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ISSN: 2320 - 0189
+ 1-845-458-68821生命科学学院作物生物学国家重点实验室,山东农业大学,山东,中国
收到日期:2015年6月10接受日期:2015年7月11日发表日期:2015年7月19日
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冷却是一种常见的环境压力强烈限制植物的生存和质量。热带花卉,Sinningia叶几乎不能生存低于5ºC。育种新chilling-tolerant Sinningia叶品种的转基因方法将扩大其地理分布。作为转录因子、C-Repeat结合因子1 (CBF1)可能会增加冷却对许多植物的宽容。在这项研究中,拟南芥CBF1基因(AtCBF1)已成功转化为Sinningia叶。与野生型植物(WT)相比,overexpressing植物(OE)表现出低水平的双氧水(过氧化氢)和超氧化物自由基(O2•−) 4ºC的压力。同样,减少丙二醛(MDA)含量积累在OE WT植物。符合活性氧的积累,抗氧化酶的活动,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸盐过氧化物酶(APX型)和过氧化物酶(POD),显然是在OE高于WT植物。生理指标的变化与冷却应力下的表型分析一致。过度的AtCBF1也可以增加渗透压力的抵抗分离树叶。 This will be very helpful for expanding the planting of Sinningia speciosa in low-temperature areas.
Sinningia叶,CBF1基因转移,非生物压力。
APX型:抗坏血酸盐过氧化物酶;AtCBF1:拟南芥芥C-Repeat结合因子1;6-BA: 6 -Benzylaminopurine;猫:过氧化氢酶;H2O2:过氧化氢;菅直人:卡那霉素;MDA:丙二醛;媒介女士:Murashige和斯库中;乙酰天冬氨酸:萘乙酸;O2•−:超氧化物自由基;OE:超表达植株;豆荚:过氧化物酶;ROS:活性氧;SOD:超氧化物歧化酶;WT:野生型。
非生物压力,尤其是寒冷和干旱的压力是主要的环境因素,并讨论影响的增长和地理分布植物(1,2]。转基因育种是一个重要的机制,提高产量,品质,和其他特征的商业价值。
Sinningia叶,也被称为大岩桐,源于热带南美洲和被广泛种植的观赏世界各地的花,因为它巨大的椭圆形的叶子和艳丽花朵3,4]。Sinningia叶并讨论是一个热带的花几乎不能生存4°C以下(5]。令人心寒的压力不仅限制的地理分布Sinningia叶但也降低了它的质量和市场效率。因此,培育耐寒品种将扩大室内花卉的生长分布,适合在一些地区增加户外活动。开发新的转基因育种提供了一个强大的工具Sinningia叶特征,传统育种可以很少实现。虽然Sinningia叶已经改变了在其他的研究中,没有研究试图改善冷却的宽容Sinningia叶(6- - - - - -8]。
作为转录因子CBF1扮演着一个重要的角色在抵抗寒冷和脱水在拟南芥9- - - - - -11]。此外,CBF1已经变成了许多植物,包括番茄,大米和土豆等。它可能提高耐低温、干旱、和盐(12- - - - - -14]。然而,是否overexpressing CBF1有一个函数在热带观赏花没有被探索。我们想知道AtCBF1能否增加冷却的压力Sinningia叶,而不影响其观赏价值。
在目前的研究中,增加冷却压力的耐受性Sinningia叶AtCBF1基因已成功转化为Sinningia叶和筛选超表达植株(OE)。转基因植物的表型分析显示一个明显的高冷却宽容比WT。低积累H2O2,阿2•−和MDA积累OE WT冷却应力下的植物。此外,高抗氧化剂酶活性观察在转基因Sinningia叶。转基因Sinningia叶也增加了耐盐和干旱胁迫。所有结果证实overexpressing AtCBF1Sinningia叶增加非生物压力宽容。
质粒构建
聚合酶链反应从还是CBF1基因被隔离拟南芥幼苗的向前底漆(5 ' - CCGGGATCCATGAACTCATTTTCAGCTT-3 ')和反向引物(5 ' - CCCGAGCTCTTAGTAACTCCAAAGCGA-3 '),置于控制之下的花椰菜花叶病毒(CaMV) 35 s启动子在pBI121表达质粒(指定为pBI121 - AtCBF1)携带选择标记新霉素磷酸转移酶II (npt II),如图所示图1。
图1所示。图的二进制向量pBI121 AtCBF1基因。
重组质粒测序的阳光生物科技公司(中国上海)和证实了通过与NCBI的序列对齐。重组向量转化为根癌土壤杆菌菌株LBA4404。
农杆菌介导转化Sinningia叶
叶圆盘直径(10毫米)和叶柄(7 - 10毫米的长度)Sinningia叶pre-cultured诱导培养基,Murashige和斯库(女士,pH值5.8)+ 1.0 mg•L16-BA + 0.1 mg•L1NAA + 15 g•L1蔗糖+ 7.5 g•L1琼脂,与细菌接种前1天。文化的根癌土壤杆菌菌株LBA4404携带pBI121-AtCBF1增长了五个小时(OD600 = 0.4 - -0.6)离心机在4000 rpm的8分钟,re-suspended诱导介质。的pre-cultured外植体感染了细菌培养3 - 5分钟,涂抹后干燥,受感染的外植体被放置在同一媒介在黑暗中2天。然后,外植体与无菌水清洗4次250 mg•L1cephotaxime并被放置在选择培养基,诱导培养基+ 20 mg•L1卡那霉素(菅直人)+ 250 mg•L1cephotaxime,防止细菌生长。他们的亚文化进行每7天直到芽出现。2个月后,感染产生的不定芽外植体(> 1.0厘米)是切除和生根培养基中培养,MS + 0.2 mg•L1NAA + 30 g•L1蔗糖+ 10 mg•L1菅直人对进一步发展和选择。30天之后,根幼苗被转移到一个温室25°C进行进一步的研究。相比以前的研究转变Sinningia叶,我们主要是缩短了从10 - 15分钟的感染时间3 - 5分钟,减少诱导培养基中的蔗糖添加到15 g•L1而不是30克•L1,为了减少外植体的褐变。
DNA和核糖核酸提取、聚合酶链反应(PCR)分析和实时定量逆转录-聚合酶链反应(存在)
新鲜的叶子从独立假定的幼苗为基因组DNA提取,使用修改后的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法道尔和柯南道尔15]。叶子和花的总RNA提取使用EASYspin植物RNA工具包Aidlab生物技术(中国,北京)。根据标准程序执行互补脱氧核糖核酸合成的RevertAid拳头链cDNA合成装备使用总RNA模板(Fermentas、加拿大)。
辨认转基因幼苗,使用基因组DNA为模板进行PCR分析。检查AtCBF1的表达,PCR分析使用互补dna作为模板。AtCBF1的gene-specific引物5‘-CCGGGATCCATGAACTCATTTTCAGCTT-3’, 5’-CCCGAGCTCTTAGTAACTC CAAAGCGA-3”。
确定基因的拷贝数和AtCBF1在转基因植物的转录表达水平,平均周期阈值(Ct)值与不同的副本(103年至108年•μL副本1)包含AtCBF1基因的质粒或Actin-1测定的标准曲线中存在AtCBF1 Actin-1,根据先前的研究。使用DNA或互补DNA作为模板,AtCBF1的Ct值在转基因线中存在和插入的标准曲线测定确认副本数量和表达水平AtCBF1 [16- - - - - -18]。绝对量化的引物设计的设计师灯塔软件遵循:5 - GATACGACGACCACGAAT 3和5的AtCBF1 -GCTCTGTTCCGGTGTATA 3 '。5 - CAATAAATTGCGTGTTGCTCCTGAG 3和5的-TGTTTCCGTACCGATCCTTTCTGATA-3 Actin-1 [19]。
植物材料和治疗
无性繁殖的Sinningia叶种植在温室24±1°C, 16 h光/ 8 h黑暗周期和环境湿度(> 84%)30天。的压力,温度降低4°C,植物经常拍摄。收集树叶和花后1天,2天,3天的治疗和用于测量氧化损伤。渗透压力,1平方厘米叶片离体的植物漂浮在200毫米的生理盐水或20% (w / v) PEG6000 48 h (20.]。然后,叶片的叶绿素含量计算根据吴和李使用95%的乙醇(21]。在每个试验中,至少有三个测量从三个不同的植物叶子,和三个独立的实验。
测定H2O2阿,2•−和MDA的内容
氧化损伤细胞膜是由测量H的内容2O2和O2•根据先前的方法用细微的修改(−22,23]。丙二醛(MDA)的含量从OE和WT植物的叶子是根据现有的化验方法(24树叶也准备了10%三氯乙酸含0.65% 2-ThiobarBituric酸(稍后通知)和加热15分钟在100°C;然后吸光度在532海里,600 nm和450 nm)测量。
提取和抗氧化酶的活性测定
测定抗氧化酶的活动,液体nitrogen-ground树叶在5毫升(0.5 g)停牌冰冷的缓冲区(25毫米,pH值7.8)包含4% PVP和0.3毫米EDTA。匀浆离心机在4°C和12000 g 20分钟,上层清液是用来确定抗氧化酶的活动(25]。过氧化氢酶(CAT)活性在化验通过混合H - 240海里2O2根据现有的方法(26]。分析APX型的活动在290 nm, H2O2端依赖氧化抗坏血酸(AsA,ε= 2.8毫米•厘米1)使用27]。对SOD活性测定是通过记录的速度p-nitro蓝色四唑氯(电视台)的吸光度降低560海里(28]。的活动过氧化物酶分析了(POD)根据先前的研究29日]。
转基因植物的高表达AtCBF1生成
总120卡那霉素(菅直人)筛选抗苗从变换后大约300外植体和18个独立的转基因线被PCR进一步证实了使用基因组DNA作为模板。成功的转化株比例接近6%。AtCBF1融入核基因组和表达式经PCR分析使用基因组DNA或互补DNA作为模板图2。
图2。转基因植物的识别。
复制数字基因组的转录表达水平AtCBF1经实时定量一(存在)图3。
图3。拷贝数在基因组和转录表达水平的AtCBF1转基因Sinningia叶
AtCBF1转录表达水平高的叶子和花暗示AtCBF1可能在应激反应中发挥作用。转基因植物被进一步用于营养繁殖和研究。
AtCBF1授予的超表达转基因植物更高的阻力
揭示超表达AtCBF1是否增加了令人心寒的公差Sinningia叶,三个WT和OE植物被种植在4°C的压力下。所示,冷冻治疗前,小区别WT和OE植物可以发现在角色的成长和发展,包括整个植物和花时间的大小图4。
图4。表型的比较WT和OE Sinningia叶植物治疗4ºC为0,1,2,3天
1天的治疗后,一个或两个叶子WT植物受伤,成了灰色,虽然OE树叶几乎不变。2天的治疗后,四个叶子除了温柔WT植物的叶子是枯萎;然而,只有一个或两个叶子的OE略枯萎的植物。3天的治疗后,六个WT植物的叶子都是受伤和50%的WT植物死了,当OE植物都活着。这证实AtCBF1的超表达转基因表型强烈Sinningia叶增加的宽容。
活性氧的积累减少过度冷却下的AtCBF1压力
的压力下,活性氧的积累(ROS)加剧了对细胞膜的破坏。丙二醛(MDA)是常用的作为膜脂质过氧化作用的指标。来洞察膜损伤WT之间的差异和OE植物在4°C的压力下,我们发现了H2O2阿,2•−和MDA含量。在正常情况下,转基因植物也有类似的H2O2水平与WT植物。冷冻治疗后,H2O2内容增加在WT和OE植物;然而,增加WT植物明显高于OE的植物图5一个。同样,O的内容2•−在OE和MDA明显低于WT植物图5 b和5度。
图5。H的积累2O2阿,2•−和MDA在4°C下叶子治疗0,1,2,3天
较低的MDA的积累,H2O2和O2•−OE植物的建议他们经验丰富的氧化损伤低于冷却压力下的WT植物。
抗氧化酶活性增加了过度的AtCBF1冷却压力
活性氧积累下的压力是经常与抗氧化酶的活性相关(30.]。因此,在WT和OE抗氧化酶的活动Sinningia叶化验。所示图6在正常情况下,SOD的活性并不是WT和OE植物之间的不同。1天4°C冷冻治疗后,SOD活性调节,达到了顶峰。OE中超氧化物歧化酶(SOD)的活性植物总是明显高于WT植物。然而,经过3天的治疗,在WT植物SOD活性低于0天,暗示严重损害在WT但不是OE植物。同样,猫,POD和APX型活动对SOD活性表现出类似的趋势图6罪犯。
图6。治疗后抗氧化酶活性测定的叶子在4°C为0,1,2,3天。
这些结果表明AtCBF1的过度Sinningia叶改善抗氧化酶的活动,进一步提高冷却压力宽容。
超表达AtCBF1也提高了宽容的盐和干旱压力。
CBF1已知有多个对非生物压力的影响。我们研究了转基因的渗透宽容Sinningia叶的叶片漂浮在200毫米生理盐水或20% (w / v) PEG6000 48 h。如图所示图7,叶片用蒸馏水保留治疗的比例几乎相同在WT和OE植物叶绿素。
图7。WT Leaf-disc生物测定和OE植物盐和干旱胁迫。叶片的叶绿素含量分析200毫米生理盐水或20% PEG处理48 h
然而,经过48小时的盐或干旱处理、WT植物被漂白的叶片在某种程度上,虽然OE植物保留更高比例的叶绿素含量比WT植物。这一结果表明,转基因Sinningia叶不仅增加了令人心寒的抗压能力,但也增加了渗透压力宽容。
植物强烈的质量受到非生物胁迫条件下,如低温、高盐和干旱。转基因繁殖是一种有效的方法来开发新品种和高质量。在这项研究中,一个新的令人心寒的宽容Sinningia叶各种overexpressing AtCBF1是生成的转基因育种方法。CBF1寒冷宽容证明,过度的增加有一个函数在观赏花。ROS的压力导致生产过剩,破坏细胞膜的稳定性(31日]。的压力也会增加一系列活性氧清除酶的活动减少伤害(32]。先前的研究表明,CBF1与ROS和ROS-eliminating系统通过多种交互(33]。在这项研究中,AtCBF1的表达Sinningia叶影响了生产过剩的活性氧,活性氧清除酶的活动。在OE植物,H2O2阿,2•−和MDA都明显低于WT植物在4°C下的压力。同时,活性氧清除酶的活动OE植物在WT远高于那些植物在4°C的治疗。抗氧化剂酶活性升高是符合H水平下降2O2和O2•−。这些结果表明,AtCBF1Sinningia叶赋予高的电阻通过减少活性氧的积累和增加抗氧化酶活动的压力。
盐和脱水压力影响植物的生长和叶绿素含量(34]。在这项研究中,AtCBF1增加,不仅令人心寒的压力还有盐和干旱胁迫耐性的宽容Sinningia叶。同样,过度的拟南芥CBF1转基因土豆中增强冷却和耐旱(35]。我们的实验结果证明了拟南芥CBF1基因有类似的功能Sinningia叶与其他植物提高非生物压力宽容。
先前的工作已经证明转基因番茄overexpressing CBF基因在生长发育不良,在开花延迟,减少在水果生产36]。相比之下,转基因茄属植物与拟南芥tuberosum含有DREB基因由本构CaMV 35 s或stress-inducible拟南芥rd29A子达到相同级别的冻结公差和成长同样WT植物(37]。此外,转基因葡萄overexpressing AtCBF1显示无表型差异从野生植物在其幼年期(38]。在这个实验中,没有观察到的对植物的影响大小或开花时间被发现AtCBF1基因的超表达Sinningia叶,但它明显增加转基因植物的耐冷却压力如图4所示。
先前的研究表明,CBF基因可能诱发软木(cold-regulated)基因的表达,如COR15a和COR78等等,在低温和脱水反应压力(39,40]。在许多植物,如拟南芥、黄瓜和土豆,CBF1可以显著激活心脏基因的过度表达,进而增加耐寒性的程度(41- - - - - -44]。因为相对基因的特定序列Sinningia叶,比如COR15a COR18,不能搜索,没有提供直接证据。然而,转基因的令人心寒的阻力增加Sinningia叶在这个调查表明AtCBF1可能调节非生物胁迫相关基因的表达。
本研究支持的特殊研究中国农业部门公共福利基金(201303093)和特殊的济南农业科学院研究基金。
