一步RT - PCR检测呼吸道合胞体病毒患儿下呼吸道感染

文摘

评估的诊断效用逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)检测呼吸合胞体下呼吸道感染的病毒(下呼吸道感染)。横截面的诊断准确性研究在三级保健医院。总130例下呼吸道感染2个月到5岁之间包括在这项研究中。聚集鼻拭子样本处理检测RSV病毒抗原快速检测方法和rt - pcr。RSV中检测出14个病人通过快速方法和rt - pcr在16个病人。14阳性病例的快速抗原的方法,13个学科也积极通过rt - pcr,但一个是负面的。有三个科目,只有rt - pcr阳性。rt - pcr的敏感性和特异性分别为92.85%和97.41%。RSV是更高比例的证明细支气管炎年龄为6个月以下,特别是相对于肺炎。rt - pcr分析RSV是一个高度敏感的检测方法。如果能提供一个合适的周转时间、分子检测应该用于RSV诊断。

关键字

毛细支气管炎,下呼吸道感染(下呼吸道感染),逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)、呼吸道合胞体病毒(RSV)。

介绍

急性下呼吸道感染(ALRTI)是全球儿童死亡率和发病率的主要原因(1]。病毒占50 - 90% ALRTI在年幼的孩子2)与呼吸道合胞体病毒(RSV),副流感病毒病毒(PIV)、流感病毒A和B和人类metapneumoviruses (hMPV)是最常见的确定3- - - - - -5]。RSV是唯一最重要的病毒性引起下呼吸道感染的婴幼儿期(下呼吸道感染)在全球范围内(6]。小孩子的RSV感染率接近70%在第一年的生活,有出现发病高峰年龄在2 - 4个月(7]。

病毒占大约50%的肺炎和报告病例的90%细支气管炎在婴儿期(6]。它也可能引起儿童哮喘的后续发展,儿童最常见的慢性疾病(8]。

下呼吸道感染通常是诊断临床理由以最小的努力来识别准确的病因代理人。这是病毒感染的情况下尤其如此。这个局限性壳反映准确的流行病学数据强加的限制效用不干预措施,这些措施成为可用。RSV细支气管炎目标年幼的孩子,主要是那些不到两岁。

RSV感染的实验室诊断与困难困扰由于病毒的不稳定性,以及要求细胞培养设施和适当的诊断试剂。然而RSV诊断是重要的适当的管理受灾儿童和预测未来的并发症。本研究试图了解rt - pcr一步识别RSV病因及其诊断实用程序通过比较这个测试批准抗原快速诊断测试。

材料和方法

这是一个横断面研究,在儿科开展和微生物学在大学医学科学大师的羊毛阁下医院,印度从2011年8月——2012年2月。研究机构伦理委员会批准和监护人的知情同意是病人之前收集的样本。每个病人的详细问卷调查了包括相关病史。

聚集鼻棉签收集的130个孩子参加我们医院的儿科门诊和病房ALRTI的症状和体征。研究对象包括儿童的性别从2个月到5岁。儿童临床或辐射特性符合细支气管炎和肺炎基于标准病例定义为研究[9,10]。毛细支气管炎诊断婴儿出现咳嗽和呼吸急促的呼吸窘迫;听诊发现喘息有或没有爆裂声。没有明显的支气管扩张剂反应。胸部射线照片通常只显示恶性通货膨胀。肺炎的特点是出现发烧和呼吸急促,有或没有胸壁撤稿。劈拍声出现在听诊和支气管呼吸的整合。这些受试者不呼吸紧促,听诊发现喘息被诊断为例下呼吸道感染相关的喘息(WALRI)。标签的孩子tachypneic,世卫组织准则随访(年龄< 2个月:呼吸速率> 60岁/分钟;年龄2 - 12个月内:呼吸速率> 50个/分钟;年龄> 1年:呼吸速率> 40 /分钟)。受试者的临床诊断支气管哮喘(基于喘息,历史的重复类似的情节,阳性家族史的支气管扩张剂治疗支气管哮喘和快速反应)被排除在研究之外。

鼻拭子获得了从右鼻孔2到3厘米的深度使用无菌植绒拭子,然后插入一个瓶含2.5毫升的病毒传输介质(5%磷酸胰蛋白示肉汤,0.5%牛血清白蛋白,磷酸盐和抗生素)和运输在一小时内冰实验室和48小时内收集处理。

样本处理立即收到实验室的病毒RNA隔离。使用ZR病毒RNA病毒RNA提取设备^TM(Zymo研究)制造商的指示。RNA是存储在- 80 0 c整除,直到使用。

快速RSV抗原检测是使用Binax现在RSV基于检测试纸的测试套件的原则。短暂,RSV抗原存在于样本对绑定anti-RSV共轭抗体。所得的antigen-conjugate复合物被固定化anti-RSV抗体形成样本行(11]。黄金标准被定义为任何抗原快速检测方法的阳性样本。所有的130个样本都放大1步骤RT - PCR使用以下RSV G -蛋白特异性引物预计带大小为287 bp使用正向引物- (nt542 - 564, 5 ' 3 ' GCAGCAACAATCCAACCTGCTGG)和反向引物——(nt806 - 828, 5 ' 3 ' ATCGGAGGAGGTTGAGTGGAGGG)。使用Primer3软件和定制合成引物的设计。常规rt - pcr进行热循环(埃普多夫)。的Novagen Toyobo一步法RT PCR工具包用于1步转换的病毒RNA cDNA,然后用相同的放大管根据制造商的指示。总之,25μl 2 x RT - PCR快速掌握混合,2.5μl 50 mM锰(OAc) 2、1μl反向和正向引物,2μl提取RNA和残留的水被添加到反应混合物的最后一卷50μl。聚合酶的激活在900 c进行了30秒,反转录在600 c为30分钟,变性在940 c为1分钟,其次是35周期放大(变性在940 c为30秒,退火,在30秒,每年收取600 c扩展在720 c为1分钟),最终在720 c扩展7分钟,40度举行。PCR分析了产品在1.5%琼脂糖凝胶和扩增子的大小与适当的DNA梯。正面和负面的控制运行每批PCR反应。 Positive control consisted of known sample of RSV RNA isolated from cell culture samples (Figure.1)。

敏感性和特异性RT - PCR计算。

观察和结果

在研究的130名患者,最大(51)7 - 12个月大的时候后面跟着患者之间年龄2 - 6个月(47)。在这项研究中,我们发现最大的患者伴有肺炎(63/130)其次是毛细支气管炎(40/130)和休息(27/130)诊断为哮喘相关的下呼吸道感染(WALRI)。
在目前的研究中,毛细支气管炎患者主要分布在年龄越低,尤其是在2 - 6个月的儿童(> 72%),而肺炎被发现广泛的年龄分布。

RSV的14个样本中,检测出130年的快速方法。然而,通过rt - pcr, 16 130为RSV是积极的。共17个样本阳性RSV由至少一个技术。14阳性病例的快速抗原的方法,13个学科也积极通过rt - pcr,但一个是负面的。有三个主题,积极通过rt - pcr (表1)。

rt - pcr的敏感性和特异性分别为92.85%和97.41%。,阳性预测值(PPV)以及阴性预测值(NPV)分别为81.24%和99.12%。在这项研究中,RSV感染可能在更高比例的细支气管炎。22.5% (9/40)RSV积极观察病人临床诊断为毛细支气管炎,肺炎的6.34%(4/63)和3.7%(1/27)在WALRI。

讨论

快速检测RSV感染的儿童和婴儿可以有效的病人管理的关键通过适当的药物治疗,减少不必要的使用抗生素,预防医院内传播。RSV感染的诊断可以通过观察临床症状和体征,胸片特点,快速抗原检测、病毒文化,或临床标本的rt - pcr (12]。

传统的病毒文化往往是耗时的敏感性较低。标本质量差和/或不合适的样品处理,显著降低了细胞培养的敏感性,引起假阴性结果(13]。此外,隔离在细胞培养中没有足够快速影响病人管理(14]。分析临床标本酶免疫分析法、免疫层析法(ICT)技术代表了另一种病毒检测方法具有较高的特异性和灵敏性较短时间需求相比,文化技术。然而,温和的抗原捕获灵敏度分析限制儿童的急性期样本的方法,摆脱病毒显著高效价比成人(15]。基于ICT技术,快速测试RSV检测(现在Binax RSV)开发和证明令人满意的敏感性(89%)和特异性(100%)相比,细胞培养分离(16]。这种快速测试主要是用于测试为RSV进入医院和临床测试。

一些出版物报道使用rt - pcr检测RSV [17,18]。分子方法的主要好处是他们的极端敏感性和高特异性取决于合适的引物的选择。现在他们的缺点之一是,大多数的PCR协议识别的目标只有一个病毒。此外,这些方法是昂贵的和非常容易污染,因此需要高技术实验室标准。因此,核酸扩增方法尚未在临床诊断实验室常规。个人之间缺乏整合技术实验室和失踪的外部质量控制只允许一个广义的可用性评估的有效性和实用性。

在这项研究中,rt - pcr与快速评估和比较抗原检测为RSV FDA批准使用130鼻拭子检测。RSV是发现在10.76%和13%的病人分别由快速抗原试验和rt - pcr进行了研究。这个结果是一致的与其他调查人员发现,13%由抗原检测方法(积极的样本19]。此外rt - pcr检测到额外的三个阳性样品,否则错过了抗原测定。这些结果强调在RSV rt - pcr检测的优越性与抗原测定。快速抗原的发现方法-但rt - pcr阳性样本可能是由于低浓度测定的临床样本中存在的病毒。然而,一个示例积极快速抗原的方法测试通过rt - pcr是负的。可能存在的可能性,PCR抑制剂或退化的RNA模板(20.]。

因为有特定限制为RSV检测文化、rt - pcr提供了几个优势:(i)检测低滴定度(ii)的潜在稳定试验后试样冻融和(iii)的测定不受被动中和抗体或抗病毒药物治疗。这些潜在优势促进多中心研究发病机理和治疗试验。

我们得出结论,快速和可靠的检测RSV感染病人应该精简高效的管理。令人满意的敏感性和特异性的快速检测是一个有用的工具在急诊室例行检测。虽然PCR是更昂贵的,需要技术技能和时间,增加结果的精度满足所需的额外资源特别是住院。在住院病人RSV感染的诊断的准确性是更重要,而不是时间可以消除需要测试和使用抗菌素。然而,在门诊时间更快速抗原检测的关键证明使用。

结论

总之,我们建议使用rt - pcr试验检测RSV是高度敏感的方法调查RSV在临床标本中获得诊断,预防和治疗。如果能提供一个合适的周转时间、分子检测应在任何时候提供的黄金标准RSV诊断。总的来说,这可能有助于降低院内传播的发生率,早期诊断和改善临床管理。

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