自然和人工甜味剂对细菌基因表达和蛋白质合成的影响

文摘

辩论的影响存在不同甜味剂在人类肠道微生物,包括细菌如大肠杆菌(大肠杆菌)。这是假设不同甜味剂会有不同的影响大肠杆菌基因表达和蛋白质合成。在这个项目中,大肠杆菌生长在固体Luria肉汤媒体添加蔗糖,偏离的程度^®或代糖^®。最小的媒体(固体和液体)添加蔗糖(蔗糖)、代糖^®,甜菊糖甙^®,或者偏离的程度^®作为唯一碳源也作为另类媒体。与每一个甜味剂,孵化后

大肠杆菌文化是镀,并使用蛋白质电泳分析了由此产生的殖民地。乐队所有凝胶强度进行了分析,结果显示显著差异蛋白质合成时比较几种甜味剂控制(蔗糖)。23的蛋白质在电泳凝胶,发现了乐队,乐队16和21显示甜味剂之间无显著差异,一代又一代。甜味剂也结合固体Luria肉汤和大肠杆菌是五代镀。殖民地从第一和第五代被用于蛋白质电泳。从收集到的数据,很明显,测试甜味剂有不同的影响大肠杆菌蛋白质合成,可能改变人类肠道微生物组。还需要更多的研究来确定蛋白质产品特别受影响。不过很明显,这些甜味剂有不同影响大肠杆菌蛋白质合成,它们对人类健康的影响仍然是不确定的。

关键字

甜味剂,大肠杆菌、蔗糖、蛋白质电泳、人类健康、蛋白质合成

介绍

人造甜味剂,也被称为糖替代品,是很多次的食品添加剂甜比天然糖,蔗糖。这些甜味剂不包含卡路里和用于控制体重,糖尿病和肥胖^(1]。糖尿病患者经常使用糖替代品代替天然糖,因为大多数不增加血糖水平。目前,美国食品和药物管理局批准的六个人造甜味剂:安赛蜜钾、阿斯巴甜,摘要,糖精,三氯蔗糖,adventame。许多这些添加剂是相对较新,因此他们的影响,尤其是在人类的生物群落,没有足够studied.”

目前,32%的美国成年人经常食用人造甜味剂^(2]。肥胖率急剧上升,人工甜味剂的使用增加了,因为尽管甜味道像蔗糖,他们没有很多卡路里和他们不影响血糖和胰岛素水平^(2]。然而,至少在一个研究中,低剂量的阿斯巴甜消费使老鼠更容易肥胖和显著改变他们的微生物^(3]。所以,尽管年长的甜味剂糖精和阿斯巴甜等研究了在某些能力,新的替代品代糖(人工制造实验室)和赤藓糖醇(自然由甜叶菊植物),诱导一个微不足道的胰岛素反应(表1和图1)。

表1。热量值和人类对常用的反应和众所周知的选择。

表1:展示了一些人工和天然甜味剂影响血糖和胰岛素反应。葡萄糖和蔗糖,这是最常见的使用,增加一个人的餐后血糖指数比其他甜味剂相比。葡萄糖和蔗糖糖还具有较高的胰岛素反应,会导致肥胖和糖尿病。当检查其他甜味剂,如赤藓糖醇,几乎不增加胰岛素的分泌,不会影响一个人的血糖指数,它是清楚为什么更多的人更频繁地使用这种类型的替代。

人造甜味剂已经被添加到各种食品消费者没有意识到它们的存在。食品和饮料行业继续使用人工甜味剂作为糖的替代品,市场营销主要是那些糖尿病和/或肥胖。行业通知公众人造甜味剂的积极作用,

他们缺乏等负面影响牙齿和改善血糖控制。然而,这些化学物质对我们的影响微生物并没有得到充分的研究。环己基氨基磺酸为例,是第一个人造甜味剂,现在被FDA由于发现它可能促进大鼠膀胱癌。辩论继续这些食品添加剂的影响作为人造甜味剂的全部潜力尚未充分关注。最根本的问题是一个甜味剂,不影响人体健康可以开发使用未经加工的天然成分。因为人造甜味剂的负面副作用的报道,消费者一直在寻找更多的自然选择甜菊糖甙和erythritol.

甜叶菊植物原产于南美洲,数百年来一直用作甜味剂。零卡路里的甜菊糖甙的今天,作为全球使用高纯叶提取物在食品和饮料添加甜味道,同时减少热量的内容。甜叶菊植物在1899年被描述为泽兰属植物由莫伊塞斯rebaudianum圣地亚哥据在巴拉圭。在1905年,它被命名为甜叶菊rebaudiana,向日葵(菊科)家族的一员^(4]。

图1:各种替代甜味剂改编的化学结构。

尽管各种研究人造甜味剂在生物模型的影响,几乎没有了解他们如何改变细菌基因表达和蛋白质模式。特别是现在我们越来越认识到它的重要性。我们的微生物的构成和其链接到健康。尽管存在一些研究表明肥胖大鼠给予阿斯巴甜会导致更高的利率,肝脏甘油三酯升高,增加血糖水平,和潜在的微生物的变化在这些哺乳动物,大多数人类研究无法可靠地复制这些数据。负面影响继续被热心的人造甜味剂的反对者,但是这些食品添加剂的倡导者仍然坚定地捍卫他们的积极作用特别是糖尿病患者仍然可以享受甜蜜的味道没有提升血糖。

赞美人妖魔化或人造甜味剂与大多数研究导致没有明确结论是否这些食品添加剂被公众时是危险的。尽管报告是稀疏的,有人建议,人类微生物组受到人造甜味剂。

不幸的是,即使这些研究证明,冲突的结果。一些研究表明,人工甜味剂增加肠道有益菌如乳酸菌^{(5- - - - - -7]}。其他人认为微生物由人造甜味剂的影响当负面影响在老鼠身上进行的测试^(2]。在这项研究中,研究人员给老鼠阿斯巴甜,然后测量他们的肠子和生理学的内容。结果表明,大鼠给予阿斯巴甜比控制老鼠变得更加肥胖。研究人员相关的肠道内的一些细菌在大鼠葡萄糖耐受不良,最终导致肥胖。

研究也一直在进行测量6 FDA批准的毒性人造甜味剂使用大肠杆菌生物荧光检测有毒物质。结果显示,大肠杆菌做发冷光的这些食品添加剂,但增长与控制是相一致的。这些结果表明,人工甜味剂的消极方面需要进一步研究,尤其是越来越多的人正在使用人工甜味剂。

人类消费的增加的人工甜味剂和天然糖和糖醇、甜菊糖甙和赤藓糖醇等,需要进行进一步的研究,更具体地说决定这些替代品对人类健康的影响。新兴研究显示,越来越多的世界各地的人们正在可怜的营养选择和经常来对抗这些选择,他们将选择甜味剂,以减少热量和夸张的胰岛素反应的影响。虽然其他甜味剂确实可以减少与肥胖和糖尿病相关的健康状况,我们必须确保他们不是以其他方式伤害我们。继续建立一个公众所需的研究做出有根据的选择他们的食物摄入,本研究调查了影响其他甜味剂可能在细菌蛋白质合成;它特别关注大肠杆菌作为模式生物,但额外研究肠道微生物细菌也应该进行。最初的研究设计利用最小媒体迫使细菌只使用这些甜味剂作为碳源;然而,由于贫困增长,磅媒体与甜菊糖甙最终补充^®,偏离的程度^®或代糖^®和蔗糖被用作控制。不同的一代又一代的增长后,细菌蛋白质的水平进行了分析使用蛋白质电泳和随后的一式三份带强度分析。

在实验之前大肠杆菌k - 12开始,人造甜味剂,将使用的浓度决定。首先,确定溶解度,得到了三个250毫升烧杯和100毫升蒸馏水被放置在每一个。人工甜味剂阿斯巴甜、三氯蔗糖和蔗糖测量1 g的增量。每个甜味剂是放置在一个不同的烧杯和甜味剂的溶液搅拌直到溶解。这个过程反复进行,直到100毫升蒸馏水是饱和与每个甜味剂。得出的平均标准数量的甜味剂媒体应该是5 g / L。无菌M9最小的媒体解决方案然后结合无菌(代糖甜味剂——水解决方案^®蔗糖,偏离的程度^®,甜菊糖甙^®)。Gibco提供的手册和协议后,1.5毫升/ L M9最小盐(2 x)中无菌添加到无菌容器中。然后,2毫升1.0 MgSO4溶液和0.1毫升1.0氯化钙溶液也补充道。最后成交了1000毫升。三个文化管被用于每个甜味剂,包括蔗糖。一个新的10毫升无菌血清学吸管用于整除2.5毫升的甜味剂解决方案和M9媒体到各自的试管。起动器管的大肠杆菌k - 12包括10毫升的M9媒体从起动器板和一个殖民地。起动器管涡均匀分布。管被孵化在37°C。48小时。12管得到和sweetener-water解决方案和M9媒体增加了文化的和以前一样,而是从一个盘子,100μl每个管从上一代被添加到新管然后成为一代2。这些都是放在孵化器在37°C。48小时。描述的步骤重复了五代。

后查看结果M9媒体实验,确定使用这种液体媒体有限增长太多,因此不会剩下的实验的一个可行的方法。另一个变化,甜菊糖甙的方法是停止使用。三代后,甜菊不支持殖民地增长。M9液体媒体方法停止了,取而代之的是一个坚实的M9 /琼脂媒体。这允许容易识别污染物的代际盘子。固体M9 /琼脂媒体的组成包括一个琼脂/水溶液和M9媒体。琼脂比蒸馏水是1000毫升30克。这个解决方案被加热溶解琼脂和热压处理过的M9媒体用于杀菌目的。

两种液体被冷却到50°C。用20毫升20%甜味剂和结合的解决方案,1米2毫升MgSO4解决方案,和一个0.1毫升1 m氯化钠溶液。这个过程做了三次独立的烧瓶而改变甜味剂蔗糖溶液,偏离的程度,或者代糖。这三个玻璃瓶被注入三组18板在媒体上,每个包含一个不同的甜味剂。每甜味剂18板媒体允许六代。

大肠杆菌是镀上九个板块为每个甜味剂(3)。孵化后37°C。48小时,最小的增长在盘子上。这个观察导致再次修改方法。使用M9媒体停止是因为它创造一个环境过于苛刻大肠杆菌生长。使用M9媒体应该迫使细菌使用甜味剂作为他们唯一的碳源。然而,很明显,大肠杆菌没有途径足够这些甜味剂的化学能转化为ATP。使用磅代替M9的选择是支持的事实,人类微生物组的细菌有超过一个单一的碳源。方法来创建坚实的媒体是由添加7 g Luria肉汤、200毫升蒸馏水,4 g的甜味剂。这个解决方案是由三次不同甜味剂(蔗糖、转向或代糖)在每一个解决方案。这些解决方案是热压处理过的和冷却到50°C。18,分成三组培养皿的甜味剂。三组,每个包含从每个甜味剂媒体三胞胎,接种大肠杆菌和孵化37°C。为24小时。24小时后,第二代是由接种的大肠杆菌从各自的一代。的大肠杆菌从一代被用于蛋白质电泳分析来确定蛋白质合成的水平。这样做是五代。

蛋白质电泳的方法如下。100年第一代从每个试管μl用于接种磅污染检查板材和成长样本用于蛋白质电泳。板块在培养48小时37°C。48小时后,第一代管取出,检查污染物。这些大肠杆菌样本用于蛋白质电泳。开始蛋白质电泳,Laemmli样品缓冲了:0.3克德勤添加到30毫升的缓冲andwirled resuspend Laemmli样本。德勤的最终浓度是50毫米。剩下的解决方案是储存在-20°C。德勤是不稳定的。在每次使用之前,解决方案是加热到室温解散任何形式的SDS沉淀在冻结。精度+蛋白质万花筒标准被加载在第一车道的凝胶(每次使用之前,解决方案是加热到室温解散任何SDS沉淀形成在冻结)。使TGS运行缓冲100毫升10 x Tris-glycine-SDS运行缓冲和900毫升蒸馏水混合。十二个螺旋帽超小型电子管贴有相应细菌板。300μl室温Laemmli样品缓冲被添加到每个超小型电子管。每次使用新的接种环,同等数量的殖民地从每个刮板和转移到相应的管。它是由旋转然后彻底混合循环用拇指和食指,确保没有可见的细菌团管。 Pipetting up and down with a 100 μl setting on a pipet aided in the dispersion. The tubes were heated to 95°C for 5 minutes in a water bath and cooled to room temperature. Mini-PROTEAN TGX Precast Gel was prepared for electrophoresis in the Mini-PROTEAN Tetra cell (Bio-Rad). 10 μl of the Kaleidoscope standard was loaded into the first lane of each gel. 20 μl of each sample was loaded into subsequent wells. Each sweetener was represented in triplicate on each gel. The gels were electrophoresed at 200 V for 30 minutes. After opening the casing to retrieve the gels, they were rinsed three times for 5 minute each with water. Water was poured out and 50 ml of Coomassie stain was added. The gel was stained overnight on a shaker while covered to avoid evaporation. While the gel was staining the next generation were made and incubated. The next day, the stain was poured out and the destain process began by doing another three, five-minute washes. The gel was then placed in the gel doc and analyzed. The protein electrophoresis was completed for all five generations.

结果

细菌生长和电泳的结果M9液体媒体磅下图所示

图2:增长的第一代大肠杆菌增长磅盘子。一代1显示,增长的显著差异图2。这些殖民地是选择和分析使用蛋白质电泳(图3和图4)。

一代1显示,增长的显著差异图2。这些殖民地是选择和分析使用蛋白质电泳(图3和图4)。

图3:这些凝胶显示蛋白途径四个不同甜味剂在一式三份。左边凝胶显示甜叶菊^®道2 - 4和蔗糖6 8车道。正确的图中显示偏离的程度^®在车道3 - 5和代糖^®道6 - 8。第一列是标准。

图4:这些是相同的凝胶图221乐队,但与主示粉红色。

图5:t乐队显示不同治疗之间的强度。

图中图5显示每个乐队的乐队平均强度不同的至少一个甜味剂。以下带强度差别明显甜味剂和蔗糖列为由两个示例t测试:蛋白质带2甜叶菊(p = 0.0125);蛋白质组11、甜菊糖甙(p = 0.0181);蛋白质组14、甜菊糖甙(p < 0.001),三氯蔗糖(p < 0.001)。有21个乐队,但只有这四个显示在统计上有显著差异的基因表达。M9方法的结果非常有趣,但没有持续由于细菌生长较低无法检查污染物。

与M9 /琼脂固体介质,实验后分析并不是由于缺乏细胞培养完成。磅/甜味剂方法的结果如下所示。

图6:左边的凝胶是第一代,右边的凝胶是一代5。第一个车道的凝胶是万花筒标准。这些凝胶包括蔗糖(通道2 - 4两种凝胶),偏离的程度^®(道5 - 7在凝胶),代糖^®在凝胶(车道8 - 10)。粉色带标记用于分析蛋白质的强度大肠杆菌样本。

为了获得图像中看到图6ImageLab软件(Bio-Rad)是用于添加粉红色的酒吧。23条被添加到每个车道即使凝胶上的乐队现在不明确(软件能够解释这种更低强度计算)。这可以确保每个乐队都有一个类似的强度测量在车道,甜味剂类型和代。图像实验室软件也用于获得原始数据图表。凝胶是彼此标准化占不均匀加载和暴露在凝胶文档图像实验室。标准化是由寻找带强度的比率平均带强度标准。比发现,稳定在所有方法中使用的凝胶。带6在万花筒标准用于标准化的乐队。带6比5带6代1是0.831945。第一代中所有带测量凝胶也因此规范化结果乘以0.831945。正常化后,带强度的比率平均带强度仍然与以前一样。 The analyzed data is shown below in表2和图7和8。

图7:乐队在凝胶强度的乐队。从第一代浅颜色显示结果,并与第五代的深色。

表2。所有的两个示例t测试两代人之间和跨代比较甜味剂。用黄色突出显示的数字显示p值< 0.05,显示显著的变化。

图8:3 d图形显示所有乐队的乐队/蛋白强度的差异,两代人。蓝色是蔗糖,红色是偏离的程度^®,黄色是代糖^®。轻的颜色在前面代表第一代,而深色的关联背后的颜色代表一代5。

表2:所有的两个示例t测试两代人之间和跨代比较甜味剂。用黄色突出显示的数字显示p值< 0.05,显示显著的变化。

讨论

假设时,会有不同的表达模式大肠杆菌是生长在不同的人工和天然甜味剂的存在被收集到的数据支持为见过的吗图7和表2。之间的差异蛋白质合成蔗糖,偏离的程度^®,代糖^®可能会影响我们所知人类肠道微生物如何回应这些化学物质。如果相同的变化发生在人类肠道,可能是引起关注或这些变化可能实际上意味着良好的肠道细菌可能是蓬勃发展的比以前更好。改变了蛋白质合成,可能有不同的化工产品被排泄到人类肠道细菌或被吸收。

结论

使本研究更具包容性,其他类型的细菌和甜味剂应测试,或许最重要的是,下一步应重点关注识别特定蛋白质的类型规范。这种分析需要使用特定的抗体免疫印迹或RNA序列识别各种基因表达变化,特定的基因。本文给出的结果表明相关但不解释蛋白表达变化的机制由于细菌接触各种甜味剂。然而,关键是继续这些类型的研究,从而让公众可以意识到的潜在益处和问题,选择b甜味剂可能导致在我们的肠道。

引用

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