新方面中药材料鉴定DNA条码技术

文摘

众多的有害反应有压倒性的有关滥用药用植物成分。这种现象已经引起了世界范围内的需求在药品安全的应用程序。DNA条码技术提供了一个强大的手段来补充区分中国药用植物形态学和化学过程。因此,DNA条码系统应包含质量信息的不断更新关于真实的植物材料和潜在的替代品或添加剂。最近的成就DNA条码技术的新领域,识别中国提供新的方面草药。几个DNA区域(其ITS2, psbA-trnH、rbcL matK)已经建立了作为中药热局部条形码。本文总结了DNA条码技术的重要进展对中国草药材料认证。

关键字

DNA条形码;中药材料;它的;ITS2;psbA-trnH

介绍

全世界已使用草药治疗和治愈疾病,和证据确凿的历史悠久。世界卫生证明,80%的全球人口利用中药重要的药用价值和保健功效(http://www.worldwildlife.org/what/globalmarkets/wildlifetrade/faqsmedicinalplant。html)。不时地,”的目的和假药的草药的主要关注用户,病人和行业的安全性和有效性。传统方法验证草药材料使用形态,微观和化学方法,他们继续提供药典中使用的主要方法。然而,这些技术有其局限性。如传统分类鉴定的物种通常需要长期训练的专业知识和经验。草药的掺假药材种植草药市场已成长为一个全球性的问题。使用马兜铃草药作为一个例子,家里的马兜铃科物种共享常见的添加剂和相似的形态学特征在传统中药中,增加了混乱的风险在消费者(1,2]。Akebiae主茎来自木通属quinata,正义与发展党。trifoliata或正义与发展党。trifoliata var。南极光(Mutong MT)总是取代那意味着manshuriensis(Guanmutong GMT)。主茎Aristolochiae Manshuriensis。包括马兜铃酸(AA)、nitrophenanthrene羧酸来源于马兜铃物种,这可能会导致肾病(3]。Aristolochi酸肾病(长)是一种快速进步的肾间质纤维化导致终末期肾功能衰竭疾病和移行细胞恶性肿瘤,于1991年首次报道在比利时,超过100名患者在服用膳食补充剂含有中草药Stephaniae Tetrandrae基数(Fangji FJ)来源于野生抚育是在留意富含AA-containing草来源于取代了马兜铃fangchi(Guangfangji GFJ) (4]。随后,马兜铃草掺假的物种一直是一个世界性的问题,美国食品和药物管理局警告安全的植物产品和饮食疗法包含AA (5]。然而,许多马兜铃物种仍然是最常见的药用在亚洲和美洲(6]。值得注意的是,不良反应由于滥用、错误识别和掺假的草药含有AA可导致DNA分子核苷酸AT-TA颠换突变,绑定到诱变AA (3,7]。因此,准确、快速和稳定的特定标记允许非专业人员识别中草药材料从标准的DNA序列无疑是有益的。

DNA条形码是一个相对较新的概念提供快速、准确、可自动化的物种识别使用一个短的DNA片段的一部分基因组。这个概念是开始与赫伯特的种子植物8),表明它可能是在200年获得100%的准确率识别密切相关的物种鳞翅类利用线粒体基因的细胞色素C氧化酶亚基(COI)。但线粒体基因COI的部分将是一个更有挑战性的任务由于序列进化的速度较慢,在高等植物比动物中观察到线粒体。陆地植物的理想DNA条形码应该满意三个标准:(i)包含最大了解遗传可变性和分歧;(2)适当的守恒的侧翼网站开发通用引物生物信息学分析和应用;(3)拥有一个足够短的DNA序列,以促进DNA提取、PCR扩增。因此,目前没有标准协议在陆地植物DNA条码技术。

首先,最线粒体基因以及单份基因在核基因组中,条形码的候选人已被移除,因为低利率的序列变化和通用引物PCR扩增的不足9]。然而,内部转录间隔区(ITS)核核糖体DNA除了5.8秒显示广泛的实用程序在陆地植物(蕨类植物除外)并已被视为潜在的条形码轨迹(9,10]。其次,分子系统的调查在叶绿体和它的内含子。例如,克雷斯et al。9]相比几个位点的烟草和颠茄7植物家庭和共有99种归属感在53科88属,他们定意,psbA-trnH垫片及其可以作为大多数被子植物质体地区容易PCR扩增在陆生植物的延伸范围广。然而,易于放大和序列生成和通用引物对反应条件确定这双未能提供特定标识符的全部成员苏铁目(11]。分析超过1000:从基因库发现:可以验证样本序列对同类物种(大约85%的两两比较12]。在其他研究中,歧视时增加约88%的组合非编码trnH-psbA间隔和质体编码基因:使用跨一组48属来自43个家庭,完全不同物种96 (13]。拉哈伊et al。14]分析> 1000中美洲兰花的两名代表(295种),发现一段质体基因可能是一个假定的条形码位点流动的植物。,大量的标记的质体基因组主要在四个编码(rpoB、rpoC1 matK, rbcL)和三个非编码(trnH-psbA, psbK-psbI和atpFatpH)地区显示高质量DNA条形码在陆地植物9,14- - - - - -17]。最近,压倒性的里程碑式的文章发表的关于DNA条码技术(表1)的高守恒的网站提供中国药材鉴别的新方法。

表1:一些应用程序的DNA条码识别的草药材料起2003年出版。

中草药材料可以取代偶然或故意材料从物种密切相关或不相关的植物60,61年]。掺假的草药材料经常发生,因为(i)的材料没有明显区别形态特征(2)的材料有相似的名字(iii)的材料是昂贵的和有价值的草本植物,但替换是经济。政府官员和制药业有责任保证任何药材是真实的,为消费者,他们是安全的。专家,就难以正确诊断的物种。因此,使用标准DNA条形码可以提供一个实际的解决歧视中草药原料和添加剂。

DNA条形码识别中药药材

添加剂的草药材料大约源自密切相关的物种或植物部分获得类似的形态。DNA条形码在线数据库,可以识别中药材料在不同分类的各种参考序列。几个DNA等地区,ITS2, psbA-trnH, rbcl, matK建议作为重要的潜在的候选植物DNA条形码。使用的通用引物扩增和测序的条码区域给出了表2。

表2:通用引物PCR扩增、DNA测序。

CBOL植物工作组的性能相比七个候选人质体DNA区域(matK基因:基因,rpoB基因,rpoC1基因,trnH-psbA垫片,psbK-psbI间隔,和atpF-atpH垫片)907年样本代表38裸子植物,67隐花植物,445被子植物物种和推荐的组合:+ matK作为标准植物标记(66年]。生命的条码数据系统(粗体)建立了加拿大中心和构建第一个在线DNA条码技术数据库(http://www.boldsystems.org)。这个数据库可以存储、分析和发布DNA条形码,免费公开可用的组装分子和桥梁的复兴中国的生药鉴定(67年]。药材DNA条形码数据库完全18436序列中可用1259种,其中包含基本信息、所有质体DNA区域和核的内部转录间隔区核糖体的顺反子药材(68年]。基本系统识别中药材料建立了基于ITS2 + psbA-trnH包括78847的两个位点序列从23262种69年]。系统总结ITS2核心标准植物条形码和实用性psbA-trnH区域可以被看作是一个补充条形码在药用植物。在这里,我们总结主要研究DNA条码技术的进步草药药物学。

核核糖体内部转录间隔区(ITS)地区

内部转录间隔区(ITS)地区核核糖体的顺反子基因的核酸序列编码是核糖体。在细胞内,顺反子是由三个重复和守恒的单位编码区域(18岁,5.8年代,26 s)和两个内部转录间隔器(ITS1和ITS2)。这一地区基于双亲的遗传和杂交事件是装备提供更多遗传信息对物种识别和检测计算植物条形码(9,11,70年]。其具有较高的物种歧视和PCR扩增,所以顺反子被认为是最常见的测序地区植物系统发育研究。同样地,这是最普通条码区域用于中草药材料认证。例如,雪和李(71年)提供了可以成功区分藏族传统药用植物(Gentianopsis paludosa),包括他们的目的。其rDNA测序是区分成功应用h . diffusa从h . corymbosa一种治疗癌症的中药,和其他添加剂Baihuasheshecao [72年]。虽然,它具有较高的变异和种歧视在一些属,种间其所在区域的百分比很低在某些情况下。例如,总的来说,它是可变太远包括插入和删除,它不能保证可靠的校准。

通用引物是一种理想的DNA条码技术的重要试金石。伟大的问题是缺乏通用引物阻碍PCR和测序成功条件。其序列包含足够的物种识别变量网站,但是它太长了,从一些样品中提取完整的DNA由于高度退化的DNA发生在博物馆标本和草药市场在长期存储。克服整个它的局限性,ITS2序列是更短和更好的草药材料歧视,因为它更多的保守序列,从而减少错误的放大。的高可变性和species-distinguishment ITS2基因间的间隔作为核心DNA条形码申请中国材料。这个候选人条形码具有很高的种间差异和较低的种内遗传变异,成功地确定了92.7%在物种水平来自6600多个植物753属4800种的样品(62年]。ITS2对于中药的有效性已在很多研究中进行测试。例如,在菊科物种,五个DNA区域(rbcL、matK, ITS2和trnH-psbA)以使用大型植物的分类单元,包括各种药用植物和相关的物种。研究结果表明,ITS2正确验证76.4%物种水平,但总体水平是97.4%来自有关494属2315种(38]。高et al。39]表明ITS2序列可以用来识别24豆科物种在中国药典包括66个物种及其相关物种。ITS2地区的数据不仅能正确区分超过80.0%的物种,也成功地分化属的100% 1507 1126种豆科物种序列39]。近年来,史等。45]ITS2的识别效率相比,rbcL和其他通用条形码,结果表明ITS2最高的种间变异和“条码缺口”之间的区分姜科物种的种内变异和种间差异。随后,陈等人。52应用单核苷酸多态性(snp)检测ITS2药用人参物种的种内差异,和多拷贝ITS2可以视为一个理想的轨迹的基因组人参和人参quinquefolius两个物种。ITS2条形码也表现良好的展览在识别蔷薇科(48],芸香料[73年),唇形科(50),大戟科(42]。这些例子表明,ITS2条形码是一个有力的工具与陆地植物和草药材料可以区分。

虽然DNA条形码可以帮助区分中草药材料以其地区和ITS2基因间的间隔。然而,这两个地区有时可能会导致大量的错误识别。同样,多个副本的存在和二级结构会导致质量差由于杂交和PCR扩增双亲遗传IT2地区(74年]。内生真菌污染以往草药材料,这可能会导致不当PCR的结果。因为真菌和植物都包括ITS2序列,我们可以同时检查基因序列。为了克服这个问题,有效的实验方法包括特定的引物和条件应采取以避免真菌污染物(75年]。

trnH-psbA基因间序列

的trnH-psbA基因间的间隔是最变化的序列之一叶绿体基因组。这个基因间序列的平均长度为450个基点,但不同的从247年到1120年英国石油公司(66年,70年]。这个基因间间隔显示最高的物种歧视权力和扩增成功率在九个假定的轨迹测试跨广泛的类群(包括被子植物、裸子植物、蕨类、苔藓和苔类)(9,13]。最近的研究证明了trnH-psbA地区可以作为有用的DNA片段药用植物及其添加剂的歧视。草Dendrobii是其中一个最有用的团体在中国传统材料,姚明et al。(76年)已经测序叶绿体psbA-trnH基因间的间隔区分物种17药用石斛兰,一个Bullophyllum odoratissimum核苷酸的平均比例为2.5%(从2.0%到3.1%不等)。也表现出高跨物种的核苷酸的百分比(从0.3%到2.3%不等)和种内的百分比低核苷酸(从0%到0.1%不等)在所有的石斛兰的物种。金银花粳稻。拇指(忍冬科)是众所周知的中国药典的排毒抗炎功能。太阳et al。46)测试了七个候选人DNA条形码44的样本金银花粳稻和他们的密切相关的物种,使用六个参数和魏克森讯号等级测试。非编码DNA条形码psbA-trnH收益率报100%物种识别效率和最高的种间差异。在最近的研究中,歌曲等。77年]采用八DNA条形码验证38标本属于18种蓼科在中国药典。作为结果,叶绿体psbA-trnH不仅可以识别十八种蓼科,但也区分8其他物种包括一些常用添加剂的蓼科中国药典。至于药用pteridopyhtes、马等。41)检测5 6质体基因组序列的DNA标记从基因库,发现psbA-trnH 51蕨类植物物种的基因间序列有可用的通用引物从24个家庭。接下来,他们表现出psbA-trnH基因间序列既有PCR扩增效率高94.1%的测序和高成功率为81.3%。虽然psbA-trnH有助于识别许多中草药物种,很难区分和序列Glyceria Heracleum [78年,79年]。

psbA-trnH地区的一个缺点是,一些物种的序列太长(> 1000个基点)产生双向明确的地区。因为它的长度,这个地区的使用草药DNA条形码本身是有问题的从材料或退化中提取高质量DNA法医样本(70年]。另一个缺点是存在多聚腺苷酸/ T结构psbA-trnH地区,造成在序列比对成问题的。此外,核苷酸插入和删除的数量比其他职位更频繁(80年]。rps19, rpl22基因和假基因也发现在psbA-trnH在许多物种,如姜目,Dioscoreales和百合目81年]。总体而言,一些可能的生物信息学解决方案实现了处理巨大的长度问题,分子进化。

MaturaseK基因(MatK)

叶绿体基因的高度保守matK长约1500个基点,这是位于trnK的基因内区。这地区编码maturase-like内蛋白质组二号内含子剪接。基因表现出高替代率和高水平的物种间的歧视。因此,matK基因可以作为一个潜在的新兴候选植物分类学和进化的研究(66年]。在被子植物物种,matK基因作为一种重要的条码通过了大量的研究者们14,82年,83年]。在植物物种,该财团生命条形码(CBOL)植物工作组提出的结合:+ matK代表一个务实解决植物的分子识别(66年]。基于高matK地区歧视,这种基因通常用来区分中药材料不同的地理人口,特别是姊妹物种。此外,中国传统的材料姜科家庭成员可以确定物种歧视权力和系统发育关系通过锻炼叶绿体matK基因(83年]。matK基因的序列比较在豆科家人透露,有很高的适用性为核心的DNA序列条形码与约29属53种(44]。作为计算6个参数和爆破方法(84年,62年],matK基因确认更大级别之间的物种和物种基因差异,歧视,这带来了很高的权力在物种和属44]。尽管如此,工厂条码技术的最重要的挑战是能力识别姊妹物种在大范围的地理种群。虽然有些叶绿体序列有显著的能力识别入侵物种,少量的质体较低的序列变异在某些分类群的失败。

然而,matK地区通用条形码的缺点就是缺乏通用引物(70年,85年,86年]。为了规避这一问题,我们提出使用matK债券与其他通用标记DNA条形码。此外,新的套引物需要在该地区被开发。关于matK进化速率高,已经表现出与其他位点单独或合并。

:编码基因

核酮糖1 5 5-bisphosphate,羧化酶/加氧酶(二磷酸核酮糖羧化酶)是一个双功能酶,它可以集中有限的反应₂和核酮糖1 5 5-bisphosphate, (BuBP)来生成两分子3-phosphoglyceric酸(公司的第一步₂固定)。此外,它有能力吸收O₂RuBP解体。二磷酸核酮糖羧化酶组成的八大单元由质体编码:基因和八个小单元。主要包括八大亚基光合作用网站的酶。的优点:基因是通用引物和易于放大和对齐11,13,14]。我们关注:基因的编码区有大量rbcL序列在基因库,主要群体的广泛调查,将为第一层:序列大多数陆生植物的条码(12]。最近,使用rbcL地区与一个或多个DNA标记结果识别速度和物种歧视权力高于单一轨迹(13]。随后,该财团生命条形码(CBOL)植物工作组(倍增)推荐的组合:+ matK一样核心条形码及其/ ITS2互补条码区分植物在第三国际条码技术会议(66年]。因此,叶绿体基因:是一个最好的假定的条形码在陆地植物的系统发育和系统学分析。许多实验调查也发现中草药材料及其相关的添加剂。例如,高et al。38)评估五个地区的物种歧视菊科家庭。结果表明:基因扩增和测序效率高,但该地区表现出最低的或差异区分物种。低的种间变异被发现在实验的结果大戟科、蔷薇科、姜科和蓼科(42,48,83年,77年]。的缺点:序列是显著的基因的长度太长(至少1300个基点长)导致的问题。通常,它是双向的重要使用四个引物测序整个基因(9]。

讨论和结论

中药材的鉴别是一个全球性的关注,以确保安全原因和治疗有效性提高消费者的信心。传统方法的认证是松散,无法到达需要为粉末材料快速、可自动化的识别。因此,DNA条码技术克服这一问题的目的和生成通用标准。然而,每个分子标记都有自己的优缺点;没有标准的引物和环球DNA条形码验证不同粉末材料。未来的研究中,有必要改善中药材料的DNA条码技术系统。

成功的基因组DNA是一个重要的验证草材料利用DNA条码技术的先决条件。至于新鲜材料,相对简单的DNA提取方法。但大部分中国传统草药材料是常规采购从干或粉从市场收集的植物,包括根、茎、叶和花。此外,生理条件,收获季节,环境因素,为每个草存储和处理方法是不同的。因此,DNA提取这些材料应该谨慎处理,避免DNA降解和真菌污染物。在大多数情况下,通常是植物中药材部分含有高水平的酚类化合物,多糖和颜料。内生真菌广泛存在的污染问题,这可能是PCR扩增的抑制剂。在实践中,有效的实验方法可以帮助减少不良后果的概率。一般来说,用75%的酒精清除表面的草药物质前DNA提取可以预防内生真菌DNA提取和表面的杂质。

总之,DNA条形码不仅有效地识别草药材料,但它也是一个有结果的工具区分物种或替代物种草药材料之一。我们相信一个参考的发展中药材将协助DNA条形码系统在提高药物使用的安全的环境中增加潜在的不良反应。

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