研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
菜单E - ISSN: 2320 - 3528
P - ISSN: 2347 - 2286
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艾蒂安·斯1*雅克·Haiech2和jean - luc Galzi1
1UMR 7242 CNRS Biotechnologie等信号通知Cellulaire,斯特拉斯堡大学,esb, 300大道Sebastien黑雁67412 Illkirch,法国
27200年UMR Laboratoire d 'Innovation Therapeutique CNRS,斯特拉斯堡大学,将年鉴74路线du莱茵河,67401 Illkirch,法国
收到日期:07/08/2017;接受日期:28/08/2017;发表日期:05/09/2017
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摘要目的:细菌污染的饮用水是公共卫生关注受国家标准和由世界卫生组织指南。努力从而不断致力于改善检测污染尽可能早的标记,每一次污染。在这项工作中,我们优化大肠杆菌的检测一般来说,和的大肠杆菌特别是,通过修改特定媒体增长。
方法和结果:由这个关键参数,如选择性生长动力学、信号强度、样品的步骤操作和信号监测,我们成功地)提高细菌污染检测的速度(中等SMIL), 2)更好地控制污染的启示对细菌生长的比例(中等SMIM),或iii)设计一个用户友好的和具有成本效益的信号检测系统(Chromo-SMIM介质)。
结论:SMIM和SMIM-derived媒体提供一个更好的β-galactosidase(存在于所有大肠菌)活动检测与经典方法相比。这种新方法因此是一个有用的改善在全球使用的标准技术治水分析实验室。
大肠杆菌(所有潜在的致病类型);环境科学;健康;酶的检测;染料;对比剂;水质量;检测灵敏度
iCFU:初始菌落;OD:光密度;转:每分钟旋转;μ:4-Methylumbelliferone;杯子:4-Methylumbelliferyl-Β-D-Glucuronide;ONPG: Orthonitrophenyl-Β-D-Thiogalactoside;废纸:Orthonitrophenyl;Β-Gluc:Β-Glucuronidase;Β-Gal:Β-Galactosidase;运输大亨:时间检测; IPTG: Isopropylthiogalactoside
大肠杆菌的细菌,包括大肠杆菌(大肠杆菌)子群,是革兰氏阴性细菌(克)通常存在于人类和动物粪便(1]。饮用水中他们的存在直接关系到粪便污染的水。尽管他们中的大多数并不对人类有害,他们的发现可能表明存在致病菌如其他细菌、原生动物、病毒或其他类型的寄生虫也住在人类和动物的消化道。昂贵,耗时和困难的测试存在的一些病原体,饮用水检测大肠杆菌细菌和/或样品大肠杆菌的存在。有一个大共识的事实或少量的大肠杆菌细菌大肠杆菌,即一个细菌在100毫升的饮用水中定义的欧盟指令98/83 / EC(1998年11月3日),足以宣布水不适合人类食用。因此,这些细菌检测要求限制摄入粪便的风险病原体,防止味道和气味的分歧(2]。
目前化验专注于大肠杆菌群细菌和/或大肠杆菌因为它们都存在酶特性,使容易认同不同的方法(3]。每一个大肠杆菌细菌(包括大肠杆菌)能够表达,在定义的条件下,β-galactosidase(β-gal),劈开乳糖为葡萄糖和半乳糖的酶4]。这样可以确保获得一个随时可用的碳源的细菌即使没有其他糖类。β-galactosidase编码的乳糖操纵子,监管一直得到广泛的研究(5- - - - - -10]。已研制出许多分析揭示β-galactosidase活动(如十二烷基胰蛋白胨培养基中乳酸发酵试验或亮绿乳糖胆汤媒体)(11]。细菌检测测试现在主要依靠酶底物产生光学检测代谢物。β-galactosidase,例如,一种广泛使用的基质是orthonitrophenyl-β-d-thiogalactoside (ONPG)。ONPG乳沟释放一个半乳糖分子和一个orthonitrophenyl(废纸)染料分子。细菌利用半乳糖作为碳源和荒地的积累在中黄色分子最大吸光度在420海里。
相比其他大肠杆菌群,大肠杆菌也表示β-glucuronidase除了β-gal(β-gluc)。这提供了可能性使用另一个显色分子这是一个特定的β-gluc衬底。使用最广泛的分子4-methylumbelliferyl-β-d-glucuronide(杯),裂解成葡糖苷酸(由细菌作为碳源)和4-methylumbelliferone(μ),荧光的激发峰产品365 nm和最大发射在460海里。
商用介质(colilert-18®(12,13])来检测大肠菌群和大肠杆菌群之间的歧视(媒介成为黄色)大肠杆菌(媒介成为黄色和荧光激发紫外灯),包含两种基质b-Gal和b-Gluc作为唯一碳源。Non-coliform细菌不会增长也不产生任何信号,因为他们表现出无论是β-Gal还是β-Gluc活动。这种媒介作为标准在几个国家和镀是一种替代方法,需要样品过滤——细菌和电镀集中在固体介质(格兰特,1997)。Colilert-like方法不需要过滤和敏感到足以感知一个细菌100毫升水样在18 h。
必须考虑几个参数来优化开发对大肠杆菌和/或媒体大肠杆菌细菌检测。其中有选择性(为了避免噪音引起的非特异性生物),增长率(或者时间检测),信号强度(检测)的敏感性,样本数量的步骤操作(应该是用户友好的,或最好的不必要的)和信号监视或记录(成本效益探测器)。
在这项工作中,我们设计一些媒体对大肠杆菌和/或大肠杆菌细菌检测地址检测大肠杆菌/的挑战大肠杆菌细菌在不到12 h。所有媒体共享一个公共基础(称为“基介质”),因此目前类似的一般特征。每个介质的特殊性赋予了“基质”,提供碳源和检测探针。每个介质进行了优化以适应至少上面列出的关键参数之一。三个原始媒体描述,优化启示在增长比率,提高检测的速度,利用成本效益的检测设备
从Idexx Colilert购买®。条件是一个100毫升的瓶装粉的水样本添加到启动细菌检测。含污染物超纯级水从微孔(生产Z00QSV0WW净化器®)被用来确保可重复性。媒体已经接种如下所述。
SMIM介质和衍生品是由两个不同的组件,一个基本培养基(含有营养和食品添加剂)和一组基板。媒体之间的主要区别在于基质的性质。所有成分的详尽的列表显示在表1补充。
基础培养基
营养物质提供在DMEM培养基(没有葡萄糖、谷酰胺、酚红,丙酮酸钠和碳酸氢钠),从Sigma-Aldrich购买吗®作为一个粉。8.3 g的营养加权准备200毫升5 x集中的媒介。
所有添加剂除了碳酸氢钠、烟酸、烟酰胺和Tergitol-7分别加权,然后汇集一起基地中粉。添加100毫升的超纯水溶解粉末。烟酸和烟酰胺分别准备在超纯水1000 x集中解决方案和补充说在这一步。液体Terigtol-7和碳酸氢钠粉然后添加最后卷调整到200毫升获得所需的5 x集中基础培养基(营养)。集中的解决方案是根据0.45μm过滤硝化纤维素滤器在无菌环境下储存在4°C,直到使用。
基质准备400 x集中DMSO解决方案在氩气氛下消除氧气。解决方案是稳定的室温超过三个月没有光。底物被添加到基地中/添加剂混合之前使用。
20毫升的5倍基本培养基无准备地放置在一起一瓶110毫升每个400 x 250μL集中衬底。瓶是100毫升的水样本进行测试。在这项研究中,超纯级的水被用来避免细菌污染,确保可重复性。媒体随后被接种如下所述。
评估媒体特点,定义良好的细菌数量增加了每个实验的开始。这从细菌量被称为初始集落形成单位(iCFU)。
实验前一天,文化选择的应变(s)执行在LB培养基,孵化一夜之间在35°C和搅拌在黑暗中(220 rpm)。当天实验中,文化在3300 g离心5分钟在室温下(删除磅)和细菌悬浮在水中。OD600nm测量评估细菌浓度。文化被稀释在级联1毫升的水直到到达所需的每100μL iCFU。接种100μL执行所选的稀释,以确保再现性。100μL镀相同的稀释LBagar板块和孵化晚上35°C到评估的具体数量细菌(iCFU)使用倾注平皿法。进一步稀释如果iCFU计数进行过高(> 400)可靠地确定初始数量的细菌。
后立即接种,文化是在35°C的环境没有激动人心的黑暗中。光学密度对细菌数(OD600)或基质生产(OD420)是衡量端点或以连续的方式。相同的空白测定介质每瓶接种0细菌和提交相同的治疗。
在线测量OD420海里进行自动使用循环系统从培养瓶发行量石英试管(QS0300 100μL),贝克曼DU640®分光光度计。试管是连接到文化与3.5毫米油管。Minipuls2循环是保证®蠕动泵从Gilson(补充图1)。流量被设定为6.56毫升/分钟,确保液体的循环通过整个系统在4分钟,整个电池体积取代不止一次每秒,同时避免泡沫的形成。液体从瓶子的底部抽出并返回瓶子的顶部,以确保一个完整的循环。系统提供了一个两分钟的死时间实验开始时,液体达到电池所需的时间。这死后时间测量是可能的每一秒。在这项工作中,数据记录每隔30分钟后4000 iCFU接种。
Methylomelliferone,μ,信号被评估在瓶中直接与Fluo-sens设备(ESMO 33-M4034 ESE激光®)试剂盒®(Supplementatry图1 b)。这是一个紧凑的便携式荧光探测器容易处理培养瓶。在与瓶外壁接触,直雷竞技网页版接进入孵化器。激光将发光每6分钟,在瓶内焦距等于9毫米。365年nm-length激发光、触发器μ荧光发射检测到460海里。Fluo-sens用光电倍增管测量荧光。荧光值,表示在任意单位,范围从0到2500和灵敏度设置为最低FLdigital软件(试剂盒®)设置背景在低水平(500 a。u Colilert-18®700美SMIM和衍生品)和检测信号的最大可能的动态范围。
SMIL的检测中,细菌培养在一瓶100毫升的35°C包含SMIL的媒介。100μL样品了在表示时间和治疗30分钟35°C和10μM Triembarine我揭示的存在特定的细菌生长。荧光强度与荧光板读读者想象®Multilabel板读者(PerkinElmer)。首先样本分析后5小时的增长,以避免偏压增长率通过细菌增殖。
EC1-31是大肠杆菌水从欧陆坊购买生细菌®。CT4和CT5总大肠杆菌群(非大肠杆菌出生的)水细菌从欧陆坊购买®。NC8铜绿假单胞菌水诞生了细菌从欧陆坊购买®。枯草芽孢杆菌在这项研究中的应用是水细菌从欧陆坊购买出生的®。ATCC8739是大肠杆菌细菌从美国购买类型文化收藏®。
野外样品0是指来自实验室水槽中的水。欧陆坊1 - 5已经收集了样本®在指定地点(表1在一个给定的地区)涉嫌污染。欧陆坊6 - 7已经收集了样本®在指定地点(表1没有污染的怀疑。野外样品8随机拿起在指定地点(表1)。
| N° | 样本来源 | 或然数/ 100毫升 | SMIM检测 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 总大肠杆菌群 | 大肠杆菌 | 总大肠菌OD420nm | 大肠杆菌荧光λ460nm | ||
| 0 | 水槽——研究所生物技术优越的学校——Illkirch法国 | < 1 | < 1 | - - - - - - | - - - - - - |
| 1 | 河“La Mauchere”——Custines法国 | > 2420 | > 2420 | + + + + | + |
| 2 | 从污水河La Meurthe下游plant-Nancy法国 | > 2420 | > 2420 | + + + + | + |
| 3 | 河“L 'Amezule”——法国圣克利斯朵夫 | > 2420 | > 2420 | + + + + | + |
| 4 | 溪“Le Gremillon”主辅修法国南希 | > 2420 | 1200年 | + + + + | + |
| 5 | 河“La Meurthe”——水兵基地——法国南希 | > 2420 | 1700年 | + + + + | + |
| 6 | 从水库上游——Bellefontaine法国 | 110年 | < 1 | + + | - - - - - - |
| 7 | 从水库下游——Bellefontaine法国 | 14 | < 1 | + + | - - - - - - |
| 8 | 河La左恩-Geudertheim法国 | 145年 | < 1 | + + + | - - - - - - |
| 9 | 河上游“La莫德”——从废水plant-Rohrwiller法国 | 63年,7 | < 1 | + + + | - - - - - - |
| 10 | 河La莫德-下游污水厂Rohrwiller法国 | 36.8 | < 1 | + + + | - - - - - - |
| 11 | 砾石坑——Bischwiller法国 | 20.3 | < 1 | + + | - - - - - - |
表1。细菌检测样品。显示字段的100毫升样品进行了分析与SMIM总大肠菌或的存在大肠杆菌细菌。最可能的数量(或然数)的细菌样本化验了欧陆坊®(样品1 - 7)和使用Colilert-18在我们的实验室®在Quanti-tray2000®系统从Idexx®根据客户的建议(样本划分)。< 1意味着没有quanti-tray板块是积极的。SMIM的检测进行了18 h在37°C。总大肠菌,OD420 nm强度(黄色)测量。符号(+ +)代表OD420nm > 0.5;(+ + +)意味着OD420 nm > 1.5 (+ + + +) OD420 nm > 2.5。大肠杆菌出现了与ESEλ460nm测量激光如上所述。符号(+)表示荧光强度> 2500。所有的实验都重复三次。三个实验的数值是手段。
媒体适合1在100毫升细菌检测
在商业中(Colilert-18®),这两个底物的浓度,1、7毫米ONPG和0,21毫米的杯子,这样酶β-galactosidase (K米4的4.45 x打败ONPG M)和β-glucuronidase (K米0.5 x 104米杯)在约80%的最大工作速度”V马克斯”(分别为79%和81%)。近似的酶促反应速率等于V“V”马克斯x / (K米+ S),使用一个底物浓度S = 10 x K米将保证反应速率V等于90.9%(10/11)的马克斯。检测可以使用更大的浓度从而提高衬底和ONPG和杯子的数量应该等于0.136克和0.018克,分别为100毫升的媒介。所有的媒体准备的成分在这个研究是补充表1中给出。所示图1一个底物浓度从1.7升级到2.5毫米ONPG从0.21到0.5毫米,杯(表示“+衬底”)提高细菌生长(OD600图1一个左面板)和增加的强度黄色废纸(OD420的信号图1一个右面板)18 h初始接种后100大肠杆菌细菌。添加另一个碳源如葡萄糖进一步提高增长(图1一个,左面板),但大大降低了检测灵敏度以废纸信号的强度(右面板),由于首选葡萄糖消耗超过半乳糖。
图1:媒体适用于1 100年细菌检测Ml.)和b) 100年的孵化大肠杆菌(EC18)细菌在100毫升Colilert-18或SMIM 18 h在37°C。然后衡量细菌生长(左面板)和荒地的信号(右面板)。结果是三个独立的经验+ / -标准差。+衬底表明中补充了ONPG 0136 g和0018 g的杯100毫升测试。+葡萄糖代表增加2% (W / V)葡萄糖媒体。c)废纸信号测量18 h在37°c在100毫升的成长文化Colilert-18或SMIM变量盐酸或氢氧化钠量除了获得博士学位))和b)的浓度0开始,3细菌/ 100μL导致每100毫升瓶一个细菌。
为了充分利用酶反应动力学,我们试图改善快速细菌培养基检测根据以下原则:1)提供唯一的碳源是β-Gal和/或β-Gluc基质,和2)介质的pH值设置为检测底物的吸光度最高波长(见材料与方法和补充表S1)。选中的衬底,ONPG和杯子,允许electivityβ-galactosidase(大肠杆菌群)和β-glucuronidase (大肠杆菌)积极的菌株。他们在最高使用合理的浓度。SMIM适合细菌生长和荒地的信号生成(图1 b)。删除从SMIM基质成分不允许细菌生长和不按预期发展废纸信号(图1 b)。添加2% (W / V)葡萄糖SMIM促进增长,但疗效降低检测水平。关于最佳pH值我们确定废纸SMIM和colilert-18信号强度®媒体在不同的pH值(图1 c)。在这两种媒体的荒地信号在Colilert-18 pH值7.5 8高®并在SMIM pH值10。我们确定SMIM的pH值接近8.7之前,约8.2之后,细菌生长。相比之下,Colilert-18®pH值变化从7.8到7.3在同一条件(数据未显示)。显然,pH值越高的SMIM确保亮废纸黄色开发(图1 d)。
饮用水标准(欧洲指令98/83 / EC)认为饮用水污染如果只有一个大肠杆菌细菌存在于100毫升样品体积。因此,我们检查的检测极限SMIM满足这个需求。在第一次尝试中,我们测量了增长和废纸信号18 h post-inoculation SMIM Colilert-18®。图1 d说明细菌生长比colilert略低SMIM(左面板OD600)但这荒地的信号亮(OD420右面板),支持,pH值的增加,补偿略有减少细菌生长。
因此,我们描述一个介质(SMIM)源自DMEM,可以检测一个细菌在100毫升20 - 30%的废纸信号强度比参考介质。
实时荧光和吸光度录音
监控香豆素的外观(杯)的荧光代谢物在培养基中,我们使用一个便携式激光激发装置配备一个二极管传感器(ESE)®)。设备放置直接接触培养基内的培养瓶和显示器荧光(补充图1),μ信号测雷竞技网页版量的重复性是评估使用独立接种文化生长在参考中Colilert-18®(图2一个)。三个独立的惯用语进行了100瓶里的细菌(图2一个,与50细菌(红线)和两个图2一个左面板,绿线)。荧光之间的重叠时间课程完全相同的孕生(iCFU相同),并达到2500年激光饱和信号同时运算器。图2一个右面板显示了三个独立实验的意思(100 iCFU从左边面板)+ / -标准差。
图2:采用实时μ和废纸信号测量。)孵化500(红色)或50(绿色)大肠杆菌(EC18)细菌在100毫升Colilert-18 18 h在37°C。μ排放在460 nm的文化是衡量每6分钟后激发ESE-laser在365海里。等量的细菌检测评估系统的再现性。个人数据绘制(左面板)或意味着红+ / -测量结果的标准偏差(右面板)。信号浸透在2500辆。b)μ信号在Colilert-18和SMIM评为)不同初始集落形成单位(iCFU)表示。c)所需的时间获得2 5倍初始信号(时间检测或运输大亨)策划与iCFU的日志。指数回归关系计算了每个媒体。实验曲线拟合方程y = (7×1010SMIM) e - 1635 x, y = (8×1010Colilert-18) e - 1789 x®。d)实时荒地的信号被记录(见材料和方法),接种4000 CFU。结果是三个独立实验的手段+ / -标准差。
同样,发展μ荧光信号被记录为不同iCFU (图2 b)Colilert-18®和SMIM 18 h (图2 b)。在这项研究中,我们定义时间检测(运输大亨)信号所需的时间达到初始值的2.5倍。ESE浸透在2500年结束的信号初始值的2.5倍。运输大亨在Colilert-18短®比在SMIM iCFU测试,表明Colilert-18®μ信号出现0到1小时前根据iCFU价值。
我们绘制时间检测(运输大亨)作为日志的函数(iCFU)和观察Colilert-18相同的指数关系®和SMIM文化(图2 c)。皮尔逊相关系数(两个实验> 0.98)表明过程的准确性,并允许测定水样的iCFU只是通过查看运输大亨对于一个给定的应变。这也验证方法的重现性高SMIM和Colilert-18®媒体。
我们也监控的发展废纸黄色在18 h 4000 iCFU接种环境大肠杆菌在Colilert-18 (EC18)应变®或SMIM,以及mono-SMIMo(图2 d)只包含一个衬底(表2)。Mono-SMIMo最大信号提出了一种高于其他两个媒体因为细菌只访问一个碳源(ONPG)导致更高的彩色产品积累(废纸)。轻微的信号还原的实验是由于细菌细胞积累较高根据OD600观察(数据未显示)。在SMIM和Colilert-18 SMIMo相比,®、细菌消化底物。黄色信号SMIM和mono-SMIMo检测速度比在参考介质(图2 d)。
| 基质和试剂 | 检测 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 基础培养基 | ONPG | 杯子 | X-gluc | 乳糖 | Triembarine | 总大肠杆菌群(TC) | 大肠杆菌(EC) | 区别TC-EC |
| SMIM | x | x | λ460纳米 | x | ||||
| Chromo-SMIM | x | x | x | |||||
| Mono-SMIMo | x | |||||||
| Mono-SMIMm | x | λ460纳米 | N /一个 | |||||
| Mono-SMIMx | x | N /一个 | ||||||
| SMIL | x | x | λ510nm | λ510纳米 | ||||
表2。媒体的特异性。颜色检测后显示的色彩中。λ460 nm和λ510海里表明媒体后荧光检测和表示波长激发后发出荧光紫外灯。Mono-SMIMo和SMIL不允许总大肠菌(TC)和之间的区别大肠杆菌(EC)。Mono-SMIMm和Mono-SMIMx不检测非大肠杆菌大肠杆菌群(总大肠菌)。基地中独自不允许任何细菌检测。
我们可以从这些实验得出代谢平衡的新基地中倾向于消费β-Gal基质(存在于所有的大肠杆菌群包括大肠杆菌)在β-Gluc的(只出现在大肠杆菌)。这可能是由于过度的乳糖操纵子(包括β-Gal表达式lacZ基因)诱导的Isopropylthiogalactoside (IPTG,数据未显示)。
培养基的特异性菌株不同的环境
我们测试了标准介质(Colilert-18®)在不同环境菌株(从欧陆坊购买®和描述的14])来评估其环境大肠杆菌群和选择性大肠杆菌细菌。同时,我们测试了SMIM相同的菌株。图3一表明两种培养基适合检测水生细菌大肠杆菌(EC1 EC31 ATCC8739)和2个非大肠杆菌大肠杆菌群菌株(CT4和CT5)] 18 h文化后如图所示的强劲增长(OD600海里)信号。两个non-coliforms克——(NC8)和克+ (枯草芽孢杆菌)株(从环境的起源)不会长在媒体上由于他们无法获得碳源被杯子和ONPG。总之,媒体都是选择性的环境大肠杆菌在非大肠杆菌菌株和大肠杆菌。Colilert-18®更好的促进细菌生长而SMIM明显倾向于荒地的信号(OD420海里)所看到的近2倍亮度信号的32个测试和检测大肠杆菌菌株和2大肠杆菌菌株(CT4 CT5)所示图3 b。这个观察从而概括观察用应变EC18 (图1 c)。我们因此SMIM介质用于估计总大肠杆菌群的存在与否大肠杆菌在现场样品中细菌(表1)。SMIM允许污染样品中总大肠菌群的检测(表1,样品1 - 11)和大肠杆菌环境样品中疑似暴发的原因大肠杆菌污染(样品1 - 5)。野外样品1 - 7已经收集和验证了大肠杆菌群的存在大肠杆菌由欧陆坊®。野外样品8 - 11已经被我们自己的收集和验证使用Colilert-18®Quanti-tray2000®方法。
图3:增长和检测环境的起源孵化500个细菌的细菌在100毫升Colilert-18或SMIM 18 h在37°C。31日水出生大肠杆菌(EC1-31), 1数据库大肠杆菌非(ATCC8739), 2大肠杆菌水源性大肠杆菌群(CT4和5),一个noncoliform克(铜绿假单胞菌)和1克+ (枯草芽孢杆菌)菌株被孵化。a)增长(OD600海里)和b)废纸信号(OD420海里)和增长来衡量。结果是三个独立的经验+ /标准偏差的方法。
SMIM因此敏感和选择性优于参考媒介环境的生长介质大肠杆菌和总大肠菌群检测。
SMIM派生的媒体成本有效的检测
β-Gal和β-Gluc基质是重要的酶选择性,因此应变(除了选择性抗生素,抗真菌和生存限制分子),我们进一步探讨了底物的性质和质量之间的关系大肠杆菌和大肠杆菌菌株检测。衬底的一部分必须是一个糖维持细菌生长,而另一部分是为了成为酶乳沟的检测结果。研制了许多彩色的底物来测试不同的酶的活动,并允许不同的生物物理检测手段。
SMIM已被修改为不同的单色或双色媒体通过切换不同的杯底物不需要荧光探测器。这允许便宜以来检测荧光探测器是昂贵的。Chromo-SMIM使用两种基质,ONPG X-gluc(补充表1)。X-gluc被β-glucuronidase裂解生成不溶性蓝分子(4 -溴,5-chloro indolyl)。培养基密度使蓝色染料在超过24小时保持悬浮在溶液和手动摇晃瓶子的足以resuspend沉淀(数据没有显示)。大肠杆菌孵化chromo-SMIM导致绿色染色介质而接种大肠杆菌细菌导致黄色文化(图4 b)。绿色介质展览两个光吸收峰的废纸和420海里(黄色)5-chloro 650海里(蓝色),4 -溴indolyl (图4一)。总大肠菌群只展览βgal活动导致的外观达到420海里(图4一)和检测到没有β-glucuronidase活动(图4 b)。第二个培养基,mono-SMIMx(补充表1)只包含x-Gluc,被用来证实5-chloro的广泛650海里吸收峰,4 -溴indolyl (图4一)发展蓝染色(图4 b)。
图4:SMIM派生的媒体。一)吸收光谱Chromo-SMIM或Mono-SMIMx媒体接种100 EC18 (大肠杆菌)或CT4(总大肠菌)细菌18 h孵化后35°C。b)照片显示的颜色表示媒体)后18 h孵化。c)荧光强度随时间释放在460 nm 10最初的细菌在SMIM或Mono-SMIMm孵化。1 d)检测细菌SMIL。结果意味着3独立瓶+ / -标准差。
两个额外的媒体称为Mono-SMIM媒体设计将只有一个衬底。这减少了碳源单一分子,提高了检测的灵敏度所选染料,从而减少所需的时间来检测所需的菌株。例如,上述mono-SMIMo(仅与ONPG)检测总大肠杆菌群,但不确定大肠杆菌。两个其他媒体,mono-SMIMx (X-gluc只有)或Mono-SMIMm(杯),识别大肠杆菌而不是其他大肠杆菌菌株。这样的媒体可以方便地用于获取强大和快速应变识别。这是说明图4 c荧光,表明杯出现如果使用mono-SMIMm提前四个小时而不是SMIM。
总之,使用一个衬底介质导致更快和更具体的细菌检测,但是需要parallelisation多个测试快速应变识别。
SMIM, Chromo-SMIM Mono-SMIM (表2)是基于底物的原则(这决定了培养基的特异性)导致检测由特定的裂解酶。SMIL介质使用乳糖,β-Gal的天然底物,这表明大肠杆菌群大肠杆菌细菌能够生长在SMIL,但其他生物。β-Gal-induced乳糖乳沟释放两个糖(葡萄糖和半乳糖)在一个单一的酶促反应实现更快的增长。因为没有比色和荧光分子被释放后乳糖β-Gal乳沟,SMIL需要细菌检测系统。
Triembarine acetoxymethylester (Triembarine点)是一个pro-fluorophore能够渗透到死亡,活细菌。酯酶活的细菌,但不是死的,除去Triembarine acetoxymethylester组。这使得Triembarine成为荧光同时被困在细胞内部,导致积累,因此信号放大。这个分子展品低信号背景和高细菌外显率能力(14]。揭示生活的细菌生长在SMIL, Triembarine点添加到前中30的荧光阅读。SMIL允许大约106细菌的检测30分钟后孵化与Triembarine(数据未显示)。
因此,我们决定测量所需的时间来检测单个细菌SMIL。,1个细菌在100毫升的SMIL中孵化,孵化出了35°C,和100年μL样本处理Triembarine是每小时和荧光测量(见材料和方法)。我们观察到,SMIL可以明确地揭示1的存在大肠杆菌11 h的孵化后细菌(图4 d)。
在这个工作我们开发新的媒体检测污染大肠杆菌和大肠杆菌菌株在环境和饮用水样品。每一个媒介是细菌生长速率之间的妥协和大肠杆菌群和/或检测大肠杆菌菌株,检测过程的成本。
选择性的检测
高选择性的媒介需要为了分配病原体身份高的信心。单一基质媒体(正确的组合的抗生素、抗真菌和增长限制分子)精巧的选择性是只有一个细菌群体的成长。因此,发现只有一个细菌群会忽略所有其他物种在样例。尽管单一基质媒体可能被视为太具体,他们方便地提供一个检测时间短和一个强烈的信号。另一方面,多种污染物的检测需要多个并行的化验。拥有一个完整的屏幕上的细菌样本的人口生活将更容易与多个基板Chromocult媒体发达®分析(15)能够区分多个细菌子组不需要任何特定的探测器。但是慢,需要样品制备。SMIM和Chromo-SMIM是好没有大肠杆菌群之间的妥协使简单的歧视,存在总大肠菌或特别的存在大肠杆菌只有。
检测的速度
在公共卫生方面,“快是检测,更好的测试”。然而,从技术的观点一些方法需要复杂的探测器,这可能是太贵了对于一般使用。手工系统中数据记录是依赖于人类活动将不会获得1或2小时更快,因为永远都是最小差距12 h工人叶子和回来的时间工作。自动化设备是最好的方法快速检测媒体盈利但需要昂贵的仪器与Colifast一样®方法。再次,需要和增益之间的平衡取决于预期。标准和新媒体可以根据所需的时间来检测细菌在100毫升(补充图2),Mono-SMIMm SMIL-X媒体优化快速检测单个细菌群。
检测信号的强度
信号的强度在中可能的关键样品呈现高自发荧光背景,或很受污染的样品(可能现在的高密度,和/或淬火分子)。信号的强度也是非常重要的对于数据记录设备的敏感性可能会有所不同。人类的眼睛是一些媒体的数据记录设备,所以最好是避免沾污倾向的媒体可能会导致争议的决定。由于每个数据记录设备(包括人眼)检测极限,他们也有饱和分和提高信号在这个阈值将不会伴随着利益的决策。β-galactosidase强度(大肠杆菌群和基质信号大肠杆菌)在每个媒体中描述这项工作(SMIM、Chromo-SMIM Mono-SMIM)在Colilert-18比®媒介。然而,β-glucuronidase信号是一个小缺点是(双底物中只有例如SMIM)与Colilert-18相比。然而这不是问题μ信号的实验主要是在ESE激光饱和。此外,大肠杆菌检测不仅依靠β-glucuronidase活动检测而且β-galactosidase活动。
样品处理
治疗所需的样本测试可能更重要:首先,如果样品需要具体的操作,需要专门的工人。测试样本必须包括简单的步骤,如添加水样冻干的媒介,是球场上最简单方法实验。此外,冻干的媒体产品保护的最佳选项(杯子和ONPG只是在黑暗中稳定,在无氧的解决方案中,数据未显示)。相比之下,自动化设备将更喜欢液体集中媒体分配适当的数量,但这需要(1)集中解决方案,(2)添加剂在一个单独的坦克(因为他们在介质不稳定),和(3)水的样本。(例如Chromocult过滤方法®)需要一个过滤装置和耗时。基于聚合酶链反应(PCR)技术被认为是最挑剔,更快和更敏感的方法,但需要样品(DNA提取)要求极端的保健、治疗复杂的协议,专业工人,不能轻易场上执行(11,16- - - - - -19]。
数据记录
数据记录可以实现定性通过观察一个瓶子(这是最简单的方法)或自动化设备,直接给出一个量化的结果,可以发送不需要任何人工干预。这两个方法之间最大的区别是他们的价格可能会有所不同从非常expensiv非常划算的大肠杆菌lert-18®和SMIM中间媒体可以通过人眼直接观察为荒地的颜色,但是需要一个紫外灯使用μ(或ESE激光自动记录)信号。自动化(例如Colifast®)或半自动(例如SMIM ESE激光)记录装置的优势能够触发警报在年底前尽快测试信号达到一个阈值。Chromo-SMIM是最方便的,因为它不需要任何区分大肠菌和设备大肠杆菌细菌。
影响和观点
SMIM和SMIM-derivate媒体提供一个更好的β-galactosidase(存在于所有大肠菌)活动检测与经典方法相比。Chromo-SMIM不需要任何设备读取结果除了人类的眼睛。信号实时的方式在这些媒体可以使用指定的设备,允许自动报警触发快速配水逮捕的粪便污染。SMIL-X似乎适合污染的快速检测。
支持的工作是一个从法国工业Oseo-Innovation格兰特。作者感谢技术平台PCBIS (http://www.pcbis.fr/en/)的仪器。ES是法国工业的家伙。
