PCR技术以其应用

文摘

PCR(聚合酶链反应)是一个革命性的方法由吴雨霏B Mullis(1993年获得诺贝尔化学奖)在1983年。PCR是基于使用DNA聚合酶的合成新模板链的DNA链互补的DNA。这种技术在许多领域产生影响分子克隆分子生物学、遗传学、DNA重组研究,法医分析,进化生物学和医疗诊断。

介绍

的聚合酶链反应(PCR)的方法复制DNA,它让无数份一段特定的DNA快速而准确地[1]。它能够以少量的DNA甚至单分子和放大特定区域指数等,一旦反应完成后,可能存在每个从DNA分子的高达230册。PCR的发展之前,用于放大的方法,或者生成的副本重组DNA片段是耗费时间和劳动密集型。但PCR反应可以完成许多轮的复制和生产数十亿份DNA片段只在几个小时[2 - 4]。

PCR循环的基础知识

中的三个主要步骤PCR循环反应,高达20至40重复周期。它总是自动热循环,具有加热和冷却能力反应管在很短的时间内(5、6)。(图1)

•变性(95°C), 30秒。

•退火(则高达55 -°C), 30秒。

•扩展(72°C),时间取决于产品尺寸。

变性(94°C)

在这个阶段,形成单链DNA双链融化开放,所有酶反应停止[7]。

退火(54°C)

氢键不断形成和破碎的单链引物和单链模板。如果引物符合模板,形成的氢键是如此强大以至于底漆保持连接[8]。

扩展(72°C)

基地(补充模板)耦合到底漆在3 '端(聚合酶添加核苷酸的从5 ' 3 'side阅读模板从3 ' 5 '端,基地补充添加到模板)[9 - 11]。

PCR技术是基于过程,细胞使用复制一个新的DNA链。积分组件模板DNA(包含该地区被复制)。甚至单个DNA分子可以作为模板[12]。这是复制所需的片段序列的两个短的地区核苷酸两端的感兴趣的地区。两个短的模板序列必须是已知的因此两引物(短链核苷酸),对应的模板序列可以合成。互补的引物退火到模板网站和作为复制的起点[13]。DNA合成的引物是为了另一个因此导致复制所需的序列。还需要是免费的核苷酸用来构建新的DNA链和DNA聚合酶的建筑通过按顺序添加核苷酸自由根据模板的说明[14]。

每周期导致DNA链的数量增加一倍。经过几个周期的开始阶段,大部分的产品DNA链是相同的长度作为引物之间的距离。结果扩增引物之间的DNA存在[16]。放大的数量是2的n次方;n代表执行的周期数。经过20周期,这将使大约100万倍放大。40周期放大后是1 x1012 (17、18)。(图2)

准备18微升反应混合物

•1毫米核苷酸(核苷酸)2.5微升

•Taq DNA聚合酶0.4微升

•10 x Taq缓冲2.0微升

•无菌水13.1微升

对于每一个管

•18微升的反应混合物

•1微升的DNA样本

•1微升的底漆

完全每个管包含20微升的样本,这个管受到pcr过程遵循pcr循环步骤,目标DNA是充分的。这个过程需要3到4小时完成40周期[19]。

不同类型的聚合酶链反应

嵌套PCR
rt - PCR或逆转录酶聚合酶链反应
实时聚合酶链反应
梯度PCR
多重聚合酶链反应
妊娠PCR
Allele-Specific PCR
组装聚合酶链反应
Assymetric PCR
菌落PCR
热启动PCR
反向聚合酶链反应
原位聚合酶链反应
ISSR PCR
Late-PCR
长PCR
单细胞PCR
标准PCR [28]

一些不同类型的PCR的能力

•反向PCR否则称为IPCR和最初描绘Ochman等人于1988年。标准的主要约束PCR是5’和3’侧翼DNA的一部分利益的领域必须已知但是匡威PCR允许您领导PCR当数据的一个内部继承[29]。

•反向翻译聚合酶链反应(rt - pcr)是最微妙的过程用于mRNA目前发现和定量。与北方斑点检查和核糖核酸酶安全措施从根本上rt - pcr用于评估mRNA水平同样可以用来评估mRNA水平小例子[30]。RT PCR是如此敏感的和有效的,它可以测量信使rna从一个孤独的细胞。rt - pcr被认为是最快速,有效和极其敏感的感染监禁和非常规定作为感染的基本仪器识别[31]。

•RT PCR方法用于多路并发增强多个目标安排在一个孤独的反应管利用不同集奠定基础。这RT PCR是足够敏感的但是它有许多客观安排[32]。多重RT PCR是有效而且备件做无数的麻烦PCR反应。多重RT PCR是一种用于基因缺失和策略基因突变检测[33]。

•嵌套式聚合酶链反应是聚合酶结合响应的调整将减少污秽物品,因为奇怪的强化基础系地区[34]。

•聚合酶链反应本身是用来加强DNA测试的过程,通过temperature-intercededDNA聚合酶。物品可以用于测序或考试,这个过程是一个关键的许多遗传素质研究实验室,与利用率在DNA指纹技术对犯罪学和其他人类遗传病例[35]。常规PCR要求基础相关的客观的DNA。一个经常发生的问题是预赛将不准确地区的DNA,不可预见的项目[36]。

•嵌套式聚合酶链反应包括两个预赛的安排,利用两个进步的一部分保持运行的聚合酶链反应,第二组将加强辅助焦点在第一次运行项目[37]。

过程

目标DNA的经历第一聚合酶链反应的继续运行奠定基础。选项的选择和比较基础系地区给出了一个确定的项目,包含计划脱颖而出。第一反应的项目经历第二次与预赛第二安排保持运行。是不可能的,任何不受欢迎的PCR项目包括把目的地的新预赛,保证项目从第二个PCR从不良结果几乎没有玷污的二聚体和选项分组(38-40)初步目标奠定基础。

•反向PCR (rt - PCR)利用解释几个不可或缺的基础在每个特征分组的两条链cDNA [41]。这些预赛伸出的DNA聚合酶和复制链是由每一个周期后,促使指数增强[42]。

•rt - pcr结合了三个值得注意的步骤。的主要步骤是反向解释(RT), RNA是相反的转换成cDNA利用逆向转录酶。这一步必须记住最终目标执行自DNA聚合酶PCR法可以对DNA布局[43]。RT步骤可以被执行在同一管与PCR(单程PCR)或在一个不同的人(两级PCR)利用温度大约40°C和50°C,视反转录酶的属性使用所有剩余的进步PCR amplication一样[44]。

•多重聚合酶链反应(多重PCR)聚合酶的改变锚响应与一个特定的最终目标快速识别取消或复制大量的质量。这个过程会增加基因组DNA测试使用不同的预赛和temperature-interceded DNA聚合酶在温暖的循环[45]。复合pcr最初在1988年描述为一种技术来识别“抹除”的抗肌萎缩蛋白基因。它也同样被使用类固醇硫酸酯酶基因[46]。

应用聚合酶链反应

•聚合酶链反应被广泛利用的研究在不断扩大实验范围的订单。在微生物学和原子科学,例如,利用PCR的DNA克隆技术,探索实验室弄脏南部、DNA测序、DNA重组创新,给一些例子。在临床微生物学实验室PCR分析微生物疾病的,是无价的流行病学研究。在营养科学PCR已逐步成为必不可少的企业作为一种重要的园艺和维持不同的选择习惯识别策略[47]。PCR是另外利用犯罪现场调查实验室的一部分,是特别有价值的理由,只是有点测量需要独特的DNA,例如,足够的DNA可以从血珠或得到一个孤独的头发[48]。

•常数PCR(或qPCR)是目前使用的所有应用程序设置的惯例,遗留PCR。常数PCR技术已经应用在有机科学的所有分支。应用程序整合农业和营养商业企业、质量表达式检查,不可抗拒的疾病和人类遗传测试的结论[49]。因为他们的能力在荧光分析连续机器另外好[50]选项增强的动作,例如,NASBA荧光端点访问。部分使用PCR是按以下

•PCR可以用于遗传测试,DNA的一个例子是附近抛锚了遗传性疾病转换[51]。

•PCR可以利用的一个重要方面一个敏感的测试组织写作的关键器官移植[52]。

•PCR可以用于艾滋病毒检测(附近引起艾滋病的HIV感染可以解决利用PCR在血小板。PCR测试创建目标,它可以识别一个病毒基因组DNA的宿主细胞[53]超过50000。

•PCR可以用于基因指纹(科学科学)可以很独立的一个人从整个世界的民众[54]。时刻可以脱离犯罪现场的DNA测试和对比,从嫌疑人或DNA数据库之前确认或罪犯[55]。

•PCR可以用于DNA指纹分析可以帮助父母的测试(DNA测序)[56]。

•PCR可以用于DNA克隆——它可以集中片段插入一个向量的一个更大的基因组,这可能是在小数量[57]访问。

•PCR可以用于调查质量表达式的例子。组织或个人细胞可以在不同阶段检查,看看哪个品质已经得到动态或已交换[58]。

•PCR可以同时增加几个位点从单个精子大大升级世袭映射通过考虑染色体减数分裂[59]后混合动力车。

•PCR可以利用建立在人类物种之间的联系的研究和发展科学[60]。

•PCR可以用于帮助识别人类留在paleohistory陈旧。

•PCR可以利用PCR加强终止错误的DNA保存在黄金2000万年[61]。

•PCR可以用于识别质量搬到附近的一个有机生命体(转基因)[62]。

•PCR可以利用发展中生活的专注性。相应的体外治疗性引导初期的生物可以解决利用Y染色体特定预赛前植入子宫[63]。

•PCR创新鼓励致病生物的DNA或RNA的位置,因而,有助于临床分析测试范围的不可抗拒的专家如感染、微生物、原生动物[64]等等。这些pcr检测不同的兴趣点在日常柜台代理基于代理的指示系统,关注身体的抵抗病原体反应[65]。具体来说,pcr测试装备区分附近的致病性运营商提前比serologically-based例程,病人可以花费数周时间来创建抗体传染病专家[66]。pcr测试生产指定感染的衡量一个人的血液中(“病毒负担”)以这种方式允许医生检查病人的疾病运动和对治疗的反应。这奇妙的潜力提高疾病的临床管理由流行疾病,包括艾滋病[67]和[68]型肝炎病毒载量鉴定所有通过和治疗后[69]。

•pcr进行识别和/或诊断测试可以评估各种病原体,包括:

1。引起艾滋病的hiv - 1

2。乙肝和丙肝感染,可能会促使肝脏恶性肿瘤

3所示。人类乳头状瘤病毒,可能导致宫颈增长

4所示。沙眼衣原体,可能会促使fruitlessness女士

5。淋病奈瑟氏菌,可能会促使盆腔挑衅疾病女士

6。巨细胞病毒,可能会带来衰弱疾病在移植患者和其他存在免疫功能不全的个人,包括hiv - 1 /艾滋病患者

7所示。结核分枝杆菌,其动态状态导致结核病和可以促使组织污染器官的伤害[70 - 75]。

•利用PCR诊断遗传性疾病,是否因为内在遗传变化或作为遗传特征转换的结果,将是更正常。不规则甚至可以分析前概念。长串整合多态性(SSCP)或长串连锁多态性,特点是单链核苷酸的构象不同分组长度所用的驱动安排在特定的试验条件下的对比[76]。如今,SSCP是最相关的亚原子科学分析仪器。它可以用作基因分型结果的一部分,认识到不同等位基因的纯合子的人们,也杂合的人获得遗传异常[77]。

•遗传咨询是毁了遗传疾病的人检查记录提前解决在孩子选择[78]。这显然是由国家法律和规则。识别植入前遗传疾病的早期生物体外受精(体外制备)否则称为胚胎植入前的分析应该同样可能滥用PCR为基础的战略。进一步分析收购或一个没有约束的病,有症状或无症状(由于家族史像Duchene固体营养不良)基于PCR技术是异常宝贵的[79]。

•遗传手指印象是在最出色的滥用利用PCR(否则称为DNA分析)。概要文件的特定扩展运用DNA遗传的一部分指纹识别(总的来说,13个位点是看着)这是个体与个体对比[80]。PCR另外假定基因组或线粒体DNA的参加考试,考官使用的例子从头发轴和骨头当不同的标本不打开[81]。

•PCR克隆技术是一项基本方法允许的时代,很多纯粹的DNA链从轻微程度的格式和特定质量的进一步调查。几个修改PCR公约可以创建转换(一般或site-coordinated)在一个分组通过嵌入式部分或基础改变[82]。PCR用于s equence-labeled目的地(STSs)的指针,一个特定的部分基因组可用在一个特定的克隆。典型的调查是利用实时PCR表达式的例子品质在不同成型阶段。PCR可以同样地探索”打开或关闭特定的品质在不同阶段组织(甚至在单个细胞)[83]。

•PCR在不同领域的各种应用程序。人类基因组计划(HGP)在30亿年决定分组的基础结合在人类基因组中,大力依靠PCR。品质与各式各样的感染杰出利用PCR。例如,强大的萎缩,这是由一个高质量的变化,认识到PCR策略称为复合PCR [84]。PCR可以帮助研究DNA从不同的生命形式,例如,感染或微生物。PCR用于区分和研究物种间连接科学领域的变革。在人类研究中,它同样是用来理解过时的人体运动设计。在古生物学,它被用来识别陈旧的人类(85、86)。PCR通常利用古生物学家开放DNA物种或终止低温贮藏数百万年的化石,因此可以进一步研究阐明。

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