和评论:生药学和植物化雷竞技苹果下载学》杂志上的研究表明
菜单e-ISSN: 2321 - 6182 p-ISSN: 2347 - 2332
e-ISSN: 2321 - 6182 p-ISSN: 2347 - 2332
Sandip Uttam Bhavar*
生物处理技术、化学技术研究所,孟买,印度
收到:14 - 10月- 2022年手稿。JPRPC - 22 - 77295;编辑分配:2022年- 10月17日,PreQC没有。JPRPC - 22 - 77295 (PQ);综述:2022年- 10月31日,QC没有JPRPC-22 - 77295;修改后:07 - 11月- 2022手稿。JPRPC - 22 - 77295 (R);发表:11月15 - - 2022,2321 - 6182.10.6.005 DOI: 10.4172 /
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Nanobodies提供难以置信的特异性抗体在单个免疫球蛋白VHH域。这种独特的特性使应用程序从生化药物的工具。nanobody生产,现在的趋势是朝着更简单但可靠(细菌)技术可以取代更费时真核基础流程。Nanobody图书馆可以用不同的方法合成,如免疫骆驼,骆驼或者构建综合。其他质粒系统用于携带nanobody-specific基因。细菌和细胞表面显示是新兴技术的孤立感兴趣的蛋白库。免疫,天真和合成库显示在不同的细菌来源。稳步提高产品杂质成分浓度和相应的变化挑战开发和优化nanobody生产流程。此外,提高对产品质量要求的复杂性导致更高的处理和分析,从而增加了成本的产品检查。杂质的浓度和组成高效的过程发展至关重要。 These impurities can show significant variations, so we have to control this impurity by control of upstream processing.
VHH;质粒;免疫和合成库;显示技术
Nanobodies(国家统计局)重组单极从变量VHH域获得抗体重链抗体(HCAbs)出现在骆驼科(如单峰骆驼,骆驼,羊驼)。的重组抗原特异性单极VHH尺寸在纳米范围内也被称为Nanobody (Nb)或单极抗体(sdAb) (图1)。
图1:Nanobody的一般结构。
可溶性的vhh获得必要的修改和功能没有轻链,更多的扩展和混合互补决定区(CDRs),严格的单体行为,可逆的折叠性能和优良的抗蛋白质水解和热变性比VH域从古典抗体。这些内在的生物物理属性使他们的表达细菌,酵母和哺乳动物宿主。他们的体积小(ca 15 k哒;直径24海里)和长cdr还允许绑定的可用比被古典抗体抗原表位,包括酶的活性区域内部和区域表面蛋白的病原体。vhh也与人类VH3序列,这是至关重要的国家统计局的低免疫原性的治疗使用。这些属性使得国家统计局特别理想的分子对于许多应用程序,包括细胞生物学研究中,治疗和蛋白质晶体学在活的有机体内人类疾病的诊断。因此,Nb选择、描述和生产方法的重大利益。一个臭名昭著的例外经典的哺乳动物是骆驼科的血清免疫球蛋白结构。除了传统的heterotetrameric抗体。免疫球蛋白抗体,称为重链抗体(HCAbs),不包含一个L-chain多肽和缺乏为特征的第一个常数域(CH1)。氨基端区域,H homodimeric蛋白质链包括一个专用的可变域,称为VHH,足以与同源抗原。在HCAb VHH抗体Fab经典的结构和功能等效的Fab片段(antigen-binding片段)。合成库从一个共识脚手架的基因中提取出来的骆驼,骆驼科,羊驼家庭成员。nanobody图书馆起着至关重要的作用在nanobodies的可用性。VHH图书馆主要侧重于CDR3上地区,最多样化和antigen-binding地区出现在VHH。 The amino acid sequence of the VHH region plays a vital role in identifying the antigen. For the highly variable positions in each CDR, introduce more aggressive randomisation. The VHH library can be constructed by analysing the nanobody sequence and based on this, the introduction of highly variable positions such as CDR1 and CDR2 can be chosen [1]。nanobody生产的趋势是朝着更简单和可靠的细菌系统可以替代繁琐的流程要求真核系统。细菌的周质帮助创建有利于形成二硫键氧化条件稳定nanobody结构。不同的细菌来源包括大肠杆菌,葡萄球菌carnosus,毕赤酵母属pastoris,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌,Magnetospirrilum gryphiswaldense和酿酒酵母用于nanobodies生产。不同的技术用于显示nanobody或VHH碎片。技术包括尺寸排阻色谱法、ELISA、噬菌体展示技术和细菌展示技术用于检测nanobody碎片。
Nanobody图书馆
VHH的单极性质得到了一些独特的功能比传统抗体。他们已经证明他们的重视治疗分子。Nanobodies自然发现骆驼科家族,包括单峰骆驼,羊驼和骆驼。nanobody库也称为VHH库时由VHH抗体重链的地区。抗原可以选择nanobodies VHH库构造的各种技术,如噬菌体展示,显示细胞表面,高通量DNA测序和质谱鉴定。VHH库可以分为三个主要类型:免疫、天真和半合成/合成[2]。
免疫图书馆的建设:单峰骆驼是nanobodies的天然来源。单峰骆驼与目标抗原的免疫导致生产nanobodies对目标抗原。信使rna分离三到四天后免疫通过收集包含我们的目标nanobodies外围抗凝血。使用逆转录酶酶,将信使rna cDNA使用特定的引物PCR。之后,PCR片段的结扎成向量通过削减向量和PCR与一对特定的限制性内切酶片段。结扎后,他们被电穿孔转化为宿主细胞。然后提取殖民地并将它们存储在所需的温度。免疫库组成。不同的技术可用于屏幕上图书馆,如噬菌体展示、细菌显示,细胞表面显示,核糖体展示等。GFPplus抗原表达在细菌和净化。噬菌体展示nanobody pHEN4图书馆是向量。 The Phage Display-Derived Nanobodies (P-Nbs) were amplified by PCR, digested with PstI and BstEII and ligated into the pHEN6 vector. Plasmids were transformed into大肠杆菌RR1dM15细胞。另一种基于金门克隆技术克隆与未经修改的和消极的选择转化株噬菌体展示向量的存在一个致命的ccdB基因修改的噬菌体展示的向量(3]。
免疫库的优势
挑战
天真的图书馆:重组VHH噬菌体展示库的设计从接种动物及其后续平移一直喜欢孤立high-affinity-specific绑定。方法是费力而大量合成和天真VHH库从骆驼和鲨鱼最近被提出。这是因为各种各样的图书馆将允许为每个潜在的抗原识别绑定(4]。这种多样性可以实现(半)合成超突变库的变量在一个地区VHH骨干,类似于已成功在自洽场的情况下完成的。
挑战
合成库:无免疫力重组抗体库非免疫抗体的多样性高的建在nanobody架构使成功体外对几乎任何抗原抗体的选择。抗体可用于免疫学检测标准应该提高在这样一个图书馆,应该积极抗体的细胞内环境。开始,一个大肠杆菌融合实验可以用来生成一系列高度功能性VHH支架的细胞内表达和稳定。合成库通过精心调节每个CDR1和CDR2使用氨基酸的集合,有些比赛自然多样性,同时减少最疏水残基的存在减少聚合的倾向。
质粒构建:质粒小环状DNA分子出现在许多种类的细菌的“复制起源”调节质粒复制和确保克隆细胞包含多个副本的质粒分散在细胞分裂时的子细胞。一个质粒表达载体将外源DNA (Nanobody基因)进入细胞。另一个关键的组件在重组蛋白开发是一个质粒的表达。它的重要性源于其独特的能力自我复制和结扎后选择一个特定的基因型与外国的DNA。合成细菌内的nanobody系统,必须首先创建一个适当的质粒的克隆nanobody-synthesis感兴趣的基因。生成nanobodies细菌内部系统,使用各种质粒系统。nanobody基因引入向量通过MCS网站限制消化后的向量和专门的限制性内切酶的基因重组质粒构建的标准技术nanobody制造业(如Eco911和Pst.1。向量是随后转化成适当的宿主细胞(大肠杆菌WK6细胞)。氨苄青霉素抗性基因(ampR)促进选择性生长在营养肉汤(磅氨苄青霉素媒体)。nanobody基因的超表达LacZ启动子的下游是允许通过诱导LacZ启动子与-D1-thiogalactopyranoside (IPTG) [5]。表达蛋白然后运到周质的区域进行适当的折叠到它的函数形式。蛋白质的正确折叠一个细菌细胞的细胞质内由于拥挤的环境是困难的。结果,大多数重组蛋白分泌信号,允许适当的折叠蛋白质生成,允许进行靶向治疗和预防包涵体(聚合的蛋白质不溶性质量)创建了质粒测试的能力互补脱氧核糖核酸免疫疗法对膜蛋白生成nanobodies原来的状态。他们利用cDNA表达向量细菌抗生素抗性基因,一个强有力的通用的启动子和一个开放阅读框(ORF)表达所需的膜蛋白。表位标记,内含子和哺乳动物抗生素抗性基因是可选的特征。有力无处不在的启动子转录增加膜蛋白的开放阅读框在骆驼科免疫细胞(6]。
细菌的来源
VHH可以快速生产的革兰氏阴性细菌大肠杆菌,革兰氏阳性细菌Brevibacillus choshinensis实验室,有些物种,Bifidbacterium物种由于其体积小,亲水性质和singledomain自然。细菌系统从中受益相对容易改变和更经济可行的生产系统。大肠杆菌是最常见的微生物宿主VHH生产。nanobody生产,现在的趋势是朝着更简单但可靠(细菌)技术可以取代更费时eukaryotic-based流程。这种细菌系统很容易文化,发展迅速,已经彻底的特点,提供了一个日益增长的各种克隆载体和突变菌株。超表达策略大肠杆菌也被成功地研究和描述。他们援助转录通过提高基因的拷贝数或增加启动子区域的结合强度。细菌细胞有几个优点,包括快速增长、成熟的遗传学和种植成本低。各种细菌,包括大肠杆菌,棒状杆菌属glutamicum,假单胞菌putida和芽孢杆菌megaterium用于生产重组蛋白,产生特定的nanobodies。哺乳动物细胞是主要用于nanobodies的表达是有帮助的,因为他们可以引入翻译后的变化类似于人类细胞中发现的。然而,一些缺点使用哺乳动物表达系统促使制造商寻找其他的主机系统。预测细胞株在早期的生产行为和选择克隆与可接受的增长特性是两个最具挑战性的问题。改进过程一直是昂贵和费时的。哺乳动物系统也有一些局限性,如介质的复杂性,血清需求和剪切敏感性[7]。
nanobodies显示技术用于筛选和净化
蛋白质功能经常被选择使用显示方法。
虽然它已经成功表达蛋白质表面的细菌,表面展示肽和多肽丝状噬菌体(噬菌体展示)仍然是最广泛使用的显示技术(表1)。
| 手机显示 | 非细胞显示 |
|---|---|
| 细菌显示 | 核糖体展示 |
| 噬菌体展示 | 信使rna显示 |
| 酵母细胞表面展示 | 寡核苷酸适配子 |
| 在体外划分(IVC) | |
| Cis-Activity-Based (CIS)显示 | |
| 共价抗体显示(CAD) |
表1。细胞和非细胞显示方法。
如上所述,有两种类型的显示系统:细胞和非细胞。非细胞方法不需要细胞的存在(8]。
噬菌体展示
噬菌体展示是一个实验室的方法研究蛋白质,蛋白质肽和protein-DNA交互连接蛋白质编码的基因信息那些使用噬菌体(病毒感染细菌)。感兴趣的蛋白质的基因引入一个噬菌体外壳蛋白基因,导致页面的“显示”表面的蛋白质,含有蛋白质的基因,导致genotype-phenotype链接。这些显示噬菌体可以筛选与其他蛋白质,肽或DNA序列是否显示蛋白质与其它分子相互作用。在体外选择,模拟自然选择可以屏幕和扩大大蛋白库。M13和fd丝状噬菌体是最常见的利用噬菌体在噬菌体展示;然而,T4, T7噬菌体也被使用。噬菌体感染细菌,通常用于创建蛋白质和肽(9]。
细胞表面展示
表面的表达nanobodies活细胞或细胞器的融合细胞的功能组件暴露在环境被称为一个细胞表面展示。可以使用不同的细胞表面蛋白锚定图案和nanobodies可以用作客运蛋白质。选择从细胞库通常使用Fluorescence-Activated执行显示细胞排序(流式细胞仪)标签的抗原细胞的荧光团,然后孵化它显示nanobody图书馆解决方案,与噬菌体和核糖体显示使用一个捕获和洗脱过程。量化的能力亲和力在选择是一个关键的细胞显示系统的特征,使过程更像是micro-well板比生物平移筛选噬菌体和核糖体展示。
自从nanobodies微生物系统中有一个很好的表达和有益的生物化学特性(良好的溶解性,能在恶劣条件下稳定性好,高亲和力和特异性抗原),他们是理想的工具,用于研究目的。细菌克隆拥有许多有前途的未来nanobody生产类型的研究。此外,人们越来越意识到nanobodies结构比最初认为的更有区别。发现的微生物表达系统能够提供non-immunogenic项目,保持抗原特异性应该为更具成本效益的nanobody制造。Nanobodies必须固定在许多应用程序的常规和生物磁性纳米颗粒(基于),包括诊断、immunomagnetic分离细胞和磁标签。