和标准偏差(误差)至少三个重复。* *:P≤0.01。(B)中存在化验显示表达的mpx是在严格positi叹了口气酸胁迫下的监管。指数增长的c . glutamicum细胞接触酸碱5.0和5.5 30分钟的水平mpx表达式是由定量rt - pcr。mRNA水平提出了相对于价值从野生型细胞没有获得治疗。平均值和标准偏差(误差)至少三个重复。* * P≤0.01。
叹息,逆境应答extracytoplasmic function-sigma (ECF-σ)因素,据报道,应对thiol-oxidative压力和调节多种抗性基因的表达(27,28),我们检查是否mpx表达受到叹息调控转录的测量染色体Pmpx:: lacZ融合。显著降低LacZ观察活动的指数增长Δ叹息突变接触酸碱5.0和5.5条件30分钟比野生型(图6)。ΔsigH mpx表达降低的突变体中完全恢复互补菌株Δ叹息(pXMJ19 -叹息)acid-inducible和non-inducible条件下(图6)。SigH-dependent mpx激活也证实了存在分析(图6 b)。这些数据表明,叹息积极调节mpx的表达。
c . glutamicum,马生物技术生产氨基酸和其他的生物化学物质,是一种acidsensitive工业革兰氏阳性菌(37,38]。因此,c . glutamicum是容易受到酸的压力,提高耐酸性的c . glutamicum在发酵过程中是一个关键参数。虽然耐酸性的机制已经被很好的描述在多个高耐酸细菌,包括质子泵的作用,监管机构、改变新陈代谢,蛋白质和DNA修复,细胞被膜的改变,和碱生产,大多数这些重要的通用机制在acid-sensitive缺失或无效c . glutamicum,表示可能会有一些小说在这种细菌酸适应机制。
最近,摩尔等人表明,酸的形成压力诱导活性氧可能在b细胞死亡的机制昙花,暴露在低pH值应力条件下,抗氧化酶,如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶有显著诱导在低pH值(21,22]。研究表明,主要的活性氧清除酶发挥了重要作用在保护细胞免受酸stressinduced氧化应激。然而,内容和过氧化氢酶的活性显著降低酸性pH值条件下,和alkylhydroperoxide还原酶(Ahp)失踪c . glutamicum,两个初选H2O2清除酶在细菌(20.]。最近报道,MPx可以防止活性氧诱导的破坏性影响多个压力和比过氧化氢酶或Ohr更有效的清除剂,虽然MPx保护的能力c . glutamicum对酸压力是未知的(23- - - - - -25]。在这里,我们审查MPx的生理作用和潜在机制c . glutamicum在酸的压力。
作为主要活性氧清除酶c . glutamicum,我们猜测,对酸MPx压力的保护作用是清除活性氧的能力相关。ROS在酸的形成压力在枯草芽孢杆菌中被证实。此外,还有微生物积累数据证明接触各种各样的压力,如重金属、抗生素、外源性物质,热量和盐也可以增加活性氧的生产和诱发次生氧化应激21,30.,34,39]。正如所料,酸应力诱导活性氧的形成c . glutamicum,MPx-deficient突变体显示显著降低细胞生存能力受损的蛋白质羰基化反应速率和比野生型,由于损失的清除活性氧的能力(图3)。MPx生理作用的抗酸压力也证实了MPx的诱导表达c . glutamicum酸胁迫下,管制直接由逆境应答ECF-sigma因素,叹息(图6)。这些结果强烈表明MPx表达对细菌生长在酸性压力很重要。
总之,我们描述MPx在保护的作用c . glutamicum对酸压力通过减少细胞内ROS水平诱导下酸治疗。据我们所知,这是第一个报告描述了耐酸mycothiol过氧化物酶的作用。因此,我们的工作提供了洞察一个前所未知的,但重要的是,细胞反应酸压力方面,可以用来发展c . glutamicum作为一种高效的生物化工生产菌株。
这项工作得到了国家高技术研究发展计划(863计划,格兰特2013 aa102802),中国国家自然科学基金(31270078和31270078号),陕西省的关键科学和技术研发项目,中国(2014 k02-12-01)和国家重点实验室开放项目的微生物资源,中国科学院微生物研究所(没有。sklmr - 20120601)。
