天然和人工甜味剂对细菌基因表达和蛋白质合成的影响

摘要

关于不同甜味剂对人类肠道微生物群的影响存在争议，其中包括大肠杆菌(大肠杆菌)．据推测，不同的甜味剂会有不同的影响大肠杆菌基因表达和蛋白质合成。在这个项目中，大肠杆菌是在固体Luria肉汤培养基中添加蔗糖Swerve^®，或Splenda^®．最小介质(固体和液体)添加蔗糖(蔗糖)，Splenda^®,甜菊糖甙^®，或转向^®作为碳的唯一来源，也被用作替代介质。在每种甜味剂孵育之后

大肠杆菌培养物被镀，得到的菌落用蛋白质电泳分析。分析了所有凝胶带的强度，结果显示，当将几种甜味剂与对照(蔗糖)进行比较时，蛋白质合成存在显著差异。在电泳凝胶上检测到的23条蛋白质条带中，只有16和21条带在甜味剂和代之间没有显着差异。甜味剂也与固体Luria肉汤和大肠杆菌被镀了五代。用第一代和第五代菌落进行蛋白电泳。从收集到的数据来看，很明显，测试的甜味剂对大肠杆菌蛋白质合成，并可能改变人体肠道微生物群。还需要进一步的研究来确定哪些蛋白质产品受到了特别的影响。虽然很明显这些甜味剂有不同的影响大肠杆菌蛋白质合成，它们对人体健康的影响仍未确定。

关键字

甜味剂,大肠杆菌，蔗糖，蛋白质电泳，人体健康，蛋白质合成

介绍

人工甜味剂，也被称为糖替代品，是一种比蔗糖等天然糖甜许多倍的食品添加剂。这些甜味剂不含卡路里，用于控制体重、糖尿病和肥胖^［1］．被诊断患有糖尿病的人通常使用糖替代品来代替天然糖，因为大多数糖不会提高血糖水平。目前，美国食品和药物管理局批准了六种人工甜味剂:安赛蜜钾、阿斯巴甜、纽甜、糖精、三氯蔗糖和阿德甜。这些添加剂中有许多是相对较新的，因此它们的影响，特别是对人类生物群落的影响，还没有得到充分的研究。”

目前，32%的美国成年人定期食用人造甜味剂^［2］．随着肥胖率的急剧上升，人工甜味剂的使用也在增加，因为虽然像蔗糖一样味道甜，但它们没有太多卡路里，而且不会对血糖和胰岛素水平产生太大影响^［2］．然而，至少在一项研究中，低剂量的阿斯巴甜摄入使大鼠更容易肥胖，并显著改变了它们的微生物群^［3.］．因此，尽管糖精和阿斯巴甜等较老的甜味剂在某种程度上已被研究过，但较新的替代品如splenda(实验室人工制造的)和赤藓糖醇(甜菊植物天然制造的)引起的胰岛素反应并不明显。表1和图1)．

表1。热值和人类对常用和众所周知的替代品的反应。

表1:展示了一些人造和天然甜味剂是如何影响血糖和胰岛素反应的。葡萄糖和蔗糖是最常用的甜味剂，餐后比其他甜味剂更能增加人的血糖指数。葡萄糖和蔗糖也有很高的胰岛素反应，可以导致肥胖和糖尿病。当研究其他甜味剂时，比如赤藓糖醇，它们几乎不会增加胰岛素的分泌，对人的血糖指数也没有影响，这就很清楚为什么越来越多的人更频繁地使用这种替代品了。

人工甜味剂被添加到各种食品中，而消费者却毫不知情。食品和饮料行业继续使用人工甜味剂作为糖的替代品，并将其主要推销给糖尿病和/或肥胖者。该行业向公众宣传人工甜味剂的积极作用，

比如对牙齿没有负面影响，还能改善血糖控制。然而，这些化学物质对我们微生物群的影响还没有得到充分的研究。例如，甜蜜素是第一批被FDA禁止使用的人工甜味剂之一，因为研究发现它可能会导致大鼠患膀胱癌。关于这些食品添加剂的影响的争论仍在继续，因为人工甜味剂的全部潜力尚未得到充分的审查。最终的问题是，是否可以用未经加工的天然成分开发出对人体健康没有负面影响的甜味剂。由于人工甜味剂有负面副作用的报道，消费者一直在寻找更天然的替代品，如甜叶菊和赤藓糖醇。”

甜菊糖是一种原产于南美洲的植物，数百年来一直被用作甜味剂。如今，零卡甜叶菊作为一种高纯度的叶提取物，在全球范围内被用于食品和饮料中，以增加甜味，同时降低卡路里含量。1899年，巴拉圭的Moises Santiago de Bertoni将甜叶菊植物描述为Eupatorium rebaudianum。1905年，它被重新命名为甜菊(Stevia rebaudiana)，是向日葵(菊科)家族的一员^［4］．

图1:各种替代甜味剂的化学结构适应了。

尽管对人工甜味剂对模式生物的影响进行了各种研究，但对它们如何改变细菌基因表达和蛋白质模式却知之甚少。现在我们越来越意识到微生物组的组成及其与健康的联系的重要性，这一点尤其正确。虽然有一些研究表明，服用阿斯巴甜的大鼠实际上会导致更高的肥胖率、肝脏甘油三酯升高、血糖水平升高，以及这些哺乳动物体内微生物群的潜在变化，但大多数人类研究都无法可靠地复制这一数据。人工甜味剂的强烈反对者继续指出其负面影响，但这些食品添加剂的倡导者仍然坚定地捍卫它们，因为它们对糖尿病患者有积极影响，他们仍然可以在不升高血糖的情况下享受甜味。

人们要么妖魔化人工甜味剂，要么赞扬人工甜味剂，大多数研究都没有得出明确的结论，说明公众食用这些食品添加剂是否危险。尽管相关报道很少，但已经有人提出，人体微生物群受到人造甜味剂的影响。

不幸的是，即使是这些研究也得出了相互矛盾的结果。一些研究表明，人工甜味剂会增加肠道中的有益细菌，如乳酸菌^［5-7］．另一些人认为，当在大鼠身上进行试验时，人工甜味剂的作用对微生物组产生了负面影响^［2］．在这项研究中，研究人员给大鼠服用阿斯巴甜，然后测量它们肠道中的含量和生理状况。结果显示，服用阿斯巴甜的大鼠比对照组的大鼠更肥胖。研究人员将肠道中某些细菌的存在与大鼠的葡萄糖耐受不良联系起来，从而最终导致肥胖。

研究人员还利用生物荧光大肠杆菌检测有毒物质，测量了六种FDA批准的人工甜味剂的毒性。结果显示大肠杆菌在这些食品添加剂的存在下确实发光，但生长与对照组一致。这些结果表明，人工甜味剂的负面影响需要进一步研究，尤其是越来越多的人在使用人工甜味剂。

随着人类对人造甜味剂、天然糖和糖醇(如甜菊糖和赤藓糖醇)消费的增加，需要进行进一步的研究，更具体地确定这些替代品对人类健康的影响。新兴研究表明，世界上越来越多的人选择营养不良的食物，为了应对这些选择，他们往往转向替代甜味剂，以减少卡路里和过度的胰岛素反应。虽然替代甜味剂确实可以减轻与肥胖和糖尿病相关的健康状况，但我们必须确保它们不会以其他方式伤害我们。为了继续建立一个必要的研究体系，让公众对他们的食物摄入做出明智的选择，这项研究检查了替代甜味剂可能对细菌蛋白质合成的影响;它特别关注于大肠杆菌作为一种模式生物，肠道微生物菌群的额外研究也应该进行。最初的研究设计利用最少的介质迫使细菌只使用这些甜味剂作为碳源;然而，由于生长缓慢，LB培养基最终添加了甜菊糖^®,偏离的程度^®，或Splenda^®，蔗糖作为对照。在不同世代的生长后，用蛋白质电泳和随后的条带强度分析来分析细菌蛋白质水平。

在实验之前大肠杆菌K-12开始，必须确定将使用的人工甜味剂的浓度。首先，为了确定溶解度，取三个250 mL烧杯，每个烧杯中放入100 mL蒸馏水。人工甜味剂、阿斯巴甜、三氯蔗糖和蔗糖以1克为增量进行测量。每种甜味剂被放入不同的烧杯中，搅拌溶液直到甜味剂溶解。重复这一过程，直到100毫升蒸馏水被每种甜味剂饱和。由此得出的结论是，培养基中甜味剂的平均标准用量应为5 g/L。然后将无菌M9最小培养基溶液与无菌甜味剂-水溶液(Splenda^®，蔗糖，转向^®甜菊叶^®)．按照Gibco提供的手册和协议，将1.5 mL/L M9 Minimal Salts (2X)培养基无菌加入无菌容器中。然后，加入2 mL 1.0 M MgSO4溶液和0.1 mL 1.0 M CaCl2溶液。最终体积增加到1000毫升。然后每种甜味剂(包括蔗糖)分别使用3个培养管。使用新的10 mL无菌血清学移液管将每种甜味剂溶液和M9培养基分别倒入各自的试管中。启动管大肠杆菌K-12包括10 mL M9培养基和一个菌落从启动板。启动管采用涡流，使其分布均匀。然后将试管在37°C下孵育。48小时。再取12支试管，加入甜味剂-水溶液和M9培养基，但不从培养皿中培养，而是从上一代试管中每支100 μl加入到新试管中，新试管成为第2代。将其置于37°C的培养箱中。48小时。所描述的步骤重复了五代。

在查看了M9介质实验的结果后，确定使用这种液体介质会过度限制生长，因此在剩余的实验中不是一种可行的方法。方法的另一个变化是停止使用甜菊糖。三代之后，甜叶菊不支持菌落生长。停止M9液体培养基方法，用固体M9/琼脂培养基代替。这便于在世代板上识别污染物。所述固体M9/琼脂介质的组成包括琼脂/水溶液和所述M9介质。琼脂与蒸馏水的比例为30克至1000毫升。将该溶液加热使琼脂溶解，并与M9介质一起蒸压杀菌。

然后将这两种液体冷却到50°C。与20 mL 20%的甜味剂溶液，1M 2mL MgSO4溶液和0.1 mL 1M NaCl溶液混合。这一过程在不同的烧瓶中进行了三次，同时将甜味剂溶液改为蔗糖、swerve或splenda。然后将这三个烧瓶倒进三组，每组18个盘子，每个盘子的培养基中都含有不同的甜味剂。每种甜味剂培养基有18个盘子，可供六代食用。

大肠杆菌被装在9个盘子里(每种甜味剂3个)。37°C孵育后。48小时后，培养皿上几乎没有生长。这一观察结果又导致了方法的改变。M9介质的使用被停止了，因为它创造了一个过于恶劣的环境大肠杆菌生长。使用M9培养基可以迫使细菌将甜味剂作为唯一的碳源。然而，很明显大肠杆菌没有足够的途径将这些甜味剂中的化学能转化为ATP。之所以选择使用LB而不是M9，是因为人类微生物组中的细菌有不止一个碳源。通过添加7克Luria肉汤、200毫升蒸馏水和4克甜味剂来创建固体介质。这种溶液用不同的甜味剂(蔗糖、swerve或splenda)做了三次。这些溶液经过高压灭菌并冷却至50°C。并倒入三组18个培养皿中，每种培养皿中都含有甜味剂。三组，每组含有来自每种甜味剂培养基的三胞胎，分别接种大肠杆菌37℃孵育。24小时。24小时后，通过接种产生第二代大肠杆菌分别从第一代开始。的大肠杆菌从第一代开始，然后用于蛋白质电泳分析，以确定蛋白质合成水平。五代人都这样做。

蛋白质电泳方法如下。第1代每个试管100 μl接种LB板进行污染检查，培养样品用于蛋白质电泳。然后在37°C下孵育48小时。48小时后，取出第一代试管并检查污染物。这些大肠杆菌样品用于蛋白质电泳。为了开始蛋白质电泳，制作Laemmli样品缓冲液:将0.3 g DTT添加到30 ml Laemmli样品缓冲液中，并旋转重新悬吊。DTT最终浓度为50 mM，剩余溶液保存于-20℃。，因为DTT是不稳定的。在每次使用之前，将溶液加热到室温以溶解冻结时形成的任何SDS沉淀物。Precision Plus Protein Kaleidoscope标准版装入每个凝胶的第一通道(在每次使用之前，将溶液加热到室温，以溶解冻结时形成的任何SDS沉淀物)。将100ml 10x tris -甘氨酸- sds运行缓冲液与900 ml蒸馏水混合制成TGS运行缓冲液。12个螺旋帽微管被标记对应于每个细菌板。在每个微管中加入300 μl室温Laemmli样品缓冲液。每次使用新的接种环，从每个平板上刮取等量的菌落并转移到相应的试管中。然后用拇指和食指旋转试管，将其彻底混合，以确保试管中没有可见的细菌团块。 Pipetting up and down with a 100 μl setting on a pipet aided in the dispersion. The tubes were heated to 95°C for 5 minutes in a water bath and cooled to room temperature. Mini-PROTEAN TGX Precast Gel was prepared for electrophoresis in the Mini-PROTEAN Tetra cell (Bio-Rad). 10 μl of the Kaleidoscope standard was loaded into the first lane of each gel. 20 μl of each sample was loaded into subsequent wells. Each sweetener was represented in triplicate on each gel. The gels were electrophoresed at 200 V for 30 minutes. After opening the casing to retrieve the gels, they were rinsed three times for 5 minute each with water. Water was poured out and 50 ml of Coomassie stain was added. The gel was stained overnight on a shaker while covered to avoid evaporation. While the gel was staining the next generation were made and incubated. The next day, the stain was poured out and the destain process began by doing another three, five-minute washes. The gel was then placed in the gel doc and analyzed. The protein electrophoresis was completed for all five generations.

结果

M9液体培养基在LB上的细菌生长和电泳结果如下图所示

图2:第一代的增长大肠杆菌生长在LB板上。第1代生长差异显著图2．这些菌落被挑选出来并用蛋白质电泳分析(图3及4)．

第1代生长差异显著图2．这些菌落被挑选出来并用蛋白质电泳分析(图3及4)．

图3:这些凝胶显示了四种不同甜味剂的蛋白质水平。左边的凝胶显示甜叶菊^®在2-4车道，蔗糖在6 -8车道。右图显示了Swerve^®在3-5街和Splenda街^®在6-8号车道。第一车道是标准车道。

图4:这些是相同的凝胶图2，但主要的21个波段用粉红色表示。

图5:t处理间强度不同的条带。

图中图5显示每个条带的平均强度，至少有一种甜味剂不同。通过双样本t检验，下列条带强度在所列甜味剂和蔗糖之间存在显著差异:蛋白质条带2甜叶菊(p=0.0125);蛋白质组11甜叶菊(p=0.0181);蛋白质组14甜叶菊(p<0.001)和Splenda (p<0.001)。共有21个条带，但仅有4个条带的基因表达差异有统计学意义。M9方法的结果非常有趣，但由于细菌生长较低，无法检查污染物，因此没有继续进行。

在M9/琼脂固体培养基实验后，由于缺乏细胞培养，分析未完成。LB/甜味剂法的结果如下所示。

图6:左边的凝胶是第一代，右边的凝胶是第5代。每个凝胶的第一道是万花筒标准。这些凝胶包括蔗糖(两种凝胶中都有2-4道)，Swerve^®(两种凝胶的5-7车道)和Splenda^®(两种凝胶的8-10车道)。粉红色的带是用来分析蛋白质强度的标记大肠杆菌样本。

以获得所看到的图像图6，使用ImageLab软件(Bio-Rad)添加粉红色条。即使凝胶上的条带不明显，每个通道上也增加了23个条带(软件可以用低得多的强度计算来解释这一点)。这确保了每个波段在不同通道、甜味剂类型和代之间都有可比较的强度测量。Image Lab软件也用于获取原始数据图表。在Gel Doc图像实验室中，凝胶相互标准化，以考虑不均匀的加载和曝光。通过求标准中条带强度与平均条带强度的比值进行标准化。在这些方法中使用的所有凝胶中，发现一个比例是稳定的。万花筒标准中的波段6被用于所有波段的标准化。第5代6级与第1代6级之比为0.831945。因此，将第1代凝胶中的所有波段测量值乘以0.831945以归一化结果。 After normalization, the ratios of band intensities to average band intensity were still the same as before. The analyzed data is shown below in表2和图7和8。

图7:两种凝胶中所有能带的能带强度。浅色表示第1代的结果，并与第5代的深色相关。

表2。所有两代人之间的双样本t检验以及两代人之间比较甜味剂的t检验。黄色突出显示的数字表示p值<0.05，显示统计学上显著的变化。

图8:显示所有条带和两代条带/蛋白质强度差异的3D图。蓝色是蔗糖，红色是Swerve^®黄色代表Splenda^®．前面较浅的颜色代表第一代，而后面较深的相关颜色代表第5代。

表2:所有两代人之间的双样本t检验以及两代人之间比较甜味剂的t检验。黄色突出显示的数字表示p值<0.05，显示统计学上显著的变化。

讨论

假设表达模式会有差异大肠杆菌在不同的人工和天然甜味剂的存在下生长，所收集的数据支持图7和表2。蛋白质合成的差异蔗糖，Swerve^®和善品糖^®可能会影响我们对人类肠道微生物群对这些化学物质的反应的了解。如果同样的变化也发生在人类肠道中，这可能是一个令人担忧的原因，或者这些变化实际上可能意味着有益的肠道细菌可以比以前更好地繁殖。随着蛋白质合成的改变，可能会有不同的化学产物被排泄到人体肠道或被细菌吸收。

结论

为了使这项研究更具包容性，应该测试其他类型的细菌和甜味剂，也许最重要的是，下一步应该专注于确定受上调和下调调控的特定蛋白质的类型。这种分析需要使用特定抗体的Western blotting或RNA测序来识别各种特定基因的基因表达变异。这篇论文中提出的结果表明了一种相关性，但没有解释由于细菌暴露于各种甜味剂而导致蛋白质表达变化的机制。然而，继续这些类型的研究是至关重要的，这样公众就可以意识到替代甜味剂对我们肠道的潜在好处和问题。

参考文献

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