药学与药学研究与评论“雷竞技苹果下载，
菜单e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
Vasiliki Androutsopoulou1＊， Despina N Perrea1，伊利亚斯·P·杜拉米斯1, AspasiaTzani1，迪米特里奥斯·C·伊利奥普洛斯1，尼古拉斯·卡万扎斯2Dimitrios C Angouras3.
1实验外科和外科研究实验室"N.S. Christeas"，雅典国立大学医学院，希腊雅典
2雅典国立和卡波distrian大学医学院病理科，莱科大学医院，希腊雅典
3.雅典国立和卡波distrian大学医学院心胸外科，阿提康大学医院，雅典，希腊
收到日期:8/04/2019;接受日期:18/04/2019;发表日期:29/04/2019
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作品简介:一些临床研究旨在发现可能用于预防动脉瘤性主动脉扩张的药物。我们的研究评估了培哚普利和辛伐他汀在主动脉瘤实验模型中的作用。
材料和方法:39只家兔随机分为4组:对照组、CaCl2组、CaCl2+辛伐他汀组和CaCl2+培哚普利组。所有动物均行左后外侧开胸，在降主动脉壁上涂抹正常或CaCl2生理盐水。评估以下参数:最大血管直径、壁厚、动脉粥样硬化的存在、动脉粥样斑块的厚度以及IL-6和MMP-9在主动脉壁上的表达。
结果:用CaCl2治疗的主动脉在75%的病例中表现出明显的动脉粥样硬化，而对照主动脉只有20%。辛伐他汀和培哚普利均能显著减弱CaCl2的作用(4145±484 μm;P =0.039, 4209±280 μm;与CaCl2组比较，p=0.05)。各组间MMP-9表达的强度和程度均无差异。另一方面，辛伐他汀组和培哚普利组IL-6表达强度均低于CaCl2组(p=0.01)。CaCl2组主动脉直径与壁厚呈显著正相关(r=0.7;P =0.023)，辛伐他汀组和培哚普利组降低(r=0.238;P >0.05, r=0.05, P >0.05)。
结论:我们的研究表明，培哚普利和辛伐他汀通过降低主动脉壁上的局部炎症对动脉瘤的形成和发展具有保护作用。
药物制剂，培哚普利，辛伐他汀，动脉粥样硬化，胸主动脉瘤
主动脉瘤是指主动脉的一段或多段扩张至正常大小的1.5倍以上[1］．虽然通常无症状，但由于破裂或剥离的风险，它与高死亡率和发病率相关[1，2］．胸主动脉瘤(TAA)的病理生理是复杂和多因素的，涉及生物力学、炎症、遗传和环境因素[2］．炎症和重塑异常似乎是动脉瘤形成和发展的主要介质[2］．基质金属肽酶(Matrix metallopeptide ases, MMPs)和白细胞介素(interleukins)已被报道为涉及通路的主要代表[3.，4］．
迄今为止，治疗非破裂动脉瘤的金标准是手术或血管内修复[5，6］．尽管一些临床研究旨在发现潜在的药物制剂可用于预防动脉瘤性主动脉扩张，但目前还没有足够的证据[7-9］．
培哚普利是一种血管紧张素转换酶抑制剂(ACE-i)，主要用于抗高血压，并与降低心血管疾病患者的死亡率有关。其降压活性可导致剪切应力正常化和随后的主动脉壁炎症下调[9］．辛伐他汀是一种β-羟基β-甲基戊二酰辅酶a (HMG-CoA)还原酶抑制剂，主要用于血脂异常。然而，有大量证据表明，他汀类药物发挥除降脂外的特殊作用，主要与抗炎特性有关[10］．
本研究旨在探讨培哚普利和辛伐他汀在TAA实验模型中的作用及其在炎症过程和组织重塑中的意义。
动物模型与研究设计
8周大的新西兰雄性成年兔子，体重3-4公斤，来自希腊领土上一个经过认证的养殖场。动物被关在单一的金属笼子里，可以随意获得自来水和标准的平衡兔粮。室温在20 ~ 22℃之间，相对湿度在55 ~ 65%之间，光/暗周期为上午6点/下午6点。在实验的每个阶段都采取了一切可能的预防措施，以避免动物遭受痛苦。实验方案是由“科学委员会批准的协议使用动物用于科学目的”建立在实验室的实验外科和外科研究”N.S.雅典医学院和阿提卡地区主管兽医局的批准。该议定书符合欧盟关于在生物医学科学中使用动物的立法(第2010/63/EU号指令)。在加入该方案之前，动物们已经适应了三周。
39只兔子随机分为4组:
(a)对照组(n=6):动物行后外侧开胸术，在降主动脉壁上涂生理盐水(假手术)。
(b) CaCl2组(n=15):动物后外侧开胸，0.5 mol/L氯化钙溶液2应用于胸降主动脉。
(c)辛伐他汀组(n=9):在应用钙原酸的基础上，给药2.5 mg/kg/day / os2解决方案。
(d)培哚普利组(n=9):在应用氯化钙的基础上，给药0.3 mg/kg/d2解决方案。
辛伐他汀组和培哚普利组分别在术前1周和术后12周接受治疗。
外科手术
肌注氯胺酮25 mg/kg，木lazine 5 mg/kg诱导镇静。然后，这些动物被插管并连接到容积控制呼吸机上。机械通气调整为28 ~ 30次/min。通过眼静脉静脉注射30-50 mg/kg硫喷妥钠维持麻醉。每只动物给予生理盐水100 mL，用于补水和补血。左后外侧经第四肋间隙开胸。进入胸膜腔后，从左锁骨下动脉起点至横膈膜暴露胸降主动脉，并仔细切除邻近组织。然后，用碳酸钙浸湿的纱布2在主动脉外周表面施0.5 mol/L稀释剂。胸壁被层层闭合。没有使用胸管，因为动物无法忍受。动物被唤醒，然后拔管。手术后，每只动物都被密切观察一小时，然后被转移到笼子里。抗生素预防包括两剂量恩诺沙星(5mg /kg)，术中和术后第一天给药。术后未观察到死亡，没有动物被排除在分析之外。手术当天晚些时候开始喂食。戊巴比妥被用于安乐死。
假手术除应用生理盐水而非氯化钙外，与上述手术相同2在主动脉壁上。平均手术时间为40分钟，两种手术之间具有可比性。
组织病理学检查
安乐死后，立即将降主动脉在10%福尔马林中室温固定24小时。然后将组织用石蜡包埋，切片并安装在玻璃载玻片上。切片用苏木精-伊红染色，由两名独立的研究人员使用光学显微镜检查，他们对随机化方案不知情。
研究血管组织，并评估以下参数:最大血管直径、壁厚、动脉粥样硬化的存在和动脉粥样硬化斑块的厚度。
疣状
通过在自动机器(Dako)中使用低pH值溶液在90℃下加热样品，实现了脱亲和、水化和抗原性的恢复。然后将样品在过氧化氢溶液中孵育15分钟，以中和内源性过氧化物酶。然后用PBS缓冲液洗净，用抗mmp -9抗体，1:200稀释，4℃孵育过夜。第二天，PBS缓冲液洗净后，样品在Envision Flex-HRP中孵育30分钟。洗净后，将它们孵育在显色原3,3 ' -二氨基联苯胺(DAB) (Dako)中，DAB识别复合物并与之发生化学反应，导致抗原-抗体复合物的“棕色”色素沉着。然后用苏木精染色，用酒精脱水，最后用木醚澄清。最后阶段是使用光学显微镜对免疫染色进行评估。在IL-6的情况下遵循相同的程序，唯一的例外是使用1:50的稀释来恢复抗原性。
统计分析
连续变量数据以均值±1标准差表示，定性数据以频率(%百分比)表示。采用Kolmogorov-Smirnov检验和图形方法评估分布的正态性。两组以上的比较采用Bonferroni事后检验进行方差分析(ANOVA)。方差分析(ANOVA)用于检验除尿素增加百分比外所有检验变量的组间差异。采用Mann- Whitney 's U检验作为非参数检验，对I/R诱导后尿素增加率进行组间比较。Benjamini-Hochberg p值校正控制了5%的错误发现率。二分变量分析采用卡方检验。所有测试都是双面的。如果原假设可以被否定且95%置信度为>，则认为差异有统计学意义(p<0.05)。所有统计分析均采用SPSS (version 21 for Mac OS; SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
主动脉直径和壁厚
CaCl2与未处理组相比，应用于主动脉的血管直径平均增加了21%(分别为4876±617 μm vs. 3856±604 μm;p = 0.014)。辛伐他汀或培哚普利治疗均显著减弱了CaCl的作用2(4145±484 μm;P =0.039, 4209±280 μm;与CaCl相比，p=0.052集团)(图1)．各组间壁厚无差异(p>0.05) (图2)．
图1所示。胸降主动脉苏木精和伊红(H&E)染色。(A)对照组:主动脉组织学表现正常。H&E放大倍数，40倍;(B) CaCl2组:主动脉直径增大。H&E放大倍数，40倍;(C)辛伐他汀组:CaCl衰减2对主动脉直径的影响。H&E放大倍数，40倍;(D)培哚普利组:CaCl衰减2对主动脉直径的影响。H&E放大倍数，40倍。
图2。对照之间的差异，CaCl2辛伐他汀和培哚普利组对(A)主动脉直径的影响;(B)主动脉壁厚度(C)斑块厚度。
动脉粥样硬化和斑块形成
主动脉用CaCl治疗275%的病例出现明显动脉粥样硬化，而对照主动脉只有20% (图3)．应用辛伐他汀治疗CaCl2只有30%的治疗兔与动脉粥样硬化进展相关，而培哚普利治疗组的这一比例为20% (图3一)．CaCl的平均斑块厚度较高2与对照组、辛伐他汀组、培哚普利组比较(分别为134±157 μm vs 13±26 μm vs 32±64 μm vs 42±83 μm) (图3 b-3 d)．然而，由于分布范围较大，且存在标准差，上述观察结果未达到统计学意义(图4)．
图3。主动脉壁苏木精和伊红染色。(A)对照组:主动脉壁组织学表现正常。H&E放大倍数，120倍;(B) CaCl2组:主动脉壁厚度增加，伴动脉粥样硬化病变。H&E放大倍数，120倍;(C)辛伐他汀组:CaCl作用减弱2主动脉壁厚度与动脉粥样硬化病变。H&E放大倍数，120倍;(D)培哚普利组:CaCl作用减弱2主动脉壁厚度与动脉粥样硬化病变。H&E放大，120倍。
图4。免疫染色IL-6 (4A)，炎症的敏感标记物和MMP-9 (4B)，组织重塑的标记物。每张图片都代表了下面的每一组:Control, CaCl2辛伐他汀和培哚普利。放大120倍。
IL-6和MMP-9的表达
主动脉段免疫染色检测IL-6和MMP-9在主动脉壁的表达(图4分别)。各组间MMP-9表达的强度和程度均无差异(图5一个而且5 b分别)。另一方面，辛伐他汀组和辛伐他汀组IL-6表达强度均较低。图5 c)和培哚普利治疗(图5 d)组2组(p=0.01)。
图5。各组间MMP-9 (A、B)和IL-6 (C、D)表达的内涵和延伸。
主动脉直径与壁厚的相关性
在CaCl中，主动脉直径与壁厚呈显著正相关2组(r = 0.7;P =0.023)，辛伐他汀组和培哚普利组降低(r=0.238;P >0.05, r=0.05, P >0.05) (图6)．除了缺乏统计学意义外，令人感兴趣的是，治疗组的相关系数下降，表明直径降低的效果独立于任何一种方案对主动脉壁厚度的影响。
图6。各组胸主动脉直径与主动脉壁厚度的相关性，对照组为CaCl2分别为辛伐他汀组和培哚普利组。
TAA是一种潜伏性疾病，由于缺乏症状，往往无法诊断。最常见的是在超声筛查检查或破裂后诊断，这与高死亡率和发病率有关[11］．预防或阻碍其发展是保持动脉瘤相关死亡率低的关键组成部分。
TAA与高血压之间的相关性以及与特定遗传和环境因素的关系已得到证实[2］．TAA形成和发展的病理生理与主动脉壁炎症和异常剪切应力密切相关[2］．因此，我们旨在研究(a)降压剂和(b)他汀类药物的作用，即具有有效抗炎特性的药物。
我们的研究结果表明，培哚普利和辛伐他汀对胸主动脉壁上IL-6表达下调相关的TAA形成的保护作用。次要结果是，与CaCl相比，治疗组的主动脉壁厚度和主动脉直径之间没有相关性2观察到实质相关的组。此外，还指出了一个CaCl2-诱导的兔TAA模型以前从未报道过。
兔作为最佳实验模型
各种动物模型和干预措施已被用于诱导实验性TAA [12-14］．然而，兔子也有一定的优势。首先，他们的主动脉尺寸足够大，可以方便地将稀释剂直接稀释到主动脉壁，并提供了获得多个节段进行分析的可能性。它们与人类心血管系统的相似性支持了我们研究结果的临床意义[15］．此外，虽然兔子比啮齿动物大，但比猪或小牛小得多;因此，可以避免使用繁殖率低的大型动物模型。至于氯化钙的利用2钙对弹性蛋白的高亲和力导致钙-弹性组织复合体，从而削弱血管壁，导致动脉瘤的发展[16］．
培哚普利和主动脉扩张
培哚普利是广泛应用于心血管疾病患者的一线抗高血压药物。尽管由于培哚普利的降压作用，可以预期培哚普利与TAA进展之间存在负相关，但一项对141例患者的回顾性研究表明，使用ace抑制剂治疗的患者对升主动脉扩张没有益处[9］．另一方面，有研究表明ACE抑制剂具有抗炎特性，并通过抑制MMP-9的表达导致主动脉扩张的衰减。在我们的研究中，尽管各组间MMP-9水平没有差异，但IL-6显著下调，为培哚普利有效的血管抗炎作用提供了证据[17，18］．据报道，ACE抑制剂可以通过上调过氧化物酶体增殖受体α (PPAR-α)和γ (PPAR-γ)来导致炎症级联的衰减，这与它的降压特性和肾素-血管紧张素-醛固酮轴的阻塞无关[18］．虽然培哚普利的抗炎活性并不出名，但考虑到IL-6是主要的促炎细胞因子之一，我们可以推测，至少在局部水平上抑制炎症可能是其在TAA形成中有益作用的中心机制。
辛伐他汀与胸主动脉瘤形成
辛伐他汀是一种他汀类药物，即一类不仅以其降脂作用而闻名，而且以其多效作用而闻名的药物，其作用不依赖于胆固醇代谢，与炎症级联有关[7］．我们的研究结果表明辛伐他汀的抗炎特性可以减少TAA的进展。具体而言，与CaCl相比，辛伐他汀治疗与主动脉壁IL-6表达降低和主动脉直径显著降低有关2治疗组。这一发现与现有文献一致，即在诊断为动脉瘤疾病的患者中，他汀类药物治疗与动脉瘤进展呈负相关[7，8，19］．重要的是，所有现有的研究都将这一观察结果归因于他汀类药物的抗炎作用[8］．他汀类药物干扰炎症级联的多个阶段，即肿瘤坏死因子α (TNF-α)、核因子κ B (NF-κΒ)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)和PPAR-α [20.-22］．IL-6与上述细胞因子具有共同的途径，这一事实可能可以解释我们的发现[23］．
MMP-9悖论
TAA的发病机制与细胞外基质的异常重塑过程密切相关，即部分由蛋白水解介导的基质合成与降解之间的不平衡[8］．然而，在我们的研究中没有发现MMP-9下调。其他研究也报道了这一点，表明MMP家族其他成员的水平发生了变化，但MMP-9没有变化[13］．虽然现有的关于培哚普利对MMP-9水平影响机制的知识很少，但辛伐他汀的情况下有一小部分证据。体外实验表明，动物巨噬细胞和平滑肌细胞在辛伐他汀治疗后产生活性较低的MMP-2和MMP-9 [13］．然而，在体内，主动脉壁上的淋巴细胞数量超过巨噬细胞，平滑肌细胞因凋亡而显著减少，这表明无论使用辛伐他汀与否，MMP-9水平均较低[13］．
主动脉直径与壁厚的相关性
除了培哚普利和辛伐他汀在TAA病理生理方面的明显作用外，我们的结果的另一个值得考虑的方面是治疗组的主动脉直径和壁厚之间缺乏相关性。虽然两者都控制和CaCl2这两个参数在各组间表现出很强的相关性，而培哚普利组和辛伐他汀组均未观察到这一相关性。这一发现可以解释为这两种药物的抗动脉瘤作用，不局限于它们对主动脉壁厚度的直接影响。在此基础上，可以推测在全身水平或仅对主动脉内皮的潜在活性。鉴于现有文献包含了这些药物的局灶性和全身性作用的证据，可以考虑联合和协同作用[9，17，19，24］．
我们研究的主要结果是培哚普利和辛伐他汀通过降低主动脉壁局部炎症对TAA形成和发展的保护作用。次要结果包括:
•CaCl的可行性和有效性2主动脉周围在兔胸降主动脉的应用作为动脉瘤形成的实验模型。
•在药物治疗组中，主动脉直径和壁厚之间的相关性消失。然而，这是一项实验性研究，还需要进一步的转化和基础研究来验证我们的发现。
虽然该研究的结果很有希望，但也有不可忽视的局限性，即样本量小，缺乏外周血的测量。此外，采用了TAA的实验模型，这些发现需要在不同的TAA动物模型中得到证实。
