雌雄麻风树部分功能性状的自然变异

摘要

为了评估麻疯树的基因型和表型多样性，从不同的地点收集了大量的候选加树(cpt)农业区域印度。麻葫芦属植物通常为雌雄同体，花序为单性花，但现有库中有一株CPT表现为雌雄同体，花为两性花。雌雄同体植株在株高、分枝数、叶长、叶宽、叶厚、叶片鲜重、叶片干重、叶片干质量含量、保护细胞长、叶绿素含量、气孔导度、净光合速率和叶片蒸腾速率与正常植物比较。根据本研究的结果，认为雌雄同体植物可能更有利于增加产量生物质与麻疯树的雌雄同株植物相比。流式细胞仪分析发现，雌雄同体的植株基因组大小高于雌雄同体的麻疯树，雌雄同体植株的基因组大小比接近2:3。

关键字

麻疯树，雌雄同体，叶绿素，光合速率，流式细胞仪

简介

近年来，由于生产生物柴油、改善土壤质量和土壤固碳，麻疯树正在得到全球的重视和重视。除了它的种子油作为生物柴油的来源，其他植物部分也有几种工业和药用重要性［1-3.］．此外，麻疯树被广泛种植在热带地区，作为农田周围的“活篱笆”，以及通过改善侵蚀荒地的土壤质量来重新造林[4-7］．另一方面，如果麻风树是在可耕地上种植的，它不会干扰其他种植的作物粮食生产［8-10］．此外，作为一种优良的环保可再生生物柴油，麻疯树与其他非食用产油植物(如麻豆、麻豆、辣木、蓖麻、凤尾草等)相比，具有更多的可生物降解生物量。[11，12］．

一般来说，大多数植物都有自然的生存本能，以确保成功繁殖以及物种的延续。有时，当生长条件变得恶劣时，它们的生存机制会随之触发。在这样的条件下，植物会产生带有雄花和雌花的花序，这样它们就可以自花授粉，确保它们的生存。有时，植物会同时开出由两性组成的花，导致雌雄同体。

麻花菊主要是雌雄同株，在同一株植物上同时开雄花和雌花，但偶尔也会出现雌雄同体的花[13］．麻疯树(J. curcas)花序的一般类型(雌雄同株)实际上是无限复合的，即总状花序，具有二元分支模式，雌花位于中央，被雄花包围[14］．在雌雄同株的麻疯树中，一个花序上约有五朵雌花[15］．雌花与雄花的比例为1:20 [16]至1:29 [15］．雌雄同株麻疯树雌花数量少，限制了其果实产量，不仅导致种子产量低，而且导致种子缺乏连续性。

尽管已经对雌雄同株的麻疯树进行了一些生物学研究，包括基因型之间的变异性[17，18]、繁殖生物学特征[19]，以及繁殖制度[20.但迄今为止还没有关于雌雄麻风树形态、生理和遗传成分的广泛研究报道。

顺便提一下，在我们的试验田进行的一项研究中，从不同的地点收集了大量的候选加树(cpt)农业区域评估麻疯树现有的基因型和表型多样性。在这些CPT中，有一个CPT被鉴定为雌雄同体，在生长和发育方面有显著差异形态特征而不是雌雄同株的J. curcas本文对雌雄同体和雌雄同体的麻疯树花型进行了详细分析，这些花型在形态和生理性状上存在较大差异。

材料与方法

植物材料和实验场地位置

t .可可种子以喀麦隆Barombi Kang(西南部地区)苗圃人工授粉获得的。以上述苗圃中Ã①Â′Â′SNK64 × Ã①Â′Â UPA143的4月龄全兄弟后代叶片为材料，进行叶盘测试、总黄酮家族和单株黄酮家族分析。

植物性状的农学实践与研究

种植密度为1111株hm -1 (3 m × 3 m种植距离)。在试验过程中遵循正常的农艺做法移植并在现场建立。本研究从雌雄同株和雌雄同体的田间3个重复中随机选取5株6年生植株，进行形态观察、扫描电镜(SEM)研究、生理测定和流式细胞仪(FCA)分析。

形态特征

选择重要的形态性状进行表型评价，并对雌雄同体和雌雄同体类型的候选加树进行变异估计。观察株高、分枝数、冠层周长、叶面积、叶长、叶宽、叶厚、鲜叶重、干叶重、叶干质量含量(LDMC)、比叶面积(SLA)、气孔密度、气孔频率、气孔指数、保护细胞长度、保护细胞宽度、表皮细胞频率和表皮细胞密度。

每次复制取10片年龄、阶段和大小几乎相同的成熟叶片(每株2片)，记录叶片性状。使用便携式叶面积仪CI-202 (CID, INC.)记录叶面积。美国)。按标准方案计算比叶面积(SLA，即叶面积与叶片干质量之比)和叶片干质量含量(LDMC，即叶片干质量与叶片鲜质量之比)[21］．气孔密度以单位面积上的气孔数计算，气孔指数以给定区域内气孔数与同一区域内气孔及其他表皮细胞总数的比值计算。

生理特点

从雌雄同体和雌雄同体类型的植物中随机选取3个重复的5株植株，从植株顶部收集第5片完全展开的叶片叶绿素含量［22］．用蒸馏水清洗叶片，去除附着在叶片上的杂质，用研钵和杵将1.0 g叶片材料在液氮中研磨。用80%冷丙酮在黑暗中提取叶绿素色素。将匀浆在4°C下3000 rpm离心3分钟，并在波长645 nm、652 nm和663 nm处使用Epoch微板分光光度计(BioTek, US)读取吸光度。

利用便携式Licor XT-6400 (Licor Instruments, USA)在雌雄同株和雌雄同体植物的三次重复试验中，记录了5个相同年龄植物的共10片叶片的叶片气体交换参数，即净光合速率(PN)、气孔导度(gs)和蒸腾速率(Tr)。所有的测量都是在上午10点30分至12点30分之间在无云条件下进行的。水分利用效率(WUE)以净生产力或净光合速率除以单位水分蒸腾速率(PN/Tr)计算。内在水分利用效率以净光合速率与气孔导度之比(PN/gs)估算。采用标准程序记录复制数据的形态、生理和解剖特征的方差分析[23］．

流式细胞仪分析

流式细胞仪分析按照早期研究人员概述的方法进行[24，25］．用锋利的刀片将两种植物大约50 g混合叶片样本切碎，将完整的核释放到Tris - MgCl2缓冲液中，pH为7.5 (0.2 M Tris, 4 mM MgCl2.6H2O, 0.5% v/v TritonX 100, 0.3% β-巯基乙醇和3.0% PVP)。样品在4°C黑暗环境下孵育30分钟后，通过50 μm尼龙过滤器。用1.4 ml 4,6 -二氨基二苯基吲哚(DAPI)在4°C黑暗染色6小时。用Partech PA-II流式细胞仪(Partech, Munster, Germany)分析染色后的完整细胞核。以鸡红细胞(Chicken red blood cells, CRBC)为参考标准，建立麻疯树的内部标准，用于倍性水平或绝对基因组大小的鉴定。以一株雌雄同株麻疯树为材料，建立了二倍体的内部标准。为了鉴定雌雄同体麻疯树的基因组大小差异，将二倍体麻疯树的高斯峰定位为通道-100。

扫描电镜(SEM)

为了对叶片表皮细胞和气孔进行扫描电子显微镜(SEM)研究，从两种植物类型的每三个复制的5片叶片中制备了乙醇固定的成熟叶片小切片(直径约6毫米)[26]，在扫描电镜(型号:LEO 1430 VP)上获得图像。气孔密度、气孔频率、气孔指数(%)、表皮细胞频率和表皮细胞密度均按少数研究者介绍的方法计算[27］．用光镜和扫描电镜(SEM)观察花的细节。

结果

雌雄同体的初步鉴定是通过对麻疯树的目视观察得出的。从现有的麻疯树种质资源库中，在雌雄同株的麻疯树中观察到一个形态和繁殖不相似的植物群体。这些不同的植物具有一些有利的特征，如叶片大、冠层深绿色、茎多分枝和雌雄同株的花(表1)．

表1。麻疯树不同基因型的来源及地理位置。

形态变化

本研究获得的生长数据显示，麻疯树雌雄同体在基本结构和形态上存在差异。研究还发现，与正常(雌雄同株)麻疯子植株相比，雌雄同株具有更好的建立和旺盛的生长速度。雌雄同体植株的株高、分枝数(株-1)和冠层周长显著高于雌雄同体(p< 0.001) (表2)．

表2:雌雄同株和雌雄同体的葫芦生长和叶片特征。

雌雄同株的叶片大小、叶片结构、叶片颜色和叶缘均有差异。雌雄同体和雌雄同体植物的花和果实形态在(图1)．花序上有大量花(25-200朵)，雌雄同株和雌雄同体的植物都有二歧聚伞花序。然而，雌雄同株的雌花在完全展开时(约2.0 cm)，雌雄同株的花在完全展开时(约2.5 cm)略大。在雌雄同株的麻疯树中，雄花和雌花分别出现在同一花序内是一个显著的特征。

生理变化

通过生理参数测定，观察雌雄同体和雌雄同体植物生理性状的变化(表3)．结果表明，麻疯树雌雄同株和雌雄同株的生理性状差异较大。雌雄同体植物叶片的保护细胞长度较长。总叶绿素、叶绿素-a和叶绿素-b在雌雄同体叶片中显著升高(p< 0.05)。雌雄同体的叶绿素总量在1.90 mg g-1 ~ 2.30 mg g-1之间，平均值为2.13±0.03 mg g-1，而雌雄同体的叶绿素总量在1.82 mg g-1 ~ 2.15 mg g-1之间(平均值为2.05±0.02 mg g-1)。

表3:雌雄同体和雌雄同体麻疯树的生理参数。

在雌雄同体植株中，叶绿素-a和叶绿素-b的平均含量分别为1.66±0.02 mg g-1和0.47±0.01 mg g-1，在雌雄同体植株中，叶绿素-a和叶绿素-b的平均含量分别为1.61±0.02 mg g-1和0.44±0.01 mg g-1。雌雄同体植物的净光合速率、气孔导度和叶片蒸腾速率也显著高于雌雄同体植物。雌雄同株平均净光合速率为18.22±0.16 μmol CO2 m-2s-1，雌雄同株净光合速率为15.8±0.16 μmol CO2 m-2s-1。虽然雌雄同体植物的水分利用效率和内在水分利用效率略高，但不显著高于雌雄同株植物。

基因组大小变异性

在进行形态学和生理学研究后，发现雌雄同株和雌雄同体植物有明显的变化。为了在倍性水平上区分植株，采用流式细胞仪对雌雄同株和雌雄同体的开花植株的倍性和基因组大小状况进行了基础研究。由于细胞核DNA含量反映了细胞的倍性，估计DNA含量常用于倍性测定。

测定了麻疯树倍性水平。对浸渍植物组织进行核DNA高分辨率流式细胞仪检测。从基因组大小来看，除雌雄同体植物为三倍体(3n=33)外，所有开花植物均为二倍体(2n=22)。雌雄同体植物的基因组大小高于雌雄同体植物，雌雄同体(2C)和雌雄同体(3C)的DNA比接近2:3，证实雌雄同体植物在自然界中是三倍体(图2)．从图中可以明显看出，将样品细胞核对应的G1峰的相对位置与从已知DNA含量的植物中分离出来的细胞核进行比较，可以准确地测定未知DNA含量。

解剖变异

对雌雄同体和雌雄同体的麻疯树(J. curcas)的叶片和生殖结构进行了扫描电镜(SEM)分析。图3)．无论是雌雄同株还是雌雄同株，叶表皮细胞均呈五角形至多边形型，排列紧密。雌雄同体植物的表皮细胞大小略大。两种植物叶片的气孔均为无细胞型和无四细胞型。单位面积上，雌雄同体叶片气孔密度较低(0.516)，气孔频率较低(8.06)，气孔指数较高(5.40)，保护细胞长度较高(29.17 μm)。而同株植物气孔密度较高(0.552);气孔频率为8.62，保护细胞宽度为8.31 μm。雌雄同株植物的平均表皮细胞频率和气孔密度均高于雌雄同株的麻疯树(表4)．

表4:麻疯树雌雄同体和雌雄同体植物叶片和气孔的扫描电镜分析。

雌雄同体花的雄蕊位于花柱长、花药短的下部，花药呈一层状排列，雄蕊呈两层状排列，花粉囊张开。雌雄同体花的萼片和花瓣比单性花大。雌雄同株的花药囊发育，花药开裂，花粉粒从花药中流出;雌雄同株的花自不育，花药无开裂现象。

雌雄同株和雌雄同株的柱头均为三裂，裂片明显，花柱较大(图3)。但雌雄同株花的柱头细胞与雌花雌雄同株植物的柱头细胞结合紧密。雌雄同体果实子房胚珠发育不全。两种花发育的果实大小相同，呈椭球形和三裂形，但在雌雄同体植物中未观察到结实率。

讨论

在本研究中，雌雄同体植物的花都具有雌雄同体的性质，但未发现完整的结果。这种植物确实显示出结果，但作为真正雌雄同体的特征，种子不发达。为了理解发育问题，雌雄同体麻疯树是不适当性别的无功能不育性器官的雏形。

雌雄同体花的形态可以被看作是在一个多面发育框架内的修饰的结果，生殖器官功能的丧失可能是由于单个性器官的成熟状态，以及由于染色体组数目不均匀、减数分裂不规则和高频率的非整倍体的存在而导致的果实发育的不规则。

在早期的研究中，多倍体导致的形态性状变大也是众所周知的[28-30.］．倍性水平影响拟南芥(Arabidopsis thaliana, L.)的许多形态和适应性性状，包括气孔大小、花大小和种子重量[31］．

气孔和叶表面表皮细胞的结构位置是决定植物系统光合作用速率和水分利用效率的重要因素。在本研究中，观察清楚地表明，与同株植物相比，雌雄同体植物的单位面积表皮细胞及其频率要低得多。雌雄同体植物叶片的保护细胞长度较长。正如早期研究人员所报道的那样，保护细胞的长度是可能鉴定植物倍性增加的良好指标[32-34］．不同麻疯树基因型的同龄植物在不同或同一农业气候带生长时，生理性状存在很大差异，且冠层扩张(冠层容积)不同[16，35］．

在本研究中观察到的较高的生长率和增加的生理性状可以归因于气孔的大尺寸和提高的光合作用速率，从而提高了生长速度和生长速度生物质一些早期研究人员报告的产量[36-39］．植物物种对环境的适应，其生长和产量策略取决于光合作用、蒸腾和气孔导度的速率[40］．前人研究表明，基因组大小和倍性影响植物生物量[41，42］．

早期的研究人员观察到，雌雄同体植物在野生植物种群中相对常见，这是产生未减少的二倍体配子的结果[43］．研究还指出，雌雄同体个体在减数分裂时由于染色体配对不规范而导致生育力水平较低，而三倍体个体产生的大多数配子可能是单倍体[44］．

在我们的研究中记录的某些形态学和生理性状的增加是基因组大小或倍性水平增加的结果，作者也认为[45］．对其他植物，如杨树、柑橘、小柑橘和柳属也有类似的观察[34，46，47］．

本研究发现，麻疯树雌雄同体植株具有巨大的植株生长能力，其基因组大小和植株数量均有所增加生理学．植物的高生长特性将有助于减少全球温室气体，并将使更多的绿色荒地。此外，雌雄同体植物可用于观赏、道路围栏、燃料和开发六倍体。

结论

在过去的几十年里，许多多角形观赏花卉和果树获得了很大的商业价值。在同一年龄组的麻疯树雌雄同体基因型中观察到的更高的高度、增加的分支数量和增强的光合作用水平可归因于植物的多倍体性质。即使在产量上有一定的缺陷，但长期研究花期、花粉形成、果实败育，用秋水仙碱人工使正常二倍体植株染色体加倍后进行杂交试验，可以培育出经济产量更高的良种。

此外，麻花菊的双性生殖加入将是有价值的生物屏障，用于保护野生动物、景观开发和通过现代生物技术工具(即诱导微核和微原生质体融合技术)诱导六倍体[48]，从而产生体积更大、含油量更大的种子，将来用于生产生物柴油。

这表明，雌雄同体的麻疯树还可用于生活围栏、侵蚀荒地的造林、缓解全球变暖和药用价值，因此，雌雄同体种植具有高度的经济和生态友好性，且易于通过茎插繁殖。本研究结果将为麻疯树雌雄同体种质改良提供初步的信息和重要的线索。

确认

作者感谢新德里CSIR的财政支持。分析科学学科和CSIR-CSMCRI的集中仪器设施因其支持而得到认可。

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