从毒害神经的神经细胞保护的格列卫prp106 - 126诱导死亡

文摘

朊病毒疾病是致命的神经退行性障碍和对动物和人类有很大的危险。但是现在,没有药物和措施用于治疗和预防这种疾病。格列卫神经退化是可以预防的,调节c-Abl酪氨酸激酶。然而,格列卫对朊病毒疾病的保护作用仍然是未知的。在目前的研究中,格列卫的影响对朊病毒neurotoxic-induced神经元死亡调查这荧光测定,CCK8化验,TUNEL、TEM、免疫荧光染色和免疫印迹。结果表明,格列卫可以隔阻prp106 - 126在Neuro2A细胞介导神经毒性,救援从prp106 - 126诱导神经元凋亡和废除prp106 - 126诱导线粒体损伤。这项研究首次表明格列卫的保护作用与prion-mediated神经毒性。我们的研究结果表明,格列卫治疗可能是一种新的治疗策略治疗prion-mediated神经毒性。

关键字

朊病毒疾病;prp106 - 126;细胞凋亡;神经毒性;线粒体

介绍

朊病毒疾病是一个家庭的致命的神经退行性疾病,影响各种哺乳动物物种,包括动物的痒病、牛海绵状脑病(1- - - - - -4)和人类克雅氏病和致命的家族性失眠5- - - - - -8]。这些病态的特点是海绵状变性或空泡形成神经纤维网,胶质激活神经元死亡的细胞凋亡(9- - - - - -11)和积累protease-resistant形式的细胞的朊蛋白(PrP)^C)称为痒病PrP (PrP^Sc)在大脑中12]。传染性PrP^Sc可能作为一个模板,促进众多PrP的转换^C对PrP^Sc和放大的传染性和有毒的物种。毒害神经的朊病毒蛋白片段prp106 - 126展品和PrP物化和致病特性相似^Sc;特别是,prp106 - 126形成淀粉样原纤维β-sheet含量高,显示部分蛋白酶K电阻和抒发神经毒性体外(13- - - - - -15]。这些纤维导致直接神经损伤与细胞表面交互组件;这样的交互引发细胞凋亡信号。因此,prp106 - 126是常用的作为一个模型系统研究prion-induced神经退化(16- - - - - -18]。格列卫(也称为甲磺酸伊马替尼),作为一线药物,已被成功地用于(19]。格列卫的一些生理效应与相关的神经保护作用有关阿尔茨海默病和保护作用Aβ毒性行为和形态水平(20.,21]。但格列卫的影响prion-mediated神经毒性仍不清楚。的影响来研究格列卫的监管prp106 - 126诱导细胞凋亡实验进行Neuro2A细胞。结果表明,神经元细胞暴露于格列卫抑制prp106 - 126诱导神经毒性和线粒体功能障碍和证明了格列卫可能用于治疗神经退行性疾病,包括朊病毒疾病。

材料和方法

细胞培养

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞系(Neuro2A)从协和医科大学,获得细胞文化中心(中国,北京)和在细胞培养和维护孵化器有限公司5%₂和37°C。

朊蛋白肽

毒害神经的朊病毒蛋白片段(prp106 - 126)买来Sangon生物技术(上海,中国)和溶解在0.1 mol / l PBS的浓度为1毫米,和偏离总在37ºC 12 h。最后肽浓度的实验100μM。

Thioflavine-T荧光测定

原纤维形成prp106 - 126测量使用Thioflavine-T(阻)荧光试验根据公开发表的报告(22]。

细胞生存能力分析

细胞生存能力评估使用CCK-8化验(Beyotime生物技术、湖北,中国)。表达的细胞成活率的比例控制。

TUNEL分析

TUNEL分析是用来测量细胞的程度细胞凋亡使用一个原位Apo-BrdU DNA碎片分析工具包(BioVision、旧金山、钙、美国),遵循制造商的指示。

免疫印迹

短暂,等量的蛋白质分离通过sds - page凝胶,10 - 12%和分离蛋白转移到硝化纤维膜。使用的抗体免疫印迹是细胞色素c(圣克鲁斯、钙、美国),伯灵顿(美国Cambridge, MA),女子(美国BD-Pharmingen)β-actin (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),anti-caspase9 (Boisynthesis生物技术,北京),或anti-active-caspase3(生物合成生物技术)。膜与TBS-T洗,然后二次抗体孵育,山羊anti-mouse免疫球蛋白或anti-rabbit免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶(Beyotime生物技术、湖北,中国)。免疫反应性的蛋白质膜孵化后被可视化增强chemifluorescence (ECF)试剂5分钟,在一个图像系统(Versadoc Bio-Rad)。

免疫荧光染色

Neuro2A细胞固定在4%多聚甲醛在室温下为20分钟。山羊血清添加和孵化1 h。兔子anti-active caspase-3和兔子anti-caspase-9补充说,一夜之间分别和孵化4ºC。山羊anti-rabbit免疫球蛋白Cy5和FITC -共轭抗体(生物合成生物技术,北京)添加和孵化在37ºC 1 h。DAPI(武汉、湖北、中国)添加和孵化5分钟。神经元终于安装与甘油的缓冲和一个奥林巴斯显微镜下检查。

透射电子显微镜(TEM)

Neuro2A细胞治疗在PBS洗两次,使胰蛋白酶化,resuspended包含冰冷的5%戊二醛固着在0.1钠甲次砷酸盐缓冲(pH值7.4)在15分钟4ºC,然后离心机。细胞颗粒固定4 h。细胞颗粒进一步OsO固定在1%₄在0.1 M在冰甲次砷酸盐缓冲钠1 h和丙酮脱水。细胞颗粒是嵌入在环氧树脂812和聚合60°C 48 h。超薄部分(70海里)获得在徕卡Ultracut开普敦大学超微切片机(奥地利维也纳)和复染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅之前jem - 2100 TEM下观察(JEOL、日本)。

统计分析

所有化验进行三次。数据表示为±SD方法。参数数据分析使用学生的学习任务或单向方差分析其次是事后土耳其测试使用SPSS软件(版本13.0:SPSS Inc .、芝加哥、IL,美国)。* * * P < 0.05或P < 0.01被认为是显著的。

结果

格列卫治疗抑制prp106 - 126在Neuro2A细胞介导神经毒性

这是证明存在的淀粉样蛋白聚集prp106 - 126年准备是被这荧光测定(图1一个)。然后,格列卫的作用是检查prp106 - 126诱导神经元死亡。Neuro2A细胞治疗与不同浓度的prp106 - 126 0, 6、12、18和24 h。后来,Neuro2A细胞生存能力被CCK-8试验检测。我们发现prp106 - 126治疗诱导神经元死亡文化的剂量和时间的方式(图1 b)。然而,格列卫预处理抑制prp106 - 126剂量依赖性的方式诱导细胞死亡。此外,预处理与5或10μM格列卫24 h完全废除prp106 - 126诱导神经元死亡。格列卫治疗并不影响神经生存。结果表明,格列卫保护神经元免受prp106 - 126诱导的细胞死亡(图1一个和1 b)。

a . Thioflavine-T(阻)荧光测定显示,prp106淀粉样蛋白聚集的存在- 126制剂。b . Neuro2A细胞治疗prp106 - 126和在文化逐渐去世了。数据表示为一式三份的平均数±标准差实验。(* p < 0.05;* * p < 0.01)。

格列卫治疗保护神经元免受prp106 - 126诱导细胞凋亡

确定prp106 - 126诱导神经细胞凋亡机制,格列卫是否可以保护细胞免受prion-mediated神经毒性被TUNEL检测,透射电子显微镜(TEM)、immunoflurescence染色和免疫印迹。最初,Neuro2A细胞有或没有5μM格列卫预处理被孵化24 h,然后在100年暴露μM prp106 - 126。之后,格列卫的影响在prp106 - 126 -介导的神经毒性被TUNEL Neuro2A细胞研究。TUNEL染色显示,仅与prp106 Neuro2A细胞的治疗——126年导致神经元凋亡。然而,格列卫预处理神经元显著抑制prp106 - 126诱导的细胞死亡(图2一个)。

确定prp106 - 126诱导神经细胞凋亡的机制,是否prp106 - 126治疗激活caspase-9 caspase-3,格列卫是否会影响激活这些还被免疫荧光染色研究。激活的亚细胞分布caspase-9和caspase-3 Neuro2A细胞暴露于prp106 - 126有或没有格列卫预处理24 h进行检测荧光显微镜。结果表明,神经元接受prp106 - 126单独激活caspase-9 caspase-3,但Neuro2A细胞使用格列卫缓解prp106 - 126诱导细胞死亡和激活caspase-9和caspase-3 (图2 b)。与这些研究结果一致,蛋白免疫印迹结果表明,乳沟caspase-9和caspase-3各自的子单元p³⁵和p¹⁷在Neuro2A细胞使用格列卫的显著降低。激活caspase-9 caspase-3级联进行光密度定量分析;结果表明,格列卫治疗Neuro2A细胞显著减少caspase-9的乳沟和caspase-3相比prp106 - 126治疗组;分别减少了61%和57% (图2一个和2 b)。

a .神经元使用格列卫几乎降低了反对prp106 - 126 -介导的神经毒性(Bar = 20μm)。b .使用格列卫缓解Neuro2A细胞激活caspase-9(绿色、酒吧= 40μm)和caspase-3(红、酒吧= 20μm)在反对prp106 - 126诱导细胞死亡。细胞核被DAPI染色为蓝色。

确认是否发生形态变化响应prp106 - 126治疗,Neuro2A细胞使用TEM观察。结果表明,典型凋亡特征染色质重组等凝结或释放到细胞质中,核仁凝结(图3 c)和形成凋亡的身体(图3 d),观察prp106 - 126细胞治疗。TEM显示神经元细胞器的格列卫治疗仍基本完整(图3 e),虽然显示的细胞线粒体变形异常肿大嵴和出现胞外分泌的现象(图3 f)。

结果可以证明,格列卫块prp106 - 126诱导细胞凋亡。

格列卫治疗废除prp106 - 126诱导线粒体损伤

研究线粒体形态的变化是否发生在应对prp106 - 126治疗,TEM观察线粒体超微结构。多样性和多种形式的线粒体结构和形态特征的观察在不同的治疗方法。在正常的神经细胞,线粒体是密集的,发现椭圆或圆形的形式与完整的嵴(图3一)。相比之下,Neuro2A细胞感染prp106 - 126显示异常线粒体形态特征。影响线粒体出现水泡,肿胀,空泡的外观、数量减少、集成和破裂嵴消失,在细胞质中引起自噬在24 h感染后一个(图3 b)。此外,核仁凝结,异染色质着边和大量的自噬体(图3 c)观察和凋亡的身体和自溶酶体形成(图3 d)出现在损伤细胞。神经元的线粒体与格列卫和治疗prp106 - 126显示正常形态或轻度肿胀特征和完整的嵴(图3 e),尽管一些细胞显示变形与异常的肿胀嵴线粒体(图3 f)。这些结果表明,格列卫治疗预防prp106 - 126诱导线粒体损伤。Autophagolysosomes。

答:细胞核具有明显的正常形态nucleolu(箭头)和线粒体与完整的嵴。b被打乱的线粒体嵴变得肿胀大液泡(箭头)。有一些自噬在细胞质(箭头所指)。c .核仁凝结(箭头)和大量的自噬体(箭头)的损伤细胞。d .凋亡体(箭头)和自吞噬泡(箭头所指)出现在损伤细胞形成。e .完整线粒体轻度肿胀,嵴(箭头所指)。(F)有一些异常的线粒体(箭头)在胞浆和胞外分泌在神经元使用格列卫的检查。

讨论

朊病毒是致命的神经退行性疾病传染性疾病,但目前没有开发的治疗或预防方案。朊病毒疾病的主要成分是朊蛋白的异常对碘氧基苯甲醚(PrP^Sc)[23,24]。prp106 - 126维护整个病理PrP的毒害神经的特性^Sc和通常被用作模型研究朊病毒疾病的机制(25]。尽管prp106 - 126诱导的神经元死亡的机制仍然知之甚少,prp106 - 126诱导细胞凋亡是由氧化应激和线粒体中断在神经母细胞瘤细胞26,27]。临床药物,如褪黑激素、姜辣素和白藜芦醇,可以保护神经元免受prp106 - 126诱导神经元死亡。虽然格列卫,c-Abl酪氨酸蛋白激酶的抑制剂,大大提供了有效的治疗神经退行性疾病和慢性粒细胞白血病,格列卫朊病毒疾病的影响还没有被完全理解。

先前的研究表明,格列卫PrP的水平降低^Sc在朊病毒感染ScN2a细胞以时间和剂量依赖的方式。PrP^Sc明显减少了格列卫治疗scrapie-infected小鼠脾脏以及ScN2a细胞。这些结果表明,格列卫可能的临床利益当它用作neuro-chemotherapy朊病毒疾病。然而,无论是腹腔内还是intracerebroventricular交付格列卫施加任何PrP^Sc间隙在中枢神经系统的影响。格列卫进入大脑的直接注射的剂量400μg /公斤/注射对PrP没有任何影响^Sc积累在大脑scrapie-infected小鼠的存活时间。化疗的失败可能是由于细胞吸收和排出的药物之间的不平衡,导致细胞内药物浓度不足。此外,PrP^Sc再次出现在脾而不是ScN2a细胞停止药物治疗时,指示在PrP各种细胞类型的不同反应^Sc格列卫(间隙的28,29日]。在目前的研究中,证明了格列卫起到了保护作用对prp106 - 126诱导神经元死亡通过调节线粒体稳态和缓解caspase-9的激活和caspase-3通过减少caspase-9 caspase-3和形成的乳沟子单元,如p35区域和p17。因此,格列卫不仅参与PrP^Sc间隙也参与抑制prp106 - 126诱导神经元凋亡。所以,格列卫可能作为一种潜在的治疗药物开发对朊病毒感染。

自噬可能导致有益的或有害的影响,比如细胞生存或细胞死亡(30.]。例如,自噬可能诱导细胞死亡在神经退行性疾病中总量积累,导致病理条件(31日]。锅等人的存在汽车溶酶体和自噬体死亡Neuro2A细胞暴露于prp106 - 126肽(32]。在这项研究中,大量的汽车溶酶体,自噬体也观察到神经元接受prp106 - 126。一方面,在很多情况下自噬可以加速疾病的进展;另一方面,自噬抒发对线粒体损伤的保护作用[33]。其他研究已经表明,自噬可以防止神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病和帕金森疾病,通过诱导autophagy-mediated清除线粒体异常(34,35]。此外,药物,如褪黑激素(36和白藜芦醇37),保护神经元免受prp106 - 126通过激活自噬通路介导神经毒性。有趣的是,少量的汽车Neuro2A细胞溶酶体观察使用格列卫和暴露于prp106 - 126。然而,我们的研究结果表明,Gleevec-induced c-Abl抑制酪氨酸激酶阻止汽车溶酶体的形成和汽车时间Neuro2A细胞和保护神经细胞的朊病毒fragment-induced细胞死亡。然而,自噬的预防格列卫也可以另一个后果,除了mitochondrion-mediated细胞凋亡的抑制作用,而不是直接抑制自噬。这些差异可能表明自噬与各种在朊病毒疾病进展过程不同阶段的细胞损伤,细胞外环境和治疗干预措施38]。自噬是否具有保护或有害的作用神经退行性疾病尚未建立。这项研究首次证明治疗PrP106格列卫的保护作用- 126 -介导的神经毒性。格列卫可能的主要因素为related-prophylactics prion-mediated神经细胞死亡和线粒体损伤。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金项目(31372407)。

引用

1. 庄,et al .档案搜索历史典型羊搔痒症的发病率揭示混合感染的证据。J创微生物学报。2015;96:165 - 178。
2. 阿诺德·M和a Ortiz-Pelaez古典的流行的进化羊搔痒症的发病率在英国使用监测数据在2005和2012之间。Prev兽医医学。2014;117:242 - 250。
3. Boujon C, et al。典型的牛海绵状脑病的变体:罕见疾病BSE监测和控制的后果。瑞士拱Tierheilkd。2016; 158:171 - 177。
4. Greenlee JJ和Greenlee MH。牲畜的传染性海绵状脑病。ILAR j . 2015; 56: 7-25。
5. de Villemeur结核病。克雅二氏症。Handb神经。2013;112:1191 - 1193。
6. Atalay FO, et al。克雅二氏症:四个病例报告和文献之回顾。Turk Patoloji Derg。2015; 31:148 - 152。
7. Forloni G, et al。预防研究受试者的风险致命性家族失眠症:创新的罕见疾病的方法。朊病毒。2015;9:75 - 79。
8. Llorens F, et al .致命性家族失眠症:临床方面和分子改变。咕咕叫神经>众议员2017;下午。
9. 歌Z,神经退行性病变等。分子机制由传染性海绵状脑病的功能失调的亚细胞的细胞器。Acta Biochim Biophys罪。2013;45:452 - 464。
10. Saa P, et al . prion-induced机制退化。专家摩尔地中海牧师。2016;18:e5。
11. 歌ZQ、et al。过度的BAT3减轻朊蛋白片段prp106 - 126诱导神经细胞凋亡。中枢神经系统>其他。2014;20:737 - 747。
12. Prusiner某人克雅二氏症和痒病朊病毒。阿尔茨海默说Assoc Disord。1989; 3:52 - 78。
13. Heegaard点,et al .淀粉样蛋白聚集的朊病毒肽prp106 - 126年稳定的氧化和树枝状分子的作用。2月。2004;577:127 - 133。
14. 施F, et al .抑制吞噬作用减少了经典激活BV2 amyloidogenic碎片引起的小胶质细胞的β-淀粉样蛋白和朊病毒蛋白质。Acta Biochim Biophys罪。2013;45:973 - 978。
15. 摩尔RA, et al .淀粉样蛋白质组学分析和nonamyloid朊病毒疾病表型都揭示了neuropathogenesis的共同和不同的机制。J蛋白质组研究》2014;13:4620 - 4634。
16. 顾Y,等。106 - 126朊病毒肽调节细胞的朊病毒蛋白的聚合和诱发潜在的神经毒性跨膜PrP的合成。生物化学杂志。2002;277:2275 - 2286。
17. 戴安娜圣,et al。PrP(106 - 126)在生理条件下不与细胞膜相互作用。Biophys j . 2008; 95:1877 - 1889。
18. 佩雷斯M, et al .朊病毒肽诱导神经细胞死亡途径涉及糖原合成酶激酶3。Bioche j . 2003; 372:129 - 136。
19. 黄DY, et al . STI571减少TRAIL-induced在结肠癌细胞凋亡:c-Abl由死亡受体激活导致压力kinase-dependent细胞死亡。J生物医学Sci.2012; 19:35。
20. Cancino GI, et al . STI571可防止细胞凋亡,τ磷酸化和行为障碍的阿尔茨海默氏症引起的β-淀粉样蛋白沉积。大脑。2008;131:2425 - 2442。
21. Sutcliffe詹,et al .外围减少β-淀粉样蛋白足以减少大脑中β-淀粉样蛋白:对阿尔茨海默氏症的影响。J >研究》2011;89:808 - 814。
22. 莱文人力资源。Thioflavine T合成阿尔茨海默病与β-淀粉样蛋白肽:检测淀粉样蛋白聚合的解决方案。蛋白质科学。1993;2:404 - 410。
23. Aguib Y, et al。由海藻糖抵消细胞自噬诱导朊病毒感染。自噬。2009;5:361 - 369。
24. Sakudo和Ikuta k .朊蛋白功能和功能障碍朊病毒疾病。咕咕叫地中海化学2009;16:380 - 389。
25. Ugalde CL, et al。朊蛋白的致病机制,amyloid-β和α-synuclein错误折叠:朊病毒蛋白寡聚物的概念和神经毒性。J Neurochem。2016; 139:162 - 180。
26. Thellung年代,地图等人p38激酶介导的细胞死亡引起prp106 - 126 SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。一般人说。2002;9:69 - 81。
27. 元F, et al。细胞的朊蛋白(PrPC)神经元的细胞转换为PK-resistant蛋白质氧化压力下,主要由线粒体损伤朊病毒疾病。J摩尔> 2013;51:219 - 224。
28. Yun西南,et al .酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼延迟朊病毒对于通过抑制朊病毒传播的边缘。J Neurovirol。2007; 13:328 - 337。
29. Ertmer, et al .酪氨酸激酶抑制剂STI571诱发细胞间隙朊病毒感染细胞的朊蛋白。生物化学杂志。2004;279:41918 - 41927。
30. 马里诺G和c Lopez-Otin自噬:分子机制、生理功能和人类病理学的相关性。细胞摩尔生命科学。2004;61:1439 - 1454。
31. Shintani T和Klionsky D j .自噬在健康和疾病:一把双刃剑。科学。2004;306:990 - 995。
32. 锅,等人c-Abl酪氨酸激酶介导神经毒性朊病毒通过调节线粒体稳态Peptide-Induced神经细胞凋亡。摩尔一般。2014;49:1102 - 1116。
33. Graef M和Nunnari j .自噬调控线粒体的作用。自噬。2011;7:1245 - 1246。
34. Filomeni G, et al。神经保护的山柰酚rotenone-mediated模型中自噬的急性毒性:可能对帕金森病的影响。一般人衰老。2012;33:767 - 785。
35. Heiseke, et al .锂引发间隙抗蛋白酶朊蛋白的朊病毒感染细胞自噬的诱导。J Neurochem。2009; 109:25-34。
36. Jeong JK, et al . Melatonin-induced自噬可防止人类朊病毒protein-mediated神经毒性。J松果腺杂志2012;53:138 - 146。
37. Jeong JK,等。自噬引起白藜芦醇可以防止人类朊病毒protein-mediated神经毒性。> > 2012;73:99 - 105。
38. Eskelinen EL。成熟的哺乳动物细胞中自噬空泡。自噬。2005;1:1-10。