一步RT- PCR法检测儿童下呼吸道感染呼吸道合胞病毒

摘要

目的探讨逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)在呼吸道疾病诊断中的应用价值合胞体下呼吸道感染病毒(LRTI)。三级保健医院横断面诊断准确性研究。研究共纳入130例2个月至5岁之间的下呼吸道感染病例。采用快速抗原检测法和RT-PCR法对蜂群鼻拭子进行RSV病毒检测。快速法检测14例RSV, RT-PCR检测16例。快速抗原法阳性者14例，RT-PCR阳性者13例，1例阴性。另有3例仅RT-PCR阳性。RT-PCR的敏感性和特异性分别为92.85%和97.41%。RSV的比例要高得多细支气管炎与肺炎相比，尤其是6个月以下的儿童。RT-PCR检测是一种灵敏度较高的RSV检测方法。如果能够提供适当的周转时间，则应使用分子检测进行RSV诊断。

关键字

细支气管炎，下呼吸道感染，逆转录聚合酶链式反应，呼吸道合胞病毒(RSV)。

简介

急性下呼吸道感染(ALRTI)是全球幼儿死亡和发病的主要原因之一[1］．病毒占幼儿ALRTI的50-90% [2]其中呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、甲型和乙型流感病毒以及人偏肺病毒(hMPV)最为常见[3.-5］．RSV是全球婴幼儿期下呼吸道感染(LRTI)最重要的单一病毒原因[6］．幼儿在出生后第一年的RSV感染率接近70%，2 - 4个月之间的发病率最高[7］．

该病毒约占所有肺炎的50%，高达90%的报告病例细支气管炎在婴儿期[6］．它还可能使儿童易患哮喘，这是儿童最常见的慢性疾病[8］．

下呼吸道感染通常是在临床诊断的基础上，以最小的努力确定准确的病原。在病毒感染的情况下尤其如此。这种局限性反映在精确的流行病学数据的有限效用上，一旦有了这种干预措施，就会产生次优干预措施。RSV毛细支气管炎的目标是幼儿，主要是两岁以下的儿童。

由于病毒的不稳定性，RSV感染的实验室诊断困难重重细胞培养设备和适当的诊断试剂。然而，RSV的诊断对于患儿的正确治疗和预测未来的并发症非常重要。目前的研究是试图了解一步RT-PCR鉴定RSV病因及其诊断效用，通过比较该试验与已批准的快速抗原检测试验。

材料与方法

这是一项横断面研究，于2011年8月至2012年2月在德里大学医学科学学院和Guru Teg Bahadur医院的儿科和微生物学系进行。该研究得到了机构伦理委员会的批准，并在收集样本前从患者监护人那里获得了知情同意。每位患者填写详细的问卷，包括相关的临床病史。

聚集鼻采集我院儿科门诊和病房130例有ALRTI症状和体征的患儿拭子。研究对象包括2个月至5岁的男女儿童。根据标准病例定义，临床或放射学特征符合毛细支气管炎和肺炎的儿童纳入研究[9，10］．出现咳嗽和呼吸急促伴呼吸窘迫的婴儿被诊断为毛细支气管炎;听诊显示喘息伴或不伴咯吱。对支气管扩张剂无明显反应。胸部射线照片通常只显示恶性通货膨胀。肺炎以发热和呼吸急促为特征，伴有或不伴有胸壁收缩。在实变的情况下，听诊和支气管呼吸时出现咯吱声。呼吸不畅且听诊发现喘息者诊断为喘息相关下呼吸道感染(WALRI)。对于标记为呼吸过速的儿童，遵循世界卫生组织指南(<2个月:呼吸频率>60/分钟;2-12月龄:呼吸频率>50/min;年龄>1岁:呼吸频率>40/ min)。临床诊断为支气管哮喘的受试者(基于喘息、重复类似发作史、阳性支气管哮喘家族史以及对支气管扩张剂治疗的快速反应)被排除在研究之外。

使用无菌的蜂群棉签从右鼻孔2 - 3cm深处获得鼻拭子，然后将其插入装有2.5 ml病毒传输介质(5%胰糖磷酸盐汤、0.5%牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲盐水中的抗生素)的小瓶中，并在1小时内用冰运输到实验室，并在收集后48小时内进行处理。

样品收到后立即在实验室进行病毒RNA分离处理。病毒RNA采用ZR病毒RNA试剂盒提取^TM(Zymo Research)遵循制造商的说明。RNA在- 80℃下等份储存直到使用。

基于免疫层析原理，采用Binax NOW RSV检测试剂盒进行RSV抗原快速检测。简单地说，样本中存在的RSV抗原与抗RSV偶联抗体发生反应。所产生的抗原偶联复合物被固定的抗rsv抗体捕获，形成样本线[11］．金标准定义为任何通过快速抗原检测方法检测阳性的样品。所有130份样品均采用RSV G蛋白特异性引物进行1步RT- PCR扩增，预期条带大小为287bp，正向引物(nt542-564, 5 ' -3 ' GCAGCAACAATCCAACCTGCTGG)和反向引物(nt806-828, 5 ' -3 ' ATCGGAGGAGGTTGAGTGGAGGG)。引物采用Primer3软件设计，自定义合成。常规RT-PCR采用热循环仪(Eppendorf)。使用Novagen Toyobo一步RT - PCR试剂盒将病毒RNA一步转化为cDNA，然后按照制造商的说明在同一管中进行扩增。简而言之，取2x RT- PCR Quick Master Mix 25μl, 50mm Mn(OAc)2 2.5μl，反向引物和正向引物各1μl，提取的RNA 2μl和剩余水，制成最终体积为50μl的反应混合物。聚合酶在900C下激活30秒，600C下逆转录30分钟，940C下变性1分钟，然后进行35次扩增循环(940C下变性30秒，600C下退火30秒，720C下延伸1分钟)，720C下最终延伸7分钟，40C保存。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行分析，并将扩增子大小与合适的DNA梯进行比较。每批PCR反应均进行阴性和阳性对照。 Positive control consisted of known sample of RSV RNA isolated from cell culture samples (Figure.1）.

计算RT- PCR的敏感性和特异性。

观察与结果

在研究的130例患者中，最多(51例)年龄在7-12个月之间，其次是2-6个月的患者(47例)。在这项研究中，我们注意到大多数患者表现为肺炎(63/130)，其次是细支气管炎(40/130)和休息(27/130)，诊断为喘息相关的下呼吸道感染(WALRI)。
在本研究中，细支气管炎患者主要分布在低年龄组，特别是2-6个月的儿童(> 72%)，而肺炎患者的年龄分布更广。

在130份样品中，快速检测出14份RSV。但是，通过RT-PCR检测，130名患者中有16名RSV阳性。共有17份样本通过至少一种技术检测RSV阳性。快速抗原法阳性者14例，RT-PCR阳性者13例，1例阴性。另有3名受试者仅RT-PCR阳性(表1）.

RT-PCR检测的敏感性和特异性分别为92.85%和97.41%。阳性预测值(PPV)为81.24%，阴性预测值(NPV)为99.12%。在这项研究中，RSV感染可以在毛细支气管炎中表现出更高的百分比。临床诊断为毛细支气管炎患者RSV阳性22.5%(9/40)，肺炎患者RSV阳性6.34% (4/63)，WALRI患者RSV阳性3.7%(1/27)。

讨论

快速检测儿童和婴儿RSV感染对于集中适当的药物治疗、减少不必要的抗生素使用和防止医院传播，从而有效地管理患者至关重要。RSV感染的诊断可通过观察临床体征和症状、特征性胸片、快速抗原检测、病毒培养或临床标本RT-PCR等方法进行[12］．

传统的病毒培养往往耗时且灵敏度低。标本质量差及/或标本处理不当，显著降低细胞培养的敏感性，导致假阴性结果[13］．此外，细胞培养中的分离不够快，无法影响患者的管理[14］．应用免疫层析技术(ICT)和酶免疫分析技术对临床标本进行病毒检测，与培养技术相比，具有特异性高、敏感性好、所需时间短的特点。然而，抗原捕获测定法的中等敏感性限制了该方法只适用于儿童的急性期样本，儿童排出的病毒滴度明显高于成人[15］．基于ICT技术，开发了一种用于RSV检测的快速检测方法(Binax NOW RSV)，与细胞培养分离相比，该方法具有令人满意的灵敏度(89%)和特异性(100%)[16］．这种快速检测主要用于住院时的RSV检测和床边检测。

多份刊物报导使用RT-PCR检测呼吸道合胞病毒[17，18］．分子方法的主要好处是其极高的敏感性和高特异性取决于适当的引物选择。到目前为止，它们的缺点之一是大多数PCR方案只针对单一病毒进行识别。此外，这些方法价格昂贵，极容易受到污染，因此需要较高的技术实验室标准。因此，核酸扩增方法在临床诊断实验室还不是常规方法。个别实验室之间的技术不一致，缺乏外部质量控制，只能对其功效和用处进行笼统的评估。

在这项研究中，RT-PCR与FDA批准的用于RSV检测的快速抗原测定法进行了评估和比较，该方法使用130个鼻拭子。快速抗原检测和RT-PCR分别检测出10.76%和13%的患者为RSV。这一结果与其他研究者通过抗原检测方法发现13%的样本呈阳性的结果一致[19］．此外，RT-PCR还检出了抗原检测漏检的3个阳性样本。这些结果凸显了RT-PCR在RSV检测中的优越性。快速抗原法检测阴性，RT-PCR检测阳性，可能是临床标本中病毒滴度低所致。然而，快速抗原法阳性的一份样品经RT-PCR检测为阴性。可能存在PCR抑制剂或RNA模板降解的可能性[20.］．

由于通过培养检测RSV存在特定的局限性，RT-PCR提供了几个优点:(i)低滴度检测(ii)标本冷冻和解冻后检测的潜在稳定性以及(iii)不受治疗性被动中和抗体或抗病毒药物影响的检测。这些潜在的优势将促进发病机制和治疗试验的多中心研究。

我们的结论是，快速和可靠的检测RSV感染应简化为有效的患者管理。快速检测具有令人满意的敏感性和特异性，是急诊室常规检测的有用工具。虽然PCR更昂贵，需要技术技能和时间，但提高结果的准确性可以满足住院患者所需的额外资源。在住院患者中，RSV感染诊断的准确性比时间更重要，因为时间可以消除检测和抗菌药物使用的需要。然而，在门诊时间是更关键的，这证明了使用快速抗原测定。

结论

总之，我们推荐使用RT-PCR检测RSV，因为它是一种在诊断、预防和治疗环境中获得的临床标本中调查RSV的高度敏感的方法。如果可以提供适当的周转时间，分子检测应该是RSV诊断的金标准。总的来说，这可能有助于减少医院传播的发生率，并通过早期诊断改善临床管理。

参考文献

1. Openshaw PJM和Tregoning JS。呼吸道合胞病毒感染期间的免疫反应和疾病增强。临床微生物学，2005;18(3): 541 - 55。
2. Glezen WP, Loda FA, Clyde WA Jr, Senior RJ, Sheaffer CI, Conley WG，等。儿童急性下呼吸道疾病的流行病学模式在儿科小组实践。儿科杂志，1971;78(3): 397 - 406。
3. 范J, Henrickson KJ, Savatski LL。通过多重定量逆转录聚合酶链反应-酶杂交试验(Hexaplex)快速同时诊断呼吸道合胞病毒A和B、流感病毒A和B以及人类副流感病毒1、2和3型感染。临床感染杂志，1998;26(6): 1397 - 1402。
4. 刘志强，李志强，李志强，等。12种呼吸道RNA病毒三种多重RT-PCR检测方法的建立《病毒方法》2005;126(1 - 2): 53 - 63。
5. 禽类和人偏肺病毒。南京大学学报(自然科学版);1102: 66 - 85。
6. Glezen WP。城市环境中呼吸道合胞病毒和副流感3型病毒的发病率。儿科病毒学1987;2: 1 - 4。
7. Domachowske JB, Rosenberg HF。呼吸道合胞病毒感染的免疫应答、免疫发病机制及治疗。临床微生物学杂志1999;12: 298- 309。
8. Tekkanat KK, Maassab H, Berlin AA, Lincoln PM, Evanoff HL, Kaplan MH.白细胞介素-12和stat4在呼吸道合胞病毒感染中气道炎症和多动的调节作用。Am J Pathol, 2001;159: 631 - 638。
9. 儿童急性呼吸道感染:发展中国家小医院的病例管理——医生和高级卫生工作者手册。日内瓦，世界卫生组织，文件WHO/ARI/90.5,1990年。
10. 阿诺德JE，斯特恩RC。呼吸系统。:Behrman RE, Kleigman RM, Nelson WE, Vaughan VC，编辑。纳尔逊的儿科学教科书，第14版。费城:W.B. Saunders公司;每分钟1992。1052 - 1115。
11. Jonathan N. Binax NOW RSV的诊断效用-与细胞培养和直接免疫荧光相比，Binax NOW RSV诊断性能的评估。安临床微生物抗菌药物。2006;5: 13
12. 海基宁T、thinm、Chonmaitree T.急性中耳炎期间各种呼吸道病毒的流行探讨。英语医学。1999；340: 260 - 64。
13. Minnich L, Ray CG。呼吸道病毒抗原直接免疫荧光染色临床标本与常规分离技术的比较。临床微生物学杂志，1980;12: 391 - 394。
14. 利用壳瓶培养24小时内呼吸道病毒感染的实验室诊断。临床微生物学杂志，1997;35: 2165 - 2167。
15. 霍尔CB，道格拉斯RG，盖曼JM。婴儿呼吸道合胞病毒的定量脱落模式。传染病杂志1975;132: 151 - 156。
16. Ohm-Smith MJ, Nassos PS, Haller BL. Binax NOW, BD Directigen和BD Directigen EZ测定法检测呼吸道合胞病毒的评价。临床微生物学杂志。2004;42(7): 2996 - 2999。
17. 李志刚，李志刚，李志刚。流感病毒和呼吸道合胞病毒的多重PCR分型方法。临床微生物学杂志1998;36: 2990 - 2995。
18. Rohwedder A, Keminer O, Forster J, Schneider K, Schneider E, Werchau H.用聚合酶链反应检测新生儿血液中呼吸道合胞病毒RNA。《医学病毒学杂志》1998;54: 320 - 327。
19. Stensballe LG, Trautner S, Kofoed PE, Nante E, Hedegaard K, Jensen IP，等。一个发展中国家在不同环境下鼻咽吸液和鼻拭子标本检测呼吸道合胞病毒的比较。热带医学国际卫生，2002年;7(4): 317 - 21所示。
20. Paton AW, Paton JC, Lawrence AJ, Goldwater PN, Harris RJ。逆转录-聚合酶链反应扩增快速检测鼻咽吸入物呼吸道合胞病毒。临床微生物学杂志，1992;30: 901 - 904。