研究与评论:微生物学与雷竞技苹果下载生物技术杂志
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郭慧，金思阳，刘汉，王振岳＊
中医药大学黑龙江研究生院，黑龙江哈尔滨150040
收到日期:15/09/2015;接受日期: 25/02/2016;发表日期:07/03/2016
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众多的有害滥用药用植物成分引起了广泛的关注。这一现象引起了全世界对药品安全应用的要求。DNA条码技术为鉴别中药材植物的形态和化学过程提供了有力的补充手段。因此，DNA条形码系统应该不断更新，包含大量关于真实植物材料和潜在替代品或掺假的信息。DNA条形码这一新领域的最新进展为识别中国人提供了新的视角草药．已建立了ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等DNA区域作为中草药的热门外用条形码。本文综述了DNA条形码技术在中药材鉴定中的重要进展。
DNA条形码;中草药材料;它的;ITS2;psbA-trnH
草药在世界范围内被用于治疗和治疗疾病，这有很长的和有据可查的历史。根据世界卫生组织的记录，全球80%的人口在使用中药，因为中药具有重要的药用价值和保健功效(http://www.worldwildlife.org/what/globalmarkets/wildlifetrade/faqsmedicinalplant。超文本标记语言)．不时地，”的目的由于安全性和有效性问题，草药假药是使用者、患者和行业的主要关切。传统的鉴定草药的方法包括形态学、显微学和化学方法，它们仍然是药典中使用的主要方法。然而，这些技术有其局限性。如传统的物种分类学鉴定通常需要有长期训练和经验的专业知识。在不断增长的草药市场中，草药原料的掺假已经成为一个全球性问题。以马兜铃属草本植物为例，在传统中药中，马兜铃科植物共有常见的掺杂物和相似的形态特征，这增加了消费者之间混淆的风险[1，2］．Akebiae主茎从Akebia quinata中提取，正义与发展党。trifoliata或正义与发展党。trifoliata var．南方(Mutong, MT)总是用那意味着manshuriensis(Guanmutong GMT)。马兜铃属。包括马兜铃酸(AA)，一种来自马兜铃属植物的硝基菲羧酸，可引起肾病[3.］．马兜铃酸肾病(AAN)是一种快速进行性肾间质纤维化，可导致终末期肾衰竭疾病和尿路上皮恶性肿瘤，1991年首次在比利时报道，100多名患者在服用含粉兜铃衍生中药粉兜铃根(方吉，FJ)的膳食补充剂后，被一种富含aa的粉兜铃酸衍生草药替代马兜铃fangchi(广方吉，GFJ) [4］．随后，马兜铃属植物掺假成为世界性问题，美国食品及药物管理局已警告含AA的植物产品及膳食药物的安全性[5］．然而，许多马兜铃品种在亚洲和美洲仍最常用于医药用途[6］．值得注意的是，在含有AA的草药中，由于误用、误鉴定和掺假而引起的不良反应可导致DNA分子核苷酸与诱变AA结合的AT-TA转化突变[3.，7］．因此，一种准确、快速和稳定的特殊标记使非专业人员能够从标准DNA序列中识别草药无疑是有益的。
DNA条形码是一个相对较新的概念，用于提供快速，准确和自动化的物种鉴定使用短DNA片段的部分基因组．这个概念最初始于赫伯特的种子植物[8他证明，利用线粒体基因细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome C oxidase subunit I, COI)可以在200个鳞翅目近缘物种中获得100%的准确性。但是线粒体基因COI的部分将是一个更具挑战性的任务，因为在高等植物中序列进化的速度比在动物线粒体中观察到的要慢得多。理想的陆生植物DNA条形码应满足三个标准:(i)包含最大的种级遗传变异和分化;(ii)适当保存侧翼地点，以便开发通用引物生物信息学分析与应用;(iii)具有足够短的DNA序列，以便于DNA提取和PCR扩增。因此，目前还没有在陆生植物中进行DNA条形码的标准方案。
首先,最线粒体基因，以及核基因组中的单拷贝基因，由于序列变变率低和缺乏通用的PCR扩增引物，已被作为条形码候选基因删除[9］．然而，核糖体DNA的内部转录间隔(ITS)除5.8S外，在陆地植物(蕨类除外)中显示出广泛的用途，并被认为是潜在的条形码位点[9，10］．第二，对叶绿体和ITS内含子的分子系统研究。例如，Kress等人[9]对烟草和茄属植物7科53科88属99种的多个基因座进行了比较，认为psbA-trnH间隔区和ITS可作为被子植物中质体最多的区域，易于在广泛的陆生植物中进行PCR扩增。然而，在通用引物对和反应条件下，扩增和序列生成的容易程度被确定为这对引物不能为苏铁属的所有成员提供特定的标识[11］．对来自GenBank的1000多个rbcl序列的分析发现，rbcl可以在大约85%的同源物种成对比较中验证样本[12］．在另一项研究中，当非编码trnH-psbA间隔基和质体编码基因rbcL组合用于43科48属共96个不同物种时，歧视性增加到约88% [13］．拉哈耶等人。[14]对中美洲兰科植物(295种2代表)的>1000进行了分析，发现其中一段质体基因可能是流动植物的条形码位点。总的来说，在陆生植物中，质体基因组的一些标记(主要在四个编码区(rpoB, rpoC1, matK, rbcL)和三个非编码区(trnH-psbA,psbK-psbI和atpFatpH)显示出较高的DNA条形码质量[9，14-17］．最近，大量有关DNA条形码的里程碑式文章陆续发表(表1，为中药材鉴定提供了新的方法。
| 一年 | 文章 | 参考文献 |
|---|---|---|
| 2003 | 中国黄芪的系统发育:5S rRNA间隔区、ITS和18S rRNA DNA序列的分子证据 | 董等[18]. |
| 2005 | 基于rbcL序列和化学成分的美洲甘草甘草属的系统发育关系 | Hayashi等[19] |
| 2006 | “黄草石虎”石斛属的rDNA ITS分化 序列分析 |
许等[20]. |
| 基于nrDNA ITS序列的白术药材鉴定 | 柴巴等[21] | |
| 药用麻黄叶绿体chlB基因序列分析及其在麻黄药材鉴定中的应用 | 郭等[22] | |
| 2007 | 利用ITS和5S rRNA间隔序列对葛根和葛根进行分子鉴定 | Sun等[23] |
| ITS序列分析用于中国西北柴胡属植物的分子鉴定 | Yang等[24] | |
| 基于rDNA ITS序列的泰国Mitragyna属的分子分析及其在麻醉种Mitragynaspeciosa鉴定中的应用 | Sukrong等[25] | |
| 基于cpDNArbcL和翻译氨基酸序列的毛蕨及其掺假种鉴定 | 赵等[26]. | |
| 2008 | 濒危药材雪莲ITS DNA和5S rRNA测序鉴定 | 陈等[27]. |
| 基于trnH-psbA叶绿体DNA对泰国药用植物Stemonatuberosa及5个近缘种的测序分析 | Vongsak等[28] | |
| 2009 | 柴胡属药材的核糖体DNA ITS序列鉴定 | 谢等[29]. |
| PCR扩增ITS区和5.8S rDNA区对贯叶连翘的分子鉴定 | 霍华德等人[30] | |
| 基于ITS序列分析和rapd分子标记的马鞭草鉴定 | Ruzicka等人[31] | |
| 2010 | 利用DNA测序和ISSR标记对花菊红及相关药材进行分子鉴定 | Su等，[32] |
| 中草药雷公藤的分子分析 | 劳等[33] | |
| 用叶绿体psbA-trnH区长度变异检测药用巴黎掺杂缬草 | Yang等[34] | |
| 马兜铃种子替代马兜铃治疗咳嗽 | Li et al. [35] | |
| 民族药用植物沙柏及其掺杂物的DNA条形码分子鉴定 | Sui et al。[36] | |
| 利用matK和rbcL序列进行系统发育分析鉴定药用石斛属 | Asahine等[37] | |
| 评价候选DNA条形码在大菊科物种鉴别中的可行性 | 高等[38]. | |
| 利用潜在DNA条形码ITS2鉴定豆科药用植物 | 高等[39]. | |
| 基于DNA条形码技术的紫杉鉴定 | Li et al. [40] | |
| 药用蕨类植物叶绿体psba -trn基因间区DNA条形码标记的物种鉴定 | Ma et al. [41] | |
| 大戟科植物的DNA条形码鉴定 | 庞氏等[42] | |
| 水生单子叶植物lemmaceae的DNA条形码 | 王等[43] | |
| 2011 | 基于DNA条形码图谱的豆科植物鉴定 | 高等[44]. |
| 测试所提出的DNA条形码在姜科物种鉴定中的潜力 | Shi等。[45] | |
| 金银花及其近缘种的DNA条形码鉴定 | Sun等[46] | |
| 利用DNA条形码鉴定中草药 | Li et al. [47] | |
| 植物DNA条形码在蔷薇科物种鉴定中的应用 | 庞氏等[48] | |
| 2012 | 模型药用菌灵芝的基因组序列 | 陈等[49]. |
| 四种DNA条形码鉴定Lamiaceae几种药用植物的比较 | 韩等[50] | |
| 2013 | 利用潜在DNA条形码ITS2鉴别药材 | 庞氏等[51] |
| 基于DNA条形码的药用人参种内变异的快速SNP鉴定与分析 | 陈等[52]. | |
| ITS2区在蕨类植物卷柏科药用植物条形码识别中的应用 | Gu等[53] | |
| 利用DNA条形码nrITS2鉴定皮质类药材 | Sun等[54] | |
| 2014 | 药用植物DNA条形码鉴定技术 | Techen等[55] |
| 用DNA条形码鉴定被子植物Apiaceae的种类 | 刘等[56]. | |
| 草药鉴定的复兴:从形态学到DNA | 陈等[57]. | |
| DNA条形码柴胡 | Chao等[58] | |
| 2015 | 亚洲大陆石斛属(兰科)DNA条形码的鉴定 | 许等[59]. |
表1:2003年以后，DNA条形码技术在中药材鉴定中的一些应用发表。
草本药材可能被近亲或不相关植物的材料意外或有意地取代[60，61］．药材掺假经常发生的原因有:(1)药材形态特征不明显;(2)药材名称相似;(3)药材价格昂贵，价值昂贵，但替代经济实惠。政府官员和制药业有责任保证任何药材都是正品，对消费者是安全的。而且，专家们很难正确地诊断物种。因此，使用标准的DNA条形码可以为区分草药材料及其掺假提供一个实用的解决方案。
用于鉴定草药的DNA条形码
草本材料的掺假物大约来自于具有相似形态的密切相关的物种或植物部分。本文建立了DNA条形码在线数据库，可以通过不同的参考序列对不同分类的中药材进行识别。ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcl、matK等DNA区域被认为是植物DNA条形码的重要候选区域。文中给出了用于条形码区域扩增和测序的常用引物表2．
| 基因 | 底漆名称 | 引物序列 | 参考 |
|---|---|---|---|
| 它的 | 5了 | 5 'ccttatcatttagaggaaggag-3 ' | Kress等[9] |
| 4牧师 | 5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ' | ||
| ITS2 | S2F | 5 ' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 ' | Chen等[62] |
| S3R | 5 ' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 ' | ||
| psbA-trnH | fwd PA | 5 ' -GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3 ' | 萨斯等人[11] |
| 牧师TH | 5 ' -CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3 ' | ||
| matK | 华氏390度 | 5 ' -CGATCTATTCATTCAATATTTC-3 ' | Cuenoud等[63] |
| 1326 r | 5 ' -TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3 ' | ||
| : | 1 f | 5 ' -ATGTCACCACAAACAGAAAC-3 ' | Olmstead等[64] |
| 724 r | 5 ' - TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3 ' | 费伊等[65] |
表2:PCR扩增和DNA测序通用引物。
CBOL植物工作组比较了7个候选质体DNA区域(matK基因、rbcL基因、rpoB基因、rpoC1基因、trnH-psbA间隔子、psbK-psbI间隔子和atpF-atpH间隔子)在代表38种裸子植物、67种隐生植物和445种被子植物的907个样本中的表现，并推荐rbcL+matK组合作为标准植物标记[66］．生命条形码数据系统(BOLD)由加拿大中心建立，并建立了首个在线DNA条形码数据库(http://www.boldsystems.org)．该数据库可存储、分析和发布DNA条形码，通过分子组装免费向公众开放，为中药材鉴定的复兴奠定了基础[67］．药材DNA条形码数据库共有1259个物种的18436条序列，包含药材的基本信息、所有质体DNA区域和核糖体顺反子内部转录间隔子[68］．基于ITS2+psbA-trnH的两个位点，包括23262种植物的78847条序列，建立了初步的中草药鉴定系统[69］．该系统认为ITS2区域是植物条码的核心标准区域，psbA-trnH区域可作为药用植物条码的补充区域。本文综述了中药DNA条形码技术的主要研究进展。
核糖体内部转录间隔区(ITS)
核糖体顺反子的内部转录间隔区(ITS)是编码核糖体核酸的多基因序列。在细胞内，顺反子由三个重复且保守的单元编码区(18S, 5.8S, 26S)和两个内部转录间隔区(ITS1和ITS2)组成。此区域基于双亲继承而成杂交Events可提供更多物种识别的遗传信息，并已经过测试计算为植物条形码[9，11，70］．ITS具有较高的物种识别能力和PCR扩增能力，因此顺反子被认为是植物系统发育研究中测序频率最高的区域。同样，它也是用于中药材认证的最常规的条形码区域。例如薛和李[71]提供智能智能系统可成功区分传统藏药植物(Gentianopsis paludosa)，包括掺假。ITS rDNA测序成功应用于分化h . diffusa从h . corymbosa，一种治疗癌症的中草药，以及白花社草的其他掺假物[72］．虽然ITS在某些属上具有较高的变异和种间区分性，但在某些情况下ITS区域的种间百分比较低。例如，总体而言，ITS变量太多，包括插入和删除，它不能确保可靠的对齐。
通用引物是理想DNA条形码的重要试金石。ITS的最大问题是缺乏通用引物阻碍了PCR条件和测序成功。ITS序列包含足够的可变位点，可用于物种鉴定，但由于博物馆标本和市场上的草药在长时间储存期间发生了高度降解，ITS序列太长，无法从一些样品中提取完整的DNA。克服了整个ITS的局限性，ITS2序列更加保守，减少了错误扩增，是一个更短、更好的中药材鉴别序列。ITS2基因间间隔的高变异性和物种区分性可作为中国材料的核心DNA条形码。该候选条形码具有较高的种间分化度和较低的种内遗传变异，在种水平上对753属4800种6600多个植物样本的92.7%进行了识别[62］．ITS2对中药的有效性已在许多研究中得到验证。以菊科植物为例，利用大植物分类单元(包括各种药用植物和近缘种)鉴定了5个DNA区域(rbcL、matK、ITS、ITS2和trnH-psbA)。结果表明，ITS2在种水平上的识别率为76.4%，在一般水平上的识别率为97.4%，来自于494属的2315种[38］．高等人。[39]表明ITS2序列可用于中国药典中24种豆科植物的鉴定，其中包括66种及其近缘种。数据表明，在1126种豆科植物的1507个序列中，ITS2区域不仅能正确区分80.0%以上的种，而且能成功区分100%的属[39］．近年来，Shi等人。45]比较了ITS2、rbcL等通用条码的识别效率，结果表明ITS2具有最高的种间变异和种间变异与种内分化之间的“条形码鸿沟”，对姜科种进行了区分。随后，Chen等人。[52]应用单核苷酸多态性(SNPs)方法检测药用人参ITS2的种内分化，多拷贝ITS2可作为药用人参基因组的理想位点人参而且人参quinquefolius两个物种。ITS2条码在识别Rosaceae [48]，鲁泽科[73]、Lamiaceae [50]、大戟科[42］．这些例子表明，ITS2条形码是区分陆地植物和草药材料的有力工具。
虽然DNA条形码可以通过ITS区域和ITS2基因间间隔来辅助区分药材。然而，这两个区域有时可能导致大量的错误识别。同样，由于IT2区域的杂交和双亲遗传，存在多个副本和二级结构，导致PCR扩增质量较差[74］．植物内生真菌污染在中药材中很常见，这可能导致PCR结果不正确。由于真菌和草药都包含ITS2序列，我们可以同时检测基因序列。为了克服这一问题，应采用有效的实验方法，包括特定的引物和条件，以避免真菌污染[75］．
trnH-psbA基因间序列
trnH-psbA基因间间隔序列是人类基因组中突变性最强的序列之一叶绿体基因组．该基因间序列平均长度约为450 bp，但在247 - 1120 bp之间变化[66，70］．在广泛的分类群(包括被子植物、裸子植物、蕨类植物、苔藓和苔类植物)测试的9个假定位点中，该基因间间隔显示出最高的物种鉴别能力和扩增成功率[9，13］．最近的研究表明，trnH-psbA区域可作为药用植物及其掺假物鉴别的有用DNA片段。石斛是中国传统材料中最有用的类群之一，姚等。76]的叶绿体psbA-trnH基因间间隔区序列，以区分17种药用植物石斛(Dendrobium)和1种药用植物odoratissimum，平均核苷酸百分比为2.5%(范围为2.0% ~ 3.1%)。在所有石斛属物种中，也表现出较高的种间核苷酸百分比(0.3% ~ 2.3%)和较低的种内核苷酸百分比(0% ~ 0.1%)。金银花粳稻。拇指在中国药典中以解毒和解毒而闻名抗炎功能。孙等人。[46]在44个样本上测试了7个候选DNA条形码金银花粳稻以及它们的近缘种，使用6个参数和Wilcoxon符号秩检验。非编码psbA-trnH DNA条形码的物种识别效率为100%，种间差异最高。在最近的研究中，Song等人。77他们使用了8种DNA条形码来鉴定属于18个物种的38个标本蓼科在中国药典中。结果表明，psbA-trnH叶绿体不仅能鉴别18种蓼科植物，还能鉴别中国药典中常见的8种蓼科掺杂物。至于药用蕨类植物，Ma等。[41]对GenBank中6个质体基因组序列的5个DNA标记进行了检测，发现psbA-trnH基因间序列具有24科51种蕨类植物的通用引物。接下来，他们发现psbA-trnH基因间序列具有94.1%的高PCR扩增效率和81.3%的高测序成功率。虽然psbA-trnH可用于鉴别许多中草药品种，但很难对甘油(Glyceria)和Heracleum进行区分和排序[78，79］．
psbA-trnH区域的一个缺点是在某些物种(>1000 bp)序列太长，无法生成双向的明确区域。由于它的长度，使用该区域作为草药DNA条形码单独是有问题的，从降解的材料或提取高质量的DNA法医样本［70］．另一个缺点是在psbA-trnH区域存在poly-A/T结构，导致序列比对存在问题。此外，核苷酸插入和删除的次数比其他位置更频繁[80］．rps19、rpl22基因和伪基因在许多物种的psbA-trnH中间也被发现，如姜菜、薯蓣和百合属[81］．总的来说，一些可能的生物信息学解决方案已经实施，以处理巨大的长度问题和分子进化。
MaturaseK基因(MatK)
叶绿体基因高度保守的序列k长约1500 bp，位于trnK的内含子中。并且，该区域编码II族内含子剪接中的成熟酶样蛋白。该基因在物种间表现出较高的替代率和高度的差别。因此，matK基因可能成为植物系统学和进化研究的潜在候选基因[66］．在被子植物物种中，matK基因已被大量研究人员作为重要的条形码[14，82，83］．在植物物种方面，CBOL (Consortium for the Barcode of Life)植物工作组提出rbcL+matK的组合是植物分子识别的实用解决方案[66］．基于matK区域的高分辨力，该基因通常用于区分不同地理种群的中草药材料，特别是姐妹种。此外，中国传统材料姜科利用叶绿体matK基因可从物种辨别能力和系统发育关系中鉴定科成员[83］．对豆科植物matK基因的序列比较表明，该序列作为核心DNA条形码具有较高的适用性，在超过53个种中约有29属[44］．经6个参数和BLAST方法计算[84，62]， matK基因证实种间存在较大的差异，种内存在较大的遗传差异，具有较高的种属鉴别能力[44］．尽管如此，植物条形码最关键的挑战是在大范围地理种群中识别姐妹物种的能力。尽管一些叶绿体序列具有显著的识别入侵物种的能力，但少数质体变异低的序列在某些分类类群中失败。
然而，matK区域作为通用条形码的缺点是缺乏通用引物[70，85，86］．为了避免这一问题，我们提出了matK可以与其他通用标记结合使用，如DNA条形码。此外，该地区还需要开发新的引物组。关于matK的高进化率，它既表现为单独存在，也表现为与其他位点合并。
rbcL编码基因
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是一种双功能酶酶，可使CO反应集中2和核酮糖-1,5-二磷酸(BuBP)生成两个分子3-磷酸甘油酸(CO的第一步)2固定)。此外，它还具有吸收O2来分解RuBP。Rubisco由质体rbcL基因编码的8个大亚基和8个小亚基组成。八大亚基主要包括光合作用酶的位点。rbcL基因的优点是引物通用，易于扩增和比对[11，13，14］．我们之所以关注rbcL基因，是因为该基因编码区在Genbank中有大量的rbcL序列，主要类群的调查范围广泛，将为大多数陆生植物的第一层条形码提供rbcL序列[12］．近年来，将rbcL区域与一个或多个DNA标记结合使用，可获得比单一位点更高的物种识别率和辨别能力[13］．随后，在第三届国际条形码大会上，生命条形码联盟(CBOL)植物工作组(PWG)推荐rbcL+matK组合作为核心条形码，ITS/ITS2组合作为植物识别的补充条形码[66］．因此，叶绿体rbcL基因是陆生植物系统发育和系统学分析中最好的推定条形码之一。对中药材及其掺假物也进行了大量的实验研究。例如，Gao等。[38]评估了5个地区，以区分菊科物种。结果表明，rbcL基因具有较高的扩增和测序效率，但该区域种间差异最小。的实验结果中也发现了低种间变异大戟科、蔷薇科、姜科及蓼科[42，48，83，77］．rbcL序列的缺点是基因的显著长度太长(至少1300 bp长)，不会引起问题。通常，使用四个引物对整个基因进行双向测序是很有意义的[9］．
中药材的鉴定是一个全球关注的问题，以确保安全性和治疗效果，以提高消费者的信心。传统的鉴定方法比较松散，无法满足药材快速、自动化鉴定的需要。因此，DNA条形码技术克服了这一问题，具有产生通用标准的目的。然而，每种分子标记都有其自身的优点和缺点;没有标准的引物和通用的DNA条形码来鉴定不同的草药材料。为进一步研究，有必要对中药材DNA条形码系统进行改进。
成功的基因组DNA是利用DNA条形码技术鉴定药材的必要前提。对于新鲜材料，提取DNA的方法相对简单。但传统中草药的大部分材料都是从市场上收集的干燥或粉末状植物中常规获得的，包括根、茎、叶和花。此外，每种草本植物的生理条件、采收季节、环境因素、储存和加工方法各不相同。因此，这些材料的DNA提取应该小心处理，以避免DNA降解和真菌污染。在大多数情况下，中药材通常是含有大量酚类化合物的植物部位，多糖和颜料。内生真菌的污染问题普遍存在，这可能是有价值的PCR扩增抑制剂。在实践中，有效的实验方法可以帮助降低不良后果的概率。一般情况下，提取DNA前用75%的酒精对药材表面进行清除，可预防内生真菌DNA提取和表面杂质。
综上所述，DNA条形码不仅可以有效地鉴别药材，而且可以作为一种有效的鉴别药材种或替代种的工具。我们认为，中药材参考DNA条码系统的开发将有助于在潜在不良反应增加的情况下提高用药安全性。
