+ 44 7480725689西奥·斯托达德·贝内特1、2*和蕾妮·雷霍·佩拉1、2
收到日期:10/09/2018;接受日期:24/09/2018;发表日期:01/10/2018
诱导多能干细胞，帕金森病，α -突触核蛋白，细胞和组织治疗，疾病建模，多巴胺能神经元。
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帕金森病(PD)是一种导致黑质致密部多巴胺能神经元局部神经退行性变的顽固性疾病。目前帕金森病的许多治疗方法都是对症治疗，但目前还没有临床级疾病改善治疗的选择。幸运的是，细胞重编程领域的最新进展现在允许以前无法实现的细胞疗法和使用诱导多能干细胞(iPSCs)对PD进行建模，以潜在地恢复无病状态。诱导多能干细胞可选择性分化为多巴胺能神经元，以模拟内源性生理和发病机制。iPSC系也可以与遗传相关的PD建立。这些患者特异性细胞系然后在影响突变中进行基因校正，随后可以移植回患者体内以重建功能。今年，诱导多能干细胞iPSCs进入了PD治疗的首次人体试验。这种形式的细胞治疗在其他模式生物中显示出有希望的结果，目前是我们减缓甚至停止帕金森病进展的最佳选择之一。在这里，我们研究了重塑我们对PD的理解的遗传贡献，以及iPSCs在疾病建模和临床治疗方面的优势和应用。
神经退行性疾病尽管经过了几个世纪的研究，在老龄化的世界中，它仍会继续构成越来越大的身体和经济负担。这些疾病包括帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、巴顿病和亨廷顿舞蹈病等。自发现以来，神经退行性疾病已通过尸检和体检在临床上得到确认。蛋白质聚集物的形成、局部神经元死亡和进行性症状都是典型的神经退行性病变;然而，由于遗传学领域的最新进展，我们对这些疾病的发病机制和病因学的认识已经得到了重建。在再生医学的推动下，研究继续寻找潜在的病理机制和治疗方法，以阻止甚至减缓这些严重疾病的进展。
帕金森病是第二大常见的神经退行性疾病，在过去60年里使1%的人口衰弱[1]。因此，它在老龄化社会中提出了一个特殊的问题[2，3.]。虽然许多神经元网络受到PD的影响，但它是黑质致密部(SNpc)的多巴胺能神经元(DAn) [4-6和Meynert的基底核(nucleus Basalis)是最严重缺失的[7]。SNpc的局部细胞死亡导致基底节区运动控制网络的破坏，导致pd -运动迟缓、颤抖、僵硬和其他言语和步态变化的特征性运动症状。PD的组织病理学特征是存在含有错误折叠的alphasynuclein的Lewy小体和Lewy神经突[8]。路易体的形成通常始于SNpc，但也有文献记载其逐渐扩散到大脑的其他结构[9]。α -突触核蛋白的作用增加了对帕金森病其他非运动症状的关注，包括自主神经功能障碍、睡眠障碍和神经精神症状(抑郁、精神病、幻觉)[10]。许多病因学问题仍然存在。尽管运动症状仅在80%的死后α -突触核病中有记录[11]，这些运动症状持续作为临床诊断的标志。
为了更好地了解帕金森氏症，研究人员已经尽可能地寻找能反映帕金森氏症表型表现的模型。迄今为止，研究人员已经以三种方式使用了模式生物(酵母、小鼠、果蝇和非人类灵长类动物)。首先，通过腹腔注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,5,6-四氢吡啶(MPTP)来模拟SNpc中DAn细胞的氧化应激死亡。虽然有助于检查阻断多巴胺表达的影响，但该模型未能重建高敏感DAn的潜在神经病理学和典型的路易神经突和路易体的形成。其次，在模式生物中过度表达人类危险因素，如SNCA基因，显示出与人类病理表型相似的年龄依赖性DAn退化[8，12，13]。这些结果支持alphasynuclein在PD进展中的因果作用，但目前缺乏临床应用。最后，人类胚胎干细胞(hESC)和诱导多能干细胞(iPSC)在现有的PD状态下被移植到模型生物中。当使用最佳的行动方法执行时，该程序显示出混合但有希望的结果[14-20.]。hESCs和iPSCs都具有独特的特性，使它们成为研究PD发展的理想候选者[21]。干细胞可以被定制为分化成一系列细胞命运，包括在细胞水平上模拟PD的SNpc的DAn [22，23]。诱导干细胞也是患者特异性的，在表型相似的状态下，打开了突变和多态性风险因素对PD的个人贡献的窗口。DAn寿命也可以与其他iPSC神经元(如皮质神经元和嗅觉神经元)进行比较，以探测SNpc中DAn的特异性超敏性。此外，TALEN、CRIPSR和其他基因重编程技术的出现已应用于iPSCs的患者系，并被广泛回顾[24，25]。然后可以检查修正后的突变系。在中脑腹侧获得高比例的功能完整、成熟的DAn是相当具有挑战性的，而且扩大规模的成本很高。除了伦理障碍之外，iPSC还有技术障碍治疗可能会限制移植重编程干细胞的可行性，但这种治疗PD的机会是前所未有的。从iPSC来源移植dan的首个人体临床试验将于今年开始。在这里，我们研究了导致我们目前对帕金森病的理解的发现，并提出iPSC移植作为帕金森病最可行的疾病修饰治疗形式之一。
到2018年，至少有5个主要常染色体显性基因，5个常染色体隐性或x连锁因素，以及11个单基因突变已被确定为其他表现出帕金森样症状的疾病[26]。其中最值得注意的是LRRK2的突变和多态性，它在神经元存活中发挥作用[27]，以及影响α -突触核蛋白的SNCA基因生产［28]。然而，尽管有大量统计证据的有力支持，[29]，所有已知的基因突变和风险增强多态性的影响结合起来只能解释疾病遗传风险的一部分。目前基因探测技术的进步只会让遗传咨询的分析更加清晰，增强对帕金森病进展的理解，最终针对患者的治疗。1997年，在SNCA基因中发现了一个新颖但罕见的突变，该基因编码一种相对未知的蛋白质，称为α -突触核蛋白[28]。错义突变(A53T)导致常染色体显性PD遗传，可以通过几乎全外显率的遗传系追踪。在路易体和路易神经突中发现，α -突触核蛋白的表达归因于帕金森病的发病机制。未受影响的α -突触核蛋白被认为也有助于囊泡翻转和突触释放，其确切功能仍然未知[30.]。然而，一项研究表明，α -突触核蛋白在适当折叠成四聚体时，表现出保护特性，并减缓路易体的形成和聚集[31]。2002年，Funayma等人报道了一个日本家族中与PD遗传相关的12号染色体区域，该家族被称为相模原家族[32，33]。两年后，该基因被确定为LRRK2 [34]。到目前为止，LRRK2的突变是帕金森病遗传影响的最常见原因[33，35]。LRRK2突变占报道的家族性PD的4%，大多数病例的病理与伴有路易体形成和DAn死亡的散发性PD难以区分[34-36]。对含有这些突变的细胞模型的研究表明，激酶活性增加导致神经氧化应激和毒性[37，38]。尽管该蛋白具有多功能，但敲除LRRK2会抑制神经祖细胞向dan的分化，并增加细胞死亡[27]。这些发现表明LRRK2在中脑腹侧的细胞存活和分化中具有促进作用。在常染色体隐性遗传的家族性帕金森病中也发现了遗传位点。两个基因，磷酸和紧张素同源诱导的假定激酶1 (PINK1)和Daisuke- Junko-1 (DJ-1)，是特别感兴趣的。在纯合子病例中，PINK1和DJ-1突变均导致30多岁发病早，对左旋多巴治疗反应低，疾病进展缓慢[39,40]。此外，对戈谢病(GD)和PD共病的敏锐临床观察促使研究人员检查了其他可疑蛋白。GD是一种常染色体隐性疾病，由GBA的纯合突变引起。GBA是一种中枢神经系统的溶酶体酶，被认为在PD突变时也在蛋白质聚集中发挥作用[41]。GBA突变已于2009年被证实是PD最常见的遗传风险因素，目前在3-7%的特发性PD病例中存在[42]。技术进步与不断增加的样本量和合作相结合，有望发现更多遗传和表观遗传影响的来源。对上述讨论的基因进行了总结表1．
表1:帕金森病的主要家族类型及遗传因素。
| PD继承 | 疾病(突变) | 基因定位 | 基因功能 | 表型 |
|---|---|---|---|---|
| 常染色体显性 | PARK-SNCA (A53T A30P、E46K H50Q, G51D,重复,三倍 | SNCA 4 q22-1 | SNCA基因编码广泛表达于神经元突触前末端的α突触核素蛋白。α - sysnnuclein维持参与神经元交流的囊泡的产生。α -sysnuclein也被认为在自愿和非自愿运动路径的多巴胺表达中发挥作用 | 早发性帕金森病。SNpc内的神经变性和路易体信息遍及大脑。 |
| PARK-LRRK2 (G0219s R1441C) | LRRK2, I2q12 | 编码富含亮氨酸的重复激酶2蛋白，在神经元的细胞质和线粒体膜中表达。LRRK2大量参与分子的泛素化，导致分子降解。PD中的价格功能尚不清楚，但人们认为它在中脑协调神经元的生存和分化。 | 迟发性PD伴混合神经病理。一些病例在SN出现路易体形成和DAn死亡，另一些病例没有路易体形成 | |
| 常染色体隐性 | Park-dj1， (q456x, v170g) | DJ-1。1 p36.23 | 编码蛋白质DJ-1，在大脑和全身其他组织中发现。DJ-1是一种多功能蛋白，其作用涉及防止α - sysnlein聚集，氧化应激条件下的神经元保护，转录调节和预防金属诱导的细胞毒性。这些功能的全部或部分可能与某些类型的早期帕金森病形成有关 | 尚无结论性数据报道。 |
| PARK-PINK1(外显子7缺失) | PINK1, Ip36.12 | 编码蛋白质pten诱导的假定激酶1，位于线粒体内。PINK1在细胞应激过程中通过引起parkin蛋白与分离的线粒体结合并诱导自噬，表现出线粒体的保护功能。 | 在SNpc中，早发性PD伴路易体形成和急性DAn损失。 | |
| 遗传风险因素 | 戈谢病(L444P, N370S) | GBA, 1的时候 | 一种在溶酶体和细胞膜中活跃的酶的编码。β -糖脑苷酶是一种家政酶，它水解糖脑苷的-糖苷连接，生成葡萄糖和神经酰胺。突变导致巨噬细胞中糖脑苷的积累。 | 除了肝功能衰竭、骨损伤和低血细胞计数外，还有几种神经系统并发症。 |
通过使用患者特异性iPSC系和基因工程，遗传学的贡献得到了提高技术来操纵它们。自从Yamanaka在2007年发现少数转录因子可以逆转细胞分化以来，iPSCs已被广泛用于神经退行性疾病的研究，以指导患者特异性细胞的命运[43，44]。虽然在范围上仍然有限，但iPSCs目前是PD最可靠和表型相似的模型[45]。结果突变现在可以在iPSC系中被捕获，并由小分子引导到PD模型中的DAn命运——所有这些都在一个培养皿中。公开显示，突变的实时细胞效应可以与控制线一起进行物理观察和研究，以限制受影响个体的遗传背景效应;同样，PD常见的氧化应激效应也可以通过广泛的临床应用来量化，用于药物筛选而没有人类副作用。不足为奇的是，由于患者的神经元隐藏在大脑深处，iPSC研究涉及的神经退行性变和神经保护机制仍然难以从物理上得到证实。由于重编程协议中消除了衰老的一些表观遗传效应，这些效应同样不能完美地转化为PD的细胞环境。iPSCs向中脑dan的分化始于最初的去分化。在过去的10年里，通过在体细胞中过度表达某些转录因子，使它们恢复到多能状态，产生了成千上万的iPSC系。这些方法已被广泛审查[24，25]。目前的重编程方法使用片段、病毒和合成mRNA来上调转录因子的表达，而不需要基因组整合，从而导致肿瘤的发生[46-48]。去分化经常导致突变，因此，并非所有的iPSC系都具有相同的质量。虽然理论上iPSC重编程会导致基因组的克隆复制，但对iPSC的整个基因组进行测序显示，在编码区重编程期间，平均有6个从头突变[49]。广泛的质量控制已就绪，以衡量iPSC系的质量，如NANOG表达，iPSC系的转录组分析与现有的hESC表达数据，以及生物信息学测试，如Pluritest [50]。如果临床医生希望在个性化医疗中进一步实施iPSCs，这些保障措施是至关重要的。从中脑多能干细胞到成熟dan的分化模拟了胚胎发育中的一个特定途径。SNpc的多巴胺能神经元最初被认为像其他皮质神经元一样起源于神经上皮细胞，但实际上它们与脊髓相似，起源于神经管的腹侧底板[51]。Lmx1a和FoxA2等其他底板标记物的表达证实了其胚胎学起源[52，53]。使用小分子和神经营养因子的分化方案通过激活音hedgehog (SHH)通路、抑制SMAD和添加FGF8来模拟体内神经地板模式[54,55]。通过转染转录因子也可以实现分化，但自发整合禁止这些方法从任何临床级应用。调节DAn细胞类型是通过添加WNT信号分子CHIR99021 (CHIR)来实现的。添加的CHIR越多，DA神经元采用的后脑特征就越多[56]。通过正确的数量，可以获得表达GIRK2特征标记的SNpc的dan。iPSC系中局部dan的神经发生为帕金森病的人类状况提供了无与伦比的建模。在干细胞模型中，与其他模式生物不同，内源性细胞机制和转录反馈被保留，这是精确模拟这种遗传复杂疾病的基本步骤。iPSCs也被用于模拟AD，这表明它在整个神经退行性疾病中有更广泛的应用障碍［57]。此外，iPSC系现在可以保持对PD病理的自然易感性，而无需来自MPTP的非自然高氧化。通过实施CRISPR/Cas9编辑，可以进一步分离遗传效应，以减少遗传和克隆变异。iPSC突变模型可以在去分化时进行额外的基因校正，并与突变系共培养，以控制表观遗传和传代状态[58]。虽然重编程技术已用于特发性PD患者，但iPSC模型对单遗传原因的患者提供了最大的遗传见解。2011年，在SNCA基因中存在A53T突变，建立了首个与PD基因相关的iPSC系[59]。随后固定突变，共培养均分化为酪氨酸羟化酶阳性(TH+)神经元。也从有SNCA基因重复和三次的爱荷华人亲属中提取了几十个系[60]。这些线显示对神经毒素和氧化应激源的敏感性增加，表明PD的模型更准确，但有健康的怀疑，因为毒素的添加可能不能准确地描绘PD的潜在机制[21]。尽管如此，这些模型在探索受影响患者对环境损害的内源性反应方面是有用的，可能表明线粒体功能障碍。虽然这个列表并非详尽无遗，但在多个具有LRRK2的iPSC系中，遗传易感性也得到了量化[61-63]， pink1 [64]和GBA突变[65]。也许iPSC技术在未来也将被用作一种诊断工具，以预测个体对PD的易感性以及来源细胞疗法。中脑腹侧DAn死亡的易感性一直未能被模型所发现，但新一代iPSC突变系迎接了这一挑战。此外，iPSC系的建立没有牺牲人类受精卵或药物试验中的破坏性副作用，允许在没有人类伤害或伦理问题的情况下进行病理调查。这些条件都是目前两种治疗方法的基础:细胞疗法和患者特异性移植。
帕金森病的最初治疗始于1960年，当时发现患者缺乏神经多巴胺。临床医生开始静脉注射左旋多巴，这是多巴胺的前体，可以通过血脑屏障，症状几乎立即得到改善[66]。几十年来，左旋多巴治疗一直是治疗帕金森病的金标准，但目前还有其他商业上可用的针对帕金森病的药物，没有多巴胺能作用机制[67]。增加对多巴胺通路的关注也有助于阐明基底节区的运动回路。随着对受影响电路的新认识，通过对苍白球和丘脑下核内部部分进行电刺激的深部脑刺激(DBS)被引入作为一种补充治疗，并取得了显著的积极效果[68]。DBS领域的时间只提高了电极放置的精度，更高的灵活性和更长的电池寿命，以抑制副作用[68-70]。与大多数神经系统疾病一样，许多研究也表明，运动、舞蹈和冥想等非药物、非手术干预的相对有效性[71，72]。在基因革命的推动下，揭示的亚细胞机制终于允许从对症治疗转向临床级疾病修饰治疗的发展。不是因为缺乏兴趣，目前还没有可以减缓或阻止帕金森病神经退行性变的疾病治疗方案。然而，还是有一些药物在不同临床试验阶段显示有希望的候选药物[73]。iPSCs的有效性也被作为一种实现这种改变疾病的治疗的方法进行了研究。干细胞已经在一些涉及神经损伤的试验中被用于治疗。第一次发生在2010年，一项使用hESCs治疗脊髓损伤(SCI)的临床试验[74]。从那时起，干细胞衍生产品已用于其他动物和人体试验，用于治疗神经疾病，从年龄相关性黄斑变性(AMD)的阳性结果到AD的不良结果[75，76]。这些试验产生了好坏参半的结果——在某些情况下，由于细胞和大体解剖差异，突出了模式生物在预测人类神经退行性疾病治疗疗效方面的局限性[77]。相对局部的神经变性，PD也是一个很好的候选细胞治疗。1987年，腹面中脑的胎儿组织被植入PD患者，试验结果显示，在某些病例中，即使在植入后20年，细胞仍然存活和DAn功能仍然存在[78，79]。如上所述，每个患者获取4-10个胚胎的伦理以及保存后细胞存活的限制阻碍了胎儿细胞移植作为全国范围内可行的细胞治疗形式[80]。hESCs也被用于2017年中国的PD试验，但在没有确凿数据的情况下推测其有效性还为时过早[81]。尽管hESC植入可能产生有希望的结果，但必须使用强免疫抑制剂来确保移植物被接受。所有重编程细胞移植的安全性是至关重要的。在进行移植试验时，必须采取预防感染、移植物诱导的运动障碍和肿瘤发生的预防措施。尽管细胞移植总是存在一定的风险，但iPSCs的优势为PD的细胞治疗提供了一个可行的未来。这些相关的细胞疗法的历史可以在图1．
图1:多能细胞疗法在帕金森病研究中的进展。从1987年开始，胎儿腹侧中脑dan被用作第一个使用细胞治疗PD的临床试验的细胞来源。近年来，hESCs被用于一些涉及神经退行性疾病的临床试验。hESCs在脊髓损伤(SCI)、老年性黄斑变性(AMD)以及心脏细胞损伤方面表现出特别的前景。2018年夏天，临床医生开始进行首次使用iPSCs作为细胞源治疗PD的人体试验。这项试验将在两年的时间里跟踪7名患者。这些试验的结果在文中有详细说明。
第一个优势是iPSC系可以在不牺牲人类胚胎的情况下建立，消除了人类干细胞治疗的一大伦理障碍。iPSCs还允许人类白细胞抗原(HLA)在患者特异性治疗中匹配，有效地降低术后免疫抑制剂的严重程度。在灵长类动物研究中，组织相容性还显示了在iPSC移植dan时淋巴细胞和小胶质细胞的免疫应答降低以及细胞存活率增加[82]。iPS去分化和重编程可能是漫长的，并给患者带来高昂的成本负担，但减少免疫排斥和通用供体系可以在扩大规模时显著降低成本。患者特异性iPSCs移植所需的步骤概述于图2。
图2:iPSC移植。首先，从患有家族性帕金森病的患者身上获得成纤维细胞。研究人员表达主要的重编程转录因子来建立突变的iPSC系。利用ZNF/TALEN或CRISPR/Cas9技术，纠正显著突变，然后在无异种条件下分化为成熟或祖细胞DA神经元。经过充分的质量保证后，分化的细胞就可以用于临床试验。
在日本，研究人员估计，通过匹配三个HLA位点(A、B和DR)，来自HLA纯合子供体的50个iPS系将覆盖73%的日本人口[47]。灵长类动物研究已经证明，在使用iPSCs治疗PD两年后，帕金森病有了显著改善[83]。但iPSC移植治疗帕金森病的临床疗效有待进一步研究。由高桥领导的团队宣布了第一个人类临床试验ipsc生成的DAn移植治疗PD [84]。该试验于2018年8月1日在京都大学医院开始。细胞将来自与HLA位点匹配的第三方捐赠者，以确保遗传完整性并消除患者的遗传干扰。然而，由于试验的探索性，患者仍将接受免疫抑制剂。大约500万个细胞将通过头骨上的两个钻孔注入SNpc [85]。7名患有中度帕金森病的患者被选为试验对象，他们在神经退行性疾病早期接受了细胞治疗，但也带来了更大的实验风险，并将被随访两年。临床医生将监测疾病的进展，以及SNpc中过多的多巴胺会导致不自主运动的其他副作用。虽然围绕iPSCs和基因工程的许多问题和伦理问题仍然存在，但PD的未来看起来很有希望。然而，iPSC治疗PD可能不会完全恢复功能，应该在其他治疗方案的背景下进行检查。
SNpc中即使是一小簇7,800个dan的丢失也可能导致PD患者严重衰弱。虽然细胞死亡可能由许多假定的机制引起，但最终神经元的存活是正常运动和认知功能不可或缺的。由于目前没有治疗方法可以从严重的细胞死亡中恢复，iPSCs提供了一种潜在的恢复无病状态的替代途径。新的、不容易患PD的患者特异性细胞可能被移植回SNpc，最终有望恢复功能。程序性细胞死亡并不仅仅影响PD患者;iPSC治疗可能会缓解与AD、ALS和亨廷顿氏病广泛应用相关的细胞死亡。
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