部分纯化和表征纤维素分解酶的芽孢杆菌pantothenticus孤立的从一个垃圾场

文摘

纤维素水解生物,从垃圾场土壤杆菌pantothenticus、被隔离。部分纯化的酶与降水冷丙酮和60% Biogel p - 100凝胶过滤产生一种酶与特定活动253.50,10.40%的收益率和净化2.41折。明显的K_米和V_马克斯羧甲基纤维素(CMC)水解为1.167毫克/毫升和0.833μg分别为葡萄糖/毫升/分钟。本机酶的分子量b . pantothenticus估计是51.48 kDa。显示活动产生的纤维素酶在广泛的温度(30 - 70°C)与最大活动60°C。酶还显示活动的pH值范围宽4 -最佳活动pH值4.5。在氯化钾浓度的10毫米,MgCl₂、氯化钠和NiCl₂抑制酶而CoCl₂激活酶。酶显示最高的活动以微晶纤维素为基质CMC紧随其后。重大活动也观察到有机基质如甘蔗蔗渣、橙色甘蔗渣和玉米幼崽。这项研究得出结论,获得了合适的催化性能的纤维素酶用于生物降解废物和其他工业应用。

关键字

纤维素酶;芽孢杆菌pantothenticus;净化特性

介绍

城市固体废物管理全球(MSWM)是一个具有挑战性的问题特别是在发展中国家,由于其不利环境影响(1- - - - - -3]。固体废物由50%纤维素材料包括纸浪费,庭院装饰,木材,纺织品和食物残渣的三大吗环境问题(其他主要环境问题包括洪水和沙漠化)在尼日利亚,其他许多发展中国家甚至是发达国家。废物管理的标准仍然是许多发展中国家,贫困和过时的废物产生率差的文档及其组成、低效率的存储和收集系统。

旁边的半纤维素和木质素,纤维素是农业废物的重要组成部分和市政残留(4- - - - - -6]。纤维素和半纤维素占所有绿色植物的主要部分,这是使用的主要原因等方面“纤维素废物”或简单的“纤维素制品”这些材料生产尤其是农作物残留物,水果和蔬菜废物工业加工和其他固体废物从罐头食品和饮料行业6,7]。完整的纤维素水解为葡萄糖,纤维素酶系统必须包含:内切葡聚糖酶(1,4-β-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.4), exoglucanase(1, 4-β-glucan cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91)和β-glucosidase(β-D-glucoside glucohydrolase或纤维二糖酶,EC 3.2.1.21) (8- - - - - -10]。只有这些酶的协同作用,可以纤维素水解为葡萄糖(10]。此外,水晶原生纤维素(CI)水解活动是必要的分离结晶纤维素的基本原纤维(11,12]。

纤维素酶用于许多行业如纺织(13),文献[14),洗衣和洗涤剂15),动物饲料行业(16和生物燃料生产17]。一个好的候选人可以作为很好的来源的细菌酶。在这项研究中,纤维素酶生产生物分离从粪希尔和酶部分纯化和特征。

材料和方法

羧甲基纤维素、盐酸Trizma Trizma基地和氢钾正磷酸盐从Sigma-Aldrich获得化学公司,有限,圣路易斯,密苏里州,美国。葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、硫酸锌、氯化钙、丙酮、结晶紫,红色染料和蛋白胨获得BDH化工有限公司,英国普尔。氢氧化钠是购自默克密理博国际Darmstadht,德国。从Bio-Rad Biogel p - 100购买,赫拉克勒斯,美国CA。二硝基水杨酸是购自Avishkar科学手术,海得拉巴,印度。磷酸氢二钠和焦亚硫酸钠是购自天津Kermel试剂有限公司、中国天津。分离和筛选纤维素分解细菌。

土壤样本来自Onibueja垃圾场,Osogbo,尼日利亚。隔离是由重1克土壤样品的无菌10毫升pre-sterilized de-ionized锥形烧瓶中的水。暂停在室温下机械地动摇了10分钟。一毫升(1毫升)的悬浮与9毫升蒸馏水稀释。一毫升(1毫升)还测量了从第二个和9毫升蒸馏水稀释,稀释。这是导致身手系列稀释尤其重复四次。整除(100μl)稀释样本分布的相应标记无菌营养琼脂(NA)板块在重复。板倒,密封在塑料袋减少蒸发盘子和孵化的孵化后24 h。37°C,盘子与30 - 300集落形成单位(c.f.u)认为,殖民地代表孤立从每个板进行进一步的鉴定。代表殖民地被反复纯化裸奔NA和筛选纤维素分解的活动。降解纤维素分离显示积极的活动在NA斜坡在冰箱里保存。

土壤样本筛选的菌株分离出纤维素酶活性,发现cellulose-agar板块包含:蛋白胨2% (w / v) KH₂阿宝₄0.1% (w / v), MgSO₄.7H₂O 0.5% (w / v),氯化钠0.075% (w / v)和高viscousity羧甲基纤维素0.5% (w / v)。盘子在37°C孵化48 h。此后,盘子都充斥着0.1%刚果红脱色和1 M氯化钠溶液。Cellulase-producing殖民地被清晰的外观halozone周围(18]。鉴定细菌的分离是由宏观和微观形态观察。细菌分离获得的分类使用Bergey限定词的手册细菌学(19]。

纤维素酶测定

纤维素酶活性化验通过测量中产生的还原糖反应混合物含有羧甲基纤维素和酶使用修改后的dinitrosalicyclic酸(DNSA)方法,米勒(1959)(20.]。

反应混合物由w / v 0.75毫升的1.0%羧甲基纤维素在Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)和0.25毫升的粗酶解决方案。控制实验管(空白)的酶含有相同数量的衬底和0.25毫升的粗酶解煮20分钟。实验和控制管孵化20分钟的50°C。反应被终止的1.5毫升DNSA (10 g氢氧化钠(氢氧化钠);40 g钾钠tartarate;10 g 3 5-dinitrosalicyclic酸试剂和蒸馏水1000毫升)。反应混合物加热在100°C在沸水15分钟。管被冷却下自来水。光密度(OD)是在540海里。产生的还原糖量葡萄糖标准曲线的插值。

被表示为一个单位的纤维素酶活动的酶释放还原糖相当于每分钟1μg葡萄糖测定条件下。

蛋白质的测定

蛋白质浓度测定方法的布拉德福德(1976)使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。

生产和部分纯化的纤维素酶

生物体在改性液体培养基础培养基含有蛋白胨(0.5 g),酵母提取物(0.5 g), K₂HPO₄(0.1克),KH₂阿宝₄(1.15克),MgSO₄.7H₂FeSO O (0.004 g)₄.7H₂CaCl O (0.00125 g)₂。H₂O(0.05克)、葡萄糖(0.5 g), capuric酸(0.001克)和羧甲基纤维素(1 g), pH值7.0的方法Sakthivel et al。21水中悬浮体的纯细菌隔离是在无菌蒸馏水中含有0.2% (w / v) CMC接种一个包含细胞悬浮。文化是生长在250毫升和100毫升中厄伦美厄烧瓶内旋转瓶(140 rpm)在室温下。72 h生物量被离心分离后在4°C 10000 rpm 30分钟,上层清液用作原油酶(22]。

酶解进一步沉淀60% (v / v)逐渐增加冷丙酮与连续搅拌和保存在一个冰箱在4°C 1 h。由此产生的沉淀在12000转离心收集的30分钟在4°C,溶解在最少的Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)之后,这种酶是透析对同一个缓冲区使用乙酰化透析袋(23]。

从获得的透析液丙酮沉淀分层在2.5 cm X 80厘米列Biogel p - 100与0.05 Tris-HCl以前平衡缓冲,pH值8.0。分数(5毫升)的流量采集8毫升/小时。纤维素酶活性和蛋白质的分数决定。活跃的分数被汇集并存储在冰箱里。

酶的特性

动力学参数的确定:K_米和V_马克斯纤维素酶是由不同浓度的羧甲基纤维素和测量的初始反应速度50°C 20分钟。CMC之间不同的浓度0.8和4毫克/毫升。分析混合物包含0.1毫升的酶。根据Lineweaver-Burk数据绘制。

温度对酶活性的影响:整除的酶(0.1毫升)和0.75毫升的底物在不同的温度孵化10°C到80°C。

热稳定性的实验是由分析酶在不同温度范围从30 - 80°C 8 h。5毫升(5毫升)孵化酶的1 h和0.1毫升撤回间隔和纤维素酶活性分析。剩余活动策划与时间间隔在不同的温度。

pH值的影响b . pantothenticus纤维素酶活动:底物(0.75毫升)的可溶性合适的缓冲区;50 mM柠檬酸缓冲(pH值4.0 - -6.0),50 mM磷酸钠(pH值7.0),50 mM Tris-HCl (pH值8.0 - -9.0)和50 mM glycine-NaOH pH值(10.0 - -11.0)。0.75毫升的酶的底物混合0.1毫升和化验纤维素酶活动30分钟50°C。酶的剩余活动是根据标准量化分析过程。

酶(0.5毫升)和0.5毫升以上孵化缓冲区1 h 50°C。每个样品的水解CMC的剩余活动然后化验,绘制各种pH值。

盐对b . pantothenticus纤维素酶活动:酶(0.1毫升)和0.1毫升pre-incubated 10毫米的氯化钠,氯化钾,MgCl₂,NiCl₂和CoCl₂前30分钟50°C的衬底(0.75毫升)(1 g CMC是溶解在100毫升0.05 Tris-HCl缓冲区,pH值8)残留纤维素酶活动是化验。样品没有任何盐作为控制活动的100%。

底物特异性b . pantothenticus纤维素酶:纤维素酶的水解能力对1% CMC和微晶纤维素在0.05 M Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)。1克(1 g)的干和甘蔗的甘蔗渣,粉橙色甘蔗渣和玉米棒在10毫升0.05可溶性Tris-HCl缓冲pH值8.0。底物(0.75毫升)和酶(0.25毫升)混合在一起的反应。

结果

降解纤维素的细菌隔离

从五个不同的细菌菌株垃圾场土壤样本。三线周围的隔离显示清楚halozone条纹的羧甲基纤维素琼脂(CMCA)显示出纤维素酶生产和标签,B和c的两三个隔离标识芽孢杆菌pantothenticus和第三干酪乳杆菌。B这是隔离芽孢杆菌pantothenticus最高的活动被选作进一步研究。酶的产生芽孢杆菌pantothenticus部分纯化和特征。

部分纯化的酶

降水使用60% v / v丙酮产生一种酶的活动增加2%净化褶皱(表1)。的凝胶过滤Biogel p - 100产生一个活动高峰。

表1:总结部分净化产生的纤维素酶芽孢杆菌pantothenticus。

activity-temperature概要的纤维素酶芽孢杆菌pantothenticus获得了不同温度在10°C和80°C之间。显示的值代表平均从一式三份实验。误差线代表标准偏差。

热稳定性是由孵化酶8 h和1 h间隔8 h,样本撤回和残留纤维素酶活动是化验。显示的值代表平均从一式三份实验。

1%的甘蔗蔗渣,橙色的甘蔗渣,microcrystallinecellulose和玉米棒。基质是由暂停0.1克每subatrates 0.05 Tris-HCl缓冲区,pH值8.0。纤维素酶活性基质被表示为一个百分比的羧甲基纤维素的活性。

结果和讨论

在这项研究中三个纤维素分解细菌隔绝垃圾场土壤样本来自Onibueja Osogbo Osun状态。的隔离宽halozone确认暂时是芽孢杆菌pantothenticus用于进一步的研究。丙酮沉淀净化最好折叠(1.90)和百分比收益率(6.2%)(表1)相比,硫酸铵沉淀(数据没有显示)。凝胶过滤概要显示单一的酶活性峰值(图1)。这表明,这种酶亚型从未存在过。

动力学参数K_米和V_马克斯被估计为1.167毫克/毫升和0.833单位/毫升。Karnchanatat et al。24)报告了类似的K_米值为1.74毫克/毫升的内切葡聚糖酶Daldinia eschscholzii V_马克斯0.63 U /毫升。这项研究报告的动力学参数低于报道王et al。25从Sporocytophaga sp与K_米和V_马克斯9毫克/毫升和27.3单位/毫升。

酶表现出最适温度60°C是类似于枯草芽孢杆菌产生的纤维素酶最适温度在60°C的阴et al。26),但高于最适温度35°C荧光假单胞菌据Bakare et al。27]。Arrifin et al。28)也报道了纤维素酶杆菌、与最适温度60°C,而50°C的最佳温度,报道了王et al。25)的酶Sporocytophaga sp。这一研究获得的最佳pH值为4.5,肩膀pH值8 (图3)。

纤维素酶的芽孢杆菌pantothenticus稳定在30°C-60°C和保留一半的活动4 h后孵化(图2一个和2 b)。酶热稳定性是类似于宽温度范围内的30 - 100°C和最佳60°C的Bajaj et al。29日)和Ariffin et al。28)的温度范围30 - 70°C和60°C最佳。在酸性和碱性酶显示活动范围。酶稳定在所有的酸度范围和最佳稳定在7.5中所示图3一和3 b。巴贾杰et al。29日内切葡聚糖酶从)也报道了pH值稳定芽孢杆菌应变M-9最大活动酸碱5和相当高的活动4、6、7、8、9和10所示。其他嗜酸性已报告了多种纤维素酶;最佳pH值为5.5纤维菌属sp ASN2 [30.)也报道从米曲霉纤维素酶最适pH值为5.5。Alkalophilic纤维素酶的纤维菌属sp ASN2的最佳pH值7报道了艾尔et al。30.),Paenibacillus elgii8的最佳pH值(31日]。

类似的pH值范围内报道Abo-State et al。32从芽孢杆菌物种最优活动pH值3和9。pH值产生的纤维素酶的稳定b . pantothenticus在一个广泛的pH值范围似乎是常见的许多特点杆菌多种纤维素酶(33,34]。

CoCl酶活性被激活₂175.33%,氯化钾,MgCl₂,生理盐水₂,NiCl₂酶的活动减少了36.22%,分别为53.74%、68.92%和61.45%。Vijayaraghavan和文森特33由氯化钾)早些时候曾报道抑制纤维素酶,MgCl₂和生理盐水。由CoCl激活₂类似于萨哈的结果(34和阴等。25从毛霉菌circineloides增加44%和58%芽孢杆菌分别细小。

纤维素酶降解微晶纤维素CMC,甘蔗蔗渣、橙色甘蔗渣和玉米幼崽。微晶纤维素CMC相比显示更高的活动而其他基质较低的活动中所示表2。

表2:纤维素酶的底物特异性芽孢杆菌pantothenticus。

微晶纤维素的酶活性越高(107.44%)高于CMC(100%)推断exoglucanase和内切葡聚糖酶(35]。重大活动也观察到的微晶纤维素的形式Vijarayagahvan和文森特33)和类似的结果与另外两个细菌菌株,芽孢杆菌CH43和HR6836- - - - - -39]。

结论

总之,芽孢杆菌pantothenticus纤维素酶是活跃在酸性和碱性pH值,耐热性的不同基质和有能力降低。特征表现出的酶使其适用于生物降解废物和其他工业应用。

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