鼠尾草超繁研究新进展

摘要

建立任何菌根化计划的主要问题之一是确保无菌、一致和标准化的大规模生产植物材料．在本研究中，我们成功地建立了一种鼠尾草快速繁殖的方法。该过程是从成熟的salviifolius植物中切除的节段开始的，因为它的菌根能力而被选择。Murashige和Skoog基础培养基添加赤霉素(0.5 mg/L)和6-苄基氨基嘌呤(0.5 mg/L)是增殖效果最好的培养基，在相同的基础培养基中添加吲哚-3-丁酸(0.5 mg/L)也能成功生根。所提出的方法是一种新颖的方法，因为它允许从成熟外植体开始快速繁殖C. salviifolius，在这里首次报道，使用较低的植物生长监管机构浓度比之前报道的浓度高

关键字

鼠尾草，微繁殖，菌根化，GA3, BAP, IBA

简介

水仙属(水仙科)是地中海植物区系中最具特色的属之一[1］．它包括一个大约20个多年生植物群灌木物种分布在整个地中海地区和加那利群岛，都有相同的独特特征，叶片、茎和花萼上的不同毛发类型的组合[2，3.］．对于地中海环境，citstus物种也表现出一系列特定的适应性，例如，依赖火的种子萌发，依赖昆虫的授粉，flower-dependent繁殖和春季物候学[4］．

在地中海生态系统中发生的许多生态过程都涉及到池类物种[5］．此外，在没有宿主树的情况下，它们支持着庞大而丰富的真菌菌群，构成了菌根真菌接种体的储存库[6］．总共超过200个真菌的物种，属于40属，据报道与鸡属有关。其中几种可食用的子囊菌属，主要包括块菌属和Terfezia属，俗称松露[7］．松露非常抢手，有些品种在当地市场上售价极高，但由于松露具有外生菌根的性质，必须在果园中与它们的寄主一起种植[8］．正如Giovannetti和Fontana所提出的，各种各样的池香树(和其他池香科植物)环境和生态需求这使它们成为增加松露生长栖息地范围的理想候选人[9］．因此，在松露林复群的初级阶段接种松露菌体，已成为一种非常有趣的松露植物新用途，具有巨大的经济价值和开发潜力林业目的(10］．

salviifolius L.是一种矮亚灌木，高可达1米，叶为卵形至圆形，花为白色，是该属在地中海盆地分布最广的种[3.］．它可以发生在沙质中土壤在广泛的栖息地，并经常被报道为各种Terfezia物种的植物宿主，这使它成为在广泛的栖息地计划种植Terfezia的最佳选择之一[7，11，12］．

传统的繁殖方法仍然是获得许多观赏品种的主要手段[13］．然而，当使用野生品种时，无性繁殖被证明是有问题的，因此在90年代开始测试体外微繁殖方法，以克服从选定个体中克隆产生的问题[14-18］．人们普遍认为，组织培养技术是在有限空间和时间内快速繁殖和生产真型植物的可靠和可行的替代方法[19］．这些离体微繁殖技术的成功和效率受到许多因素的影响，如植物基因型、外植体的生理状态、培养基和植物生长调节剂[20.］．

细胞分裂素激素的含量是影响西藤快繁的重要因素之一，尤其是在茎部增殖阶段。的确，M 'Kada等人研究了从成熟的citus × purpureus Lam植物中切除的节段。，observed that the in vitro establishment of the initial explants represented a limiting step, since half of them were unable to develop new shoots. Cytokinins are known to delay senescence, promote mitosis, and stimulate differentiation of the meristem into shoots and roots [20.］．因此，在早期的工作中，为了刺激从幼苗中切除的新芽的增殖，实验了高浓度的细胞分裂素，并取得了令人满意的结果[3.，13］．尽管这些早期的实验结果是成功的小繁殖的不同品种，其中c . salviifolius，已知高水平的细胞分裂素易于诱导愈伤组织，这将完全损害微繁殖植物的克隆性质，并抑制单个芽的伸长[15，20.］．在这种情况下，向植物组织培养基中添加赤霉素酸(GA3)已被证明可减少或阻止体胚、不定根或芽的形成，并促进节间延伸和增强顶端优势[21］．最近，已针对C. creticus和C. clusii开发了仅使用少量PGRs的成熟citus植株的茎尖再生的改进方案[13，22］．

据我们所知，到目前为止，还没有关于植物芽再生的报道c . salviifolius使用低浓度的PGRs，从成熟的外植体开始，具有很高的菌根能力。因此，本研究的目的是建立一种快速优化的离体微繁殖方案，以快速繁殖和生产真正的柑桔属植物，从而使其应用于菌根植物的大规模生产，最终使Terfezia在更大范围的栖息地种植。

材料与方法

植物材料

C. salvifolius植株生长在Évora附近的Herdade da Mitra (Alentejo，葡萄牙)(38°32′n;8°01 'w;a.s.l 220米)。，were collected on November 2013 in a Montado area with natural shrub undercover dominated by Cistus spp. The area belongs to the Mediterranean pluviseasonal-oceanic bioclimate and is located in the low mesomediterranean bioclimatic belt. It has a dry to subhumid ombrotype with a mean annual temperature ranging from 9.2°C to 21.5°C and a mean annual rainfall of 664.6 mm [23，24］．用1% NaOCl (w/v)漂白剂清洗和消毒两次，盆栽在无菌基质中(沙子、蛭石、土壤;1:1:1)，置于生长箱中(24°C/21°C(+1°C)昼夜温度，光照15 h，在冷白色荧光灯(36 μmol-m-2s-1)下培养30 d。用储存在UEVH真菌标本室的干燥孢子粒中获得的孢粉Terfezia arenaria孢子接种植株。根据Giovannetti和Mosse提出的方案，在接种3个月后评估植物的存活和菌根率[25］．93%的植株存活下来，其中82%成功地与T. arenaria菌根结合。所有的幼苗在这些人工生长条件下维持24个月，直到成为成苗。在此期间，对菌根持久性进行评估，选择微根化率较高(95%)的植物作为体外培养的初始外植体来源。单节段，每个节段有两个相反的芽，从活跃生长的嫩枝上切除。

外植体消毒

外植体(单节段)表面消毒分为四步:1)在70%乙醇中浸泡2分钟;2)用双蒸馏水冲洗一次;3)浸泡在氯化钙中₂- o₂(1%)用8滴Tween 20滴20分钟;4)用双蒸馏水冲洗三次。

拍摄扩散

在培养建立阶段，作者观察到c . salviifolius外植体在MS中生长基础培养基没有增长监管机构没有长出新芽。此外，外植体表现出高水化症状和外观发育不良，导致高死亡率和低增殖率。在基础培养基中加入0.5 mg/L的赤霉素酸(GA3)(数据未显示)，解决了后面的问题。然而，芽的增殖率仍然不能满足我们的目的[26］．因此，为了增殖目的，有必要测试不同的培养基配方，并确定添加细胞分裂素是否会提高新芽的产生。为此，我们在MS和WPM两种基础培养基中分别添加了GA3 (0.5 mg/L)和6-苄基氨基嘌尿(BAP) (0.5 mg/L)，分别为MSG (MS+0.5 mg/L GA3)、MSGB (MS+0.5 mg/L GA3+0.5 mg/L BAP)、WPMG (WPM+0.5 mg/L GA3)、WPMGB (WPM+0.5 mg/L GA3+0.5 mg/L BAP) [27］．

每个处理50个外植体，5个培养瓶各10个，共200个外植体。外植体每30天传代到新鲜培养基中培养3个月。培养物置于24°C/21°C(+1°C)昼夜温度、光照时间15 h的生长室中，在36 μmolm-2s-1低温白光荧光灯下培养。试验结束后，确定新梢数和每梢节数。以每个外植体的芽数来评价增殖率。

加油

鉴于外植体在之前的培养基配方中没有生根，因此进行了生根试验。在芽增殖阶段，以MS为基础培养基为最佳培养基，故选择MS为基础培养基。诱导植物生根的方法主要有两种:1)直接向培养基中添加生长素，2)外植体促进生长素的自然产生。为此，使用MS基础培养基，添加或不添加活性炭和/或吲哚-3-丁酸(IBA)对不同配方进行了测试，即:MSC (MS+0.2%的活性炭)，MS0.1 (MS+0.1 mg/L IBA)， MS0.5 (MS+0.5 mg/L IBA+0.2%的活性炭)，MS0.5 c (MS+0.5 mg/L IBA+0.2%的活性炭)。

试验每个处理使用50个外植体，5个培养瓶中每个培养瓶中10个外植体，共250个外植体。外植体每30天传代到新鲜培养基中培养3个月。在此期间，将培养物置于昼夜温度为24°C /21°C(+1°C)的生长室中，在36 μmolm-2s-1的冷白色荧光灯下光照15 h。试验结束时，记录各外植体的根数和分根长度。以每个外植体的根数来评价生根率。

统计分析

实验在完全随机区组设计下进行，数据行为通过方差分析进行评估。通过分离分析来估计处理之间和处理内部的差异，使用最不显著的差异也防止了新芽和/或叶片的高水化(数据未显示)，允许成功建立c . salviifolius体外培养。

结果

拍摄扩散

c . salviifolius在不含生长调节剂或仅含细胞分裂素的培养基上培养的外植体不能生长，表现出高水化症状和外观发育不良。在基础培养基中添加0.5 mg/L GA3，不仅提高了新梢伸长，而且防止了新梢和/或叶片的超水现象(数据未显示)，使其成功建立c . salviifolius体外培养。

总体而言，MS配方的培养建立比WPM更有效，在每个外植体的节数和每个外植体的芽数方面存在显著差异。在MS添加0.5 mg/L BAP时，芽增殖率最高(表1)，因此最适合用于倍增目的的介质是MSGB

表1:在4种培养基(MS +0.5 mg/L GA3;MSGB: MS+0.5 mg/L GA3+0.5 mg/L BAP;WPMG: WPM+0.5 mg/L GA3;WPMGB: WPM+0.5 mg/L GA3+0.5 mg/L BAP)。相同字母后的平均值在p≤0.05时差异不显著。

加油

在所有试验培养基上均成功地进行了根诱导。在MS基础培养基中添加0.5 mg/L IBA，生根率最高(8根/外植体)表2)，显著地产生更多和更长的根。单独添加活性炭可诱导70%以上外植体的根形成，但数量和长度都很少，不能保证植株在接下来的步骤中存活。同时添加炭和IBA对根率无显著影响。

表2:生根率(n°根/外植体)和在五种测试介质(MSC: MS+0.2%活性炭;MS0.1: MS+0.1 mg/L IBA;MS0.5: MS+0.5 mg/L IBA;MS0.1C: MS+0.1 mg/L IBA+0.2%活性炭;MS0.5C: MS+0.5 mg/L IBA+0.2%活性炭)。相同字母后的平均值在p≤0.05时差异不显著。

讨论

建立任何菌根化计划的主要问题之一是确保无菌、一致和标准化的大规模生产植物材料．组织培养技术有潜力克服从选定的个体克隆生产的问题，因为它们提供了快速繁殖和生产真实型植物的手段。关于茜草科植物离体繁殖的报道较少，迄今为止，只有Iriondo等报道了一种适用于茜草科植物的微繁殖系统c . salviifolius从幼苗的节段开始，使用高浓度的BAP [13］．在本研究中，我们解决了这些问题，并开发了第一个从成熟的丹参植株中进行芽再生和生根的离体微繁殖方案。此外，我们的研究表明，有可能获得与Iriondo等人观察到的相似的增殖率。[15]，使用少量(0.5 mg/L)的6-苄基氨基嘌呤(BAP)，从而降低了体细胞无性系变异的风险。一个值得注意的区别是，在培养建立和茎部增殖阶段需要添加0.5 mg/L GA3，以提高茎部伸长和防止过度水化。对这一事实的一种可能解释是所选植物的遗传特征，其代谢途径可能与其他植物略有不同。所选植物表现出显著的菌根能力，外生菌根真菌可产生和释放植物激素，其中GAs [28-30.］．因此，在培养基中添加GA3可能有助于模拟自然条件，这可能有利于植物的建立。

使用MS0.5获得的生根率与Iriondo等人之前的工作相比有所改善。[15]，结果表明，IBA的生根率为4.4根/外植体(≈1.0 mg/L)。添加木炭并没有提高根产量，事实上，木炭可能是由于抑制了植物对IBA的吸收而降低了生根率。

结论

综上所述，本研究提出了一种新的方法，该方法允许快速的乘法c . salviifolius从成熟外植体开始，使用比之前报道的低浓度的植物生长调节剂。这是体外实验微体繁殖该方案可用于所选的水仙花基因型的繁殖和生产，特别是当目的是大规模生产用于菌根化测定的植物材料时。

确认

本工作得到了项目“沙司菌根化Terfezia arenaria (Moris) Trappe -在沙漠松露生产中的应用”(alt20 -03- 0145-联邦-000006)的支持。

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