药学与药物科学研究与评雷竞技苹果下载论
菜单e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
Vasiliki Androutsopoulou1＊德斯皮纳·佩雷亚1伊利亚斯·P·杜拉米斯1, AspasiaTzani1Dimitrios C Iliopoulos1Nikolaos Kavantzas2迪米特里奥斯·C·安古拉斯3.
1实验外科和外科研究实验室"N.S. Christeas"，雅典国立和卡波迪斯特里亚大学医学院，希腊雅典
2雅典国立和卡波迪斯特里亚大学医学院病理科，希腊雅典莱科大学医院
3.雅典国立和卡波迪斯特里亚大学医学院心胸外科，希腊雅典阿提孔大学医院
收到日期:8/04/2019;接受日期:18/04/2019;发表日期:29/04/2019
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作品简介:一些临床研究旨在发现潜在的药物制剂，可用于保护动脉瘤性主动脉扩张。我们的研究评估了培哚普利和辛伐他汀在主动脉瘤实验模型中的作用。
材料和方法:将39只家兔分为4组:对照组、CaCl2组、CaCl2+辛伐他汀组和CaCl2+培哚普利组。所有动物均行左后外侧开胸术，并在胸降主动脉壁上涂抹正常或氯化钙生理盐水。评估以下参数:最大血管直径、壁厚、动脉粥样硬化的存在、动脉粥样硬化斑块的厚度以及动脉壁上IL-6和MMP-9的表达。
结果:用CaCl2治疗的主动脉75%出现明显的动脉粥样硬化，而对照组只有20%。辛伐他汀或培哚普利治疗可显著减弱CaCl2的作用(4145±484 μm);P =0.039, P = 4209±280 μm;p=0.05，与CaCl2组比较)。各组间MMP-9表达的强度和程度均无差异。另一方面，辛伐他汀组和培哚普利组IL-6表达强度均低于CaCl2组(p=0.01)。CaCl2组主动脉直径与壁厚呈显著正相关(r=0.7;P =0.023)，辛伐他汀和培哚普利组降低(r=0.238;P >0.05, r=0.05, P >0.05)。
结论:我们的研究表明，培哚普利和辛伐他汀通过下调主动脉壁局部炎症，对主动脉瘤的形成和进展具有保护作用。
药物制剂，培哚普利，辛伐他汀，动脉粥样硬化，胸主动脉瘤
主动脉瘤的定义是主动脉的一个或多个节段扩张至超过正常大小的1.5倍[1]。虽然通常无症状，但由于破裂或剥离的风险，其死亡率和发病率高[1，2]。胸主动脉瘤(TAA)的病理生理是复杂和多因素的，涉及生物力学、炎症、遗传和环境因素[2]。炎症和重塑异常似乎是动脉瘤形成和发展的主要媒介[2]。基质金属肽酶(MMPs)和白细胞介素已被报道为相关途径的主要代表[3.，4]。
迄今为止，治疗未破裂动脉瘤的金标准是手术或血管内修复[5，6]。尽管一些临床研究旨在发现潜在的药物制剂，可用于预防动脉瘤性主动脉扩张，但尚无足够的证据[7-9]。
培哚普利是一种血管紧张素转换酶抑制剂(ACE-i)，主要用于降压，并与降低心血管疾病患者的死亡率相关。其降压活性可导致剪切应力正常化，并随后下调主动脉壁炎症[9]。辛伐他汀是一种β-羟基β-甲基戊二酰辅酶a (HMG-CoA)还原酶抑制剂，主要用于血脂异常。然而，有大量证据表明，他汀类药物除了具有降脂作用外，还具有其他特殊作用，主要与抗炎特性有关[10]。
本研究旨在探讨培哚普利和辛伐他汀在TAA实验模型中的作用及其在炎症过程和组织重塑中的意义。
动物模型和研究设计
8周大、体重3-4公斤的新西兰成年公兔，来自希腊境内一家经认证的种鸡场。动物被安置在单一的金属笼子里，可以随意使用自来水和标准均衡的兔子饲料。室温为20 ~ 22℃，相对湿度为55 ~ 65%，光照/黑暗周期为上午6点/下午6点。在实验的每个阶段都采取了一切可能的预防措施，以避免动物遭受痛苦。实验方案由“科学委员会批准为科学目的使用动物的方案”，建立在实验外科和外科研究实验室由雅典医学院和阿提卡地区主管兽医局批准。该议定书符合欧盟关于在生物医学科学中使用动物的立法(指令2010/63/EU)。在实验开始前，动物们先适应环境三周。
将39只家兔分为4组:
(a)对照组(n=6):采用后外侧开胸术，在胸降主动脉壁上涂抹生理盐水(假手术)。
(b) CaCl2组(n=15):经后外侧开胸，给予0.5 mol/L氯化钙溶液2应用于胸降主动脉。
(c)辛伐他汀组(n=9):在给予CaCl的基础上，每天给药2.5 mg/kg/d2解决方案。
(d)培哚普利组(n=9):在给予CaCl的基础上给予0.3 mg/kg/d2解决方案。
辛伐他汀组和培哚普利组分别于术前1周和术后12周给予相应的治疗方案。
外科手术
肌内注射氯胺酮25 mg/kg、噻嗪5 mg/kg致镇静。然后给这些动物插管并连接到容量控制呼吸机。机械通气调整为28 ~ 30次/min。麻醉通过眼静脉滴注30-50 mg/kg硫喷妥钠维持。每只动物给予生理盐水100 mL补水和补血。左后外侧开胸经第四肋间隙。进入胸膜腔后，将胸降主动脉从左锁骨下动脉起始处暴露至横膈膜，并仔细切除邻近组织。之后，用氯化钙浸湿纱布2将0.5 mol/L稀释于主动脉外膜周围表面。胸壁呈层层闭合。没有使用胸管，因为动物无法忍受。动物们被唤醒，随后拔管。手术后，每只动物都被密切观察一个小时，然后被转移到笼子里。抗生素预防包括两剂恩诺沙星(5mg /kg)，分别在术中和术后第一天给予。没有观察到术后死亡，也没有动物被排除在分析之外。在手术当天晚些时候开始喂养。戊巴比妥被用于安乐死。
假手术与上述手术相同，只是使用生理盐水而不是氯化钙2在主动脉壁上。平均手术时间为40分钟，两种手术方式之间具有可比性。
组织病理学检查
安乐死后立即用10%福尔马林在室温下固定降主动脉24小时，石蜡包埋组织，切片，载于玻璃显微镜载玻片。切片用苏木精-伊红染色，并由两名独立的研究人员用光学显微镜检查，他们对随机方案不了解。
研究血管组织，并评估以下参数:最大血管直径、壁厚、动脉粥样硬化的存在和动脉粥样硬化斑块的厚度。
疣状
脱胶、水化和恢复抗原性是通过在自动机器(Dako)中使用90℃的低pH溶液加热样品来实现的。然后将样品在过氧化氢溶液中孵育15分钟，使内源性过氧化物酶被中和。然后用PBS缓冲液洗净，用抗mmp -9抗体1:200稀释，在4°C下孵育过夜。第二天，用PBS缓冲液冲洗后，样品在Envision Flex-HRP中孵育30分钟。冲洗后，将它们孵育在色素原3,3 ' -二氨基联苯胺(DAB) (Dako)中，该色素原识别该复合物并与其发生化学反应，导致抗原-抗体复合物的“棕色”色素沉着。然后用苏木精染色，用酒精脱水，最后用木耳澄清。最后阶段是利用光学显微镜对免疫染色进行评价。在IL-6的情况下，遵循相同的程序，唯一的例外是使用1:50的稀释来恢复抗原性。
统计分析
对于连续变量，数据以平均值±1标准差表示;对于定性数据，数据以频率(%百分比)表示。用Kolmogorov-Smirnov检验和图解法对分布的正态性进行了评估。两组以上的比较采用Bonferroni事后检验进行方差分析(ANOVA)。采用方差分析(ANOVA)检验除尿素%增加外所有检验变量的组间差异。采用Mann- Whitney 's U检验作为I/R诱导后尿素百分比增加的组间比较的非参数检验。5%的错误发现率通过Benjamini-Hochberg p值校正得到控制。二分类变量的分析采用卡方检验。所有的测试都是双侧的。如果原假设可以被95%置信度(p<0.05)拒绝，则认为差异具有统计学意义。所有统计分析均在SPSS (Mac OS版本21; SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
主动脉直径和壁厚
CaCl2与未治疗组相比，主动脉上的应用导致直径平均增加21%(分别为4,876±617 μm和3,856±604 μm);p = 0.014)。辛伐他汀或培哚普利治疗均可显著减弱CaCl的作用2(4145±484 μm;P =0.039, P = 4209±280 μm;p=0.052集团)(图1)。各组间壁厚差异无统计学意义(p < 0.05) (图2)。
图1所示。胸降主动脉苏木精和伊红(H&E)染色。(A)对照组:主动脉组织学表现正常。H&E放大率，40倍;(B) CaCl2组:主动脉直径增大。H&E放大率，40倍;(C)辛伐他汀组:CaCl的衰减2对主动脉直径的影响。H&E放大率，40倍;(D)培哚普利组:CaCl的衰减2对主动脉直径的影响。H&E放大，40倍。
图2。控制之间的差异，CaCl2(A)主动脉直径，辛伐他汀组和培哚普利组;(B)主动脉壁厚度(C)斑块厚度。
动脉粥样硬化和斑块形成
用CaCl治疗主动脉275%的病例出现明显的动脉粥样硬化，而对照组只有20% (图3)。辛伐他汀对CaCl的应用2仅30%的治疗兔与动脉粥样硬化进展相关，而在培哚普利治疗组，这一比例为20% (图3一)。CaCl的平均斑块厚度更高2与对照组、辛伐他汀组和培哚普利组比较(分别为134±157 μm∶13±26 μm∶32±64 μm∶42±83 μm) (图3 b-3 d)。然而，由于分布的范围和标准偏差较大，上述观测结果没有达到统计显著性(图4)。
图3。苏木精和伊红(H&E)染色主动脉壁。(A)对照组:主动脉壁组织学表现正常。H&E放大倍数，120倍;(B) CaCl2组:主动脉壁增厚，伴动脉粥样硬化病变。H&E放大倍数，120倍;(C)辛伐他汀组:CaCl作用减弱2关于主动脉壁厚度和动脉粥样硬化病变。H&E放大倍数，120倍;(D)培哚普利组:CaCl作用减弱2关于主动脉壁厚度和动脉粥样硬化病变。H&E放大倍数，120倍。
图4。免疫染色IL-6 (4A)，炎症敏感标志物和MMP-9 (4B)，组织重塑标志物。每张图片分别代表了以下各组:Control, CaCl2辛伐他汀和培哚普利。放大120倍。
IL-6和MMP-9的表达
采用主动脉段免疫染色法检测IL-6和MMP-9在主动脉壁上的表达(图4分别)。各组间MMP-9表达的强度和程度均无差异(图5一个和5 b分别)。另一方面，IL-6表达强度在辛伐他汀(图5 c)和培哚普利(图5 d)组与CaCl组比较2两组比较p=0.01。
图5。各组间MMP-9 (A、B)和IL-6 (C、D)表达的增强和扩展。
主动脉直径与壁厚的相关性
在CaCl中，主动脉直径与壁厚呈显著正相关2组(r = 0.7;P =0.023)，辛伐他汀和培哚普利组降低(r=0.238;P >0.05, r=0.05, P >0.05) (图6)。除了缺乏统计学意义外，同样有趣的是，相关系数在治疗组中有所下降，这表明降径效果与两种治疗方案对主动脉壁厚度的影响无关。
图6。两组及对照组胸主动脉直径与主动脉壁厚度的相关性2辛伐他汀组和培哚普利组。
TAA是一种潜伏的疾病，由于缺乏症状，往往无法诊断。最常见的是在超声检查或破裂后诊断，死亡率和发病率高[11]。预防或阻止其发展是保持动脉瘤相关死亡率较低的关键因素。
TAA与高血压之间的相关性已得到证实，并与特定的遗传和环境因素有关[2]。TAA的形成和进展与主动脉壁的炎症和异常剪切应力密切相关[2]。因此，我们的目的是研究(a)降压剂和(b)他汀类药物的作用，即一种具有有效抗炎特性的药物。
我们的研究结果表明，培哚普利和辛伐他汀对TAA形成的保护作用与下调胸主动脉壁IL-6的表达有关。次要结果是与CaCl相比，治疗组的主动脉壁厚度和主动脉直径之间没有相关性2观察到显著相关性的组。此外，还指出了一种CaCl2-诱导的兔TAA模型未见报道。
家兔作为最优实验模型
多种动物模型和干预措施已被用于诱导实验性TAA [12-14]。然而，兔子有一定的优势。首先，他们的主动脉尺寸足够大，可以方便地将稀释剂直接应用于主动脉壁，并提供了获得多段分析的可能性。它们的心血管系统与人类的相似支持了我们研究结果的临床意义[15]。此外，尽管兔子比啮齿动物大，但却比猪或小牛小得多;因此，可以避免使用繁殖率低的大型动物模型。就CaCl的利用而言2钙对弹性蛋白的高亲和力导致钙-弹性组织复合体，从而削弱血管壁并导致动脉瘤的发展[16]。
培哚普利与主动脉扩张
培哚普利是一种广泛应用于心血管疾病患者的一线降压药。尽管培哚普利的降压作用与TAA进展呈负相关，但一项针对141例患者的回顾性研究表明，接受ace抑制剂治疗的患者升主动脉扩张没有获益[9]。另一方面，有研究表明ACE抑制剂具有抗炎特性，并通过抑制MMP-9的表达而导致主动脉扩张的衰减。在我们的研究中，尽管各组间MMP-9水平没有差异，但IL-6明显下调，这为培哚普利有效的血管抗炎作用提供了证据[17，18]。据报道，ACE抑制剂可以通过上调过氧化物酶体增殖体受体α (PPAR-α)和γ (PPAR-γ)而独立于其降压特性和肾素-血管紧张素-醛固酮轴的阻断而导致炎症级联的衰减[18]。尽管培哚普利并不以其强大的抗炎活性而闻名，但考虑到IL-6是主要的促炎细胞因子之一，我们可以推测，至少在局部水平上抑制炎症可能是其在TAA形成中有益作用的核心机制。
辛伐他汀与胸主动脉瘤形成
辛伐他汀是一种他汀类药物，即一类药物不仅具有降脂作用，而且具有多效性，不依赖于胆固醇代谢，与炎症级联反应有关[7]。我们的研究结果支持辛伐他汀作为减少TAA进展的介质的抗炎特性。具体而言，与CaCl相比，辛伐他汀治疗与主动脉壁IL-6表达降低和主动脉直径显著降低相关2治疗组。这一发现与现有文献一致，他汀类药物治疗与诊断为动脉瘤性疾病的患者的动脉瘤进展呈负相关[7，8，19]。重要的是，所有现有的研究都将这一观察结果归因于他汀类药物的抗炎作用[8]。他汀类药物干扰炎症级联的多个阶段，即肿瘤坏死因子α (TNF-α)、核因子κ B (NF-κΒ)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)和PPAR-α [20.-22]。IL-6与上述细胞因子有共同的途径，这一事实可能可以解释我们的发现[23]。
MMP-9悖论
TAA的发病机制与细胞外基质的异常重塑过程密切相关，这是一种基质合成和降解之间的不平衡，部分由蛋白质水解介导[8]。然而，在我们的研究中没有发现MMP-9的下调。其他研究也报道了这一点，表明MMP家族其他成员的水平发生了变化，但MMP-9没有变化[13]。尽管现有的关于培哚普利对MMP-9水平影响的机制的知识很少，但辛伐他汀的情况有一小部分证据。体外实验表明，动物巨噬细胞和平滑肌细胞在辛伐他汀治疗后产生活性较低的MMP-2和MMP-9 [13]。然而，在体内，主动脉壁的淋巴细胞数量超过巨噬细胞，平滑肌细胞因凋亡而强烈减少，表明无论辛伐他汀给药与否，MMP-9水平都很低[13]。
主动脉直径与壁厚的相关性研究
除了培哚普利和辛伐他汀在TAA病理生理方面的明显作用外，我们的结果值得考虑的另一个方面是治疗组主动脉直径和壁厚之间缺乏相关性。虽然control和CaCl都有2各组在这两个参数之间表现出很强的相关性，这在培哚普利组和辛伐他汀组都没有观察到。这一发现可以解释为这两种药物的抗动脉瘤作用并不局限于它们对主动脉壁厚度的直接影响。在此基础上，可以推测在系统水平或仅对主动脉内皮的潜在活动。鉴于现有文献包含了这些药物的局部和全身作用的证据，可以考虑联合和协同作用[9，17，19，24]。
本研究的主要结果是培哚普利和辛伐他汀通过下调主动脉壁局部炎症抑制TAA的形成和进展。次要结果包括:
•CaCl的可行性和有效性2腹主动脉周围在兔胸降主动脉动脉瘤形成实验模型中的应用。
•药物治疗组主动脉直径和壁厚之间的相关性丧失。然而，这是一项实验研究，需要进一步的转化和基础研究来验证我们的发现。
尽管其结果令人鼓舞，但本研究也有不可忽视的局限性，即样本量小，缺乏外周血测量。此外，我们采用的是TAA的实验模型，这些发现还需要在不同的TAA动物模型中得到证实。
