单核增生李斯特菌特异配体的噬菌体展示选择:诊断或治疗目的的新工具

摘要

革兰氏阳性细菌单核增生李斯特菌是一种危险的食源性感染李斯特菌病的病原体。食源性李斯特菌病是一种相对罕见的疾病，但尽管进行了抗生素治疗，致死率仍高达30%。预防李斯特菌污染是一项重要的食品安全挑战，对快速和特异性单核增生李斯特菌检测系统以及抗菌剂的需求正在稳步上升。然而，由于缺乏特异性和高仿射抗体，单增李斯特菌有效检测方法的发展受到阻碍。抗体片段或短合成肽是有趣的替代品作为探针的细菌检测，以及新的治疗方法。它们可以很容易地通过噬菌体显示来选择。本文就单增李斯特菌特异性配体的研究进展作一综述

关键字

单核细胞增多性李斯特氏菌，噬菌体展示，探针，多肽，检测，治疗

简介

革兰氏阳性细菌单核细胞增多性李斯特氏菌是李斯特菌病的病原体，一种危险的食源性感染。l . monocytogenes天然存在于农业环境中，但通常存在于加工食品中，特别是在即食食品和乳制品中[1］．它可以适应广泛的食品加工和储存条件，包括冷藏温度和极端pH值条件或盐含量[2］．食源性李斯特菌病是一种比较罕见的疾病，尽管有抗生素治疗，但病死率约为30% [3.］．2015年欧盟委员会李斯特菌病通报率为每10万人口0.44例，自2012年以来呈稳步上升趋势(欧洲食品安全局和欧洲疾病预防控制中心，2015)。预防李斯特菌污染是一项重要的食品安全挑战，并要求快速和具体l . monocytogenes检测系统以及抗菌剂正在稳步增长。

兼性细胞内细菌穿过肠道屏障，可全身传播。此外，它可以克服其他宿主屏障，如胎盘或血脑屏障，导致胎儿感染或脑膜炎以及脑炎[4，5］．细胞生物学l . monocytogenes近年来，人们对细胞系感染进行了深入研究。l . monocytogenes通过被称为内蛋白A和内蛋白B的表面蛋白的作用进入非吞噬细胞，这是感染所必需的。与人体细胞表面蛋白的相互作用通过空泡化触发内化。从寄主液泡中逃逸是由分泌的蛋白质、李斯特菌溶素O和磷脂酶的孔隙形成活性介导的。一次l . monocytogenes已经到达细胞质，它可以转移到邻近的细胞[6，7］．

降低风险l . monocytogenes受污染食品的感染和防止食品召回，需要建立快速和准确的现场检测方法。种特异性检测也是非常重要的，因为在李斯特菌属的17个物种中(包括近邻l . monocytogenes五个近亲:l . innocua，l . ivanovii，l . marthii，l . grayi而且l . seeligeri［8),只l . monocytogenes对人类有致病性[9］．l . monocytogenes包括13种血清型，取决于体细胞和鞭毛抗原的变异，其中3种(血清型4b, 1/2a, 1/2b)是导致大多数人类感染的原因[10，11］．目前，传统的培养方法需要3至7天，这段时间太长，无法在食用前对新鲜产品进行检测。到目前为止，快速检测方法的发展l . monocytogenes由于缺乏高度仿射和物种特异性抗体而受到阻碍。尽管进行了大量的努力，但没有多克隆或单克隆抗体具有足够的选择性和亲和力用于检测l . monocytogenes可以被开发出来，Bhunia认为l . monocytogenes要么缺乏既独特又具有抗原性的表面表位，要么表位在抗体生产和成熟过程中没有得到有效处理[12］．

稳定的抗体片段，作为抗体或短合成肽的强大而廉价的替代品，都是由噬菌体展示选择的，是一种有趣的替代探针，用于细菌检测，以及新的治疗方法。抗体片段或多肽可以很容易地固定在任何生物传感器表面，并已成功地用于检测鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌［13-18］．

与抗体的产生相反，噬菌体的显示不依赖于抗原的处理和呈现。这种方法发明于1985年[19]并已成功应用于许多研究领域，用于鉴定小肽配体和具有治疗和诊断目的的抗体[20.］．

噬菌体展示技术是基于与噬菌体外壳蛋白融合的多肽库的构建。不同的研究小组已经建立了数百个图书馆，但商业图书馆的使用也很普遍，例如新英格兰生物实验室(NEB)博士噬菌体展示图书馆。噬菌体选择程序，也称为生物筛选，包括用噬菌体显示肽库培养目标分子(通常固定在固体表面)，清洗未结合的噬菌体，洗脱结合的噬菌体和扩增洗脱的噬菌体。与目标结合的噬菌体粒子在三到四轮选择中被捕获和富集。一轮一轮的反选择或减法选择，例如针对相关细菌种类，可以增加所得到的肽的特异性，这些肽可以在噬菌体DNA测序后合成[21-23］．

在这篇综述中，我们着重于噬菌体展示选择抗体片段或多肽选择性结合l . monocytogenes。噬菌体显示探针的概述在(表1)．寡肽M13噬菌体展示在病原体研究中的应用以及抗细菌、病毒和寄生虫的抗感染药物的开发已经在其他地方进行了综述，但不是本文的重点[23，24］．

表1。的概述单核细胞增多性李斯特氏菌特异性抗体片段和多肽。

主要内容

Paoli等人于2004年发表了第一篇关于噬菌体展示单链可变片段(scFvs)物种特异性选择的报告。单链抗体是免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区域的融合蛋白，与一个由10到25个氨基酸组成的短连接肽相连[36］．在丝状噬菌体表面随机表达的单链顺溶菌被用于溶液生物筛选l . monocytogenesATCC 19115作为目标。菌株的l . ivanovii而且l . innocua被用于减法轮的选择。通过两种独立的筛选方案，一种有负选择，一种没有负选择，筛选出单个噬菌体克隆LmP4:A8。对LmP4:A8克隆及其他克隆进行了结合特异性检测l . monocytogenes，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，以代表噬菌体的单链抗体片段检测其他六种密切相关的李斯特菌和其他九种与食品微生物学有关的细菌。对于包括LmP4:A8在内的几个克隆，结合到一个或多个毒株l . monocytogenes如果没有对小组中任何其他物种的交叉反应就可以证明[25］．

2007年，发表了一项研究，其中更详细地描述了噬菌体显示的scFv LmP4:A8的特异性。再次用代表噬菌体的单链抗体片段进行酶联免疫吸附试验(ELISA)，研究了26株菌的结合选择性l . monocytogenes噬菌体显示的单链抗体对李斯特菌有绝对特异性l . monocytogenes和26个国家中的21个l . monocytogenes菌株检测。为了确保LmP4:A8的表面靶点在除脑心输注介质(Brain-Heart Infusion Medium, BHI)外的其他介质中也能表达，我们对21株李斯特菌进行了LmP4:A8在其他介质中的结合情况的研究。的特殊性l . monocytogenes被维持，但检测到l . monocytogenes菌株在不同培养基中差异显著。

测试LmP4:A8抗原是否为蛋白质或任何其他大分子，全细胞提取物l . monocytogenes进行SDS-PAGE和Western blot分析。蛋白抗原的鉴定将允许更直接的方法来选择抗体或其他结合探针。LmP4:A8检测到表观质量约为90 kDa的蛋白。亚细胞部分的研究表明，在细胞壁和培养上清中都发现了相应的蛋白质[27］．在后来的出版物中，这种蛋白质被揭示为ActAl . monocytogenes毒力因子，表达于细菌细胞表面，通过肌动蛋白聚合在细胞间移动中发挥重要作用[26］．。

在他们的下一篇文章中，作者报道了一种允许组氨酸标记生物素化表达的质粒载体的构建l . monocytogenes特异性的scFvs(克隆LmP4:A8)大肠杆菌。scFvs被固定在链霉亲和素偶联免疫磁珠(IMBs)上，以及它们的捕获和检测能力l . monocytogenes进行了测试并与市售产品进行了比较l . monocytogenes海事局。特异性的l . monocytogenes以及scFv-IMBs的捕获效率高于市售的抗李斯特菌- imbs [28］．

尽管表达l . monocytogenes在2007年的出版物中描述了特异性的scFv, Brewster等人使用表达scFv克隆LmP4:A8的噬菌体开发了一种l . monocytogenes基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器系统。在这里，使用SPREETA传感器与简单的流体系统来表征吸附固定噬菌体克隆LmP4:A8和Act a之间的相互作用，并检测的全细胞l . monocytogenes［29］．SPREETA传感器是一种紧凑而廉价的一次性传感器，只需要一个流体系统和接口电子设备。它们已经成功地用于检测其他细菌种类或它们的肠道毒素[37，38］．

2015年，Tu等人描述了l . monocytogenes种特异性纳米体，随后被用于检测l . monocytogenes牛奶中。两个小说l . monocytogenes特异性克隆，命名为L5-78和L5-79，从噬菌体显示抗体库中分离出来，该抗体库来源于未免疫羊驼重链抗体(VHHs)的可变域。VHHs是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段，能够选择性地与特定抗原结合。单域抗体分子量为12-15 kDa，比普通抗体小得多。编码VHH的DNA可以很容易地进行克隆和表达，而所得到的蛋白质比普通抗体更耐热，对洗涤剂和高浓度尿素更稳定[39］．噬菌体库首先在96孔条带板上进行了四轮淘洗，四轮热杀淘洗l . monocytogenes细胞(血清型4b)和一轮负选择，在来自其他属的8种不同细菌的混合物上进行。从上一轮随机选取96个克隆进行间接噬菌体ELISA检测。38个克隆体的DNA结合到l . monocytogenes并对10个不同噬菌体克隆进行了抗李斯特菌和其他细菌属的结合活性检测。噬菌体克隆L5-78和L5-79结合于各种血清型l . monocytogenes，但对其他属的细菌的影响要小得多。相应的编码序列被亚克隆，在大肠杆菌中表达并纯化。并对其热稳定性、尿素稳定性及耐pH性进行了表征。由于重组VHH L5-79表现出更合适的性能，因此将其用于VHH基的开发l . monocytogenes特异性夹心酶联免疫吸附试验，检测限为1 × 10⁴CFU /毫升(30.］．

2005年，Gasanov等人利用随机噬菌体肽展示技术鉴定了李斯特菌和李斯特菌的新表面抗原l . monocytogenes。使用市售的ph . 12mer随机肽噬菌体显示库进行固定化l . monocytogenes细胞。非特异性噬菌体是通过吸收噬菌体库在未涂层和bsa堵塞孔。减法选择执行顺序应用于固定l . innocua而且l . ivanovii细胞的鸡尾酒。经过两轮筛选，提取10个噬菌体单克隆的DNA。10个克隆中的9个氨基酸序列为:TTSPLSQGSSYI。该肽与人胰岛素样生长因子II受体(IGFIIR)蛋白(又称不依赖于负离子的甘露糖6-磷酸受体)中的肽序列具有显著同源性，表明可能已经鉴定出一种新的李斯特菌结合和入侵受体。荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的合成肽TTSPLSQGSSYI与李斯特菌属结合，但与其他属的细菌种不结合，荧光光谱和FACS研究证实了这一点。结合似乎不依赖于InlA和InlB这两种侵袭因子，而MSII和MS9细胞的侵袭则依赖于l . monocytogenes两种侵袭因子缺失均显著降低。通过将细胞或全细胞提取物结合到磁珠上，随后从胎牛血清中亲和纯化天然受体，进一步证实了李斯特菌对IGFIIR的结合。对哺乳动物细胞的粘附和侵入l . monocytogenes被合成肽和甘露糖6-磷酸显著抑制，甘露糖6-磷酸与IGFIIR受体自然结合在与所选肽相同的表位[31］．

Carnazza等人利用两个噬菌体显示的随机肽库(包含随机非肽和十二肽)来选择细胞表面的肽配体l . monocytogenes。噬菌体克隆在4轮亲和选择中与悬浮细胞结合，并分析每轮的噬菌体克隆池与悬浮细胞的相对结合l . monocytogenes通过ELISA。从pVIII-9aa库中选择的克隆被发现绑定l . monocytogenes到相对较高的程度，如pVIII-12aa库。共沉淀试验证实了这一结果。8个克隆反应强烈l . monocytogenes并对它们的DNA进行测序，以揭示所显示肽的氨基酸序列。噬菌体LN6 (RKLYALVPPPAP)和L16(氨基酸序列未给出)与之反应强烈l . monocytogenes在共沉淀试验和被用来测试的可能性固定l . monocytogenes仿射噬菌体到一个假定的生物传感器表面。LN6和LN16都能固定在石英上，其中LN6的结合效率更高。成功绑定l . monocytogenes可以通过高倍光学相位对比显微镜来证明固定化噬菌体[32］．

2013年，Morten等人使用表面、溶液和减影生物筛选相结合的方法来筛选l . monocytogenes通过噬菌体展示特异性结合肽，使用NEB ph . 12mer随机噬菌体展示肽库。对其进行减影生物筛选l . innocua这是基因上最接近的菌株l . monocytogenes［40］．在前三轮中，采用表面生物镀膜l . monocytogenes。随后，在其中一种方案中，对减法表面生物镀膜l . innocua是执行。在另一种方案中，先进行两轮溶液生物筛选l . innocua，然后反对l . monocytogenes,分别。所选噬菌体的DNA在对固定化进行第三轮生物筛选后进行测序l . monocytogenes，以及在最后几轮选拔之后。随后的噬菌体克隆ELISA结合评价显示，从第二轮生物筛选后获得的池中克隆的噬菌体均具有较高的特异性l . monocytogenes4b than forl . innocua，以及沙门氏菌，大肠杆菌空肠弯曲杆菌。4个亲和度最高的克隆的特异性检测l . monocytogenes与其他5种李斯特菌的实验结果表明，表达GRIADLPPLKPN肽段的噬菌体克隆对其最特异l . monocytogenes。从其他选择池中，只有一个噬菌体克隆显示出较高的相对结合l . monocytogenes比l . innocua。有趣的是，四个噬菌体克隆与l . monocytogenes4b，只有一种能够结合其他测试的血清型1/2a和1/2c。对于一些噬菌体克隆，用化学方法合成代表肽，并测试其与噬菌体的结合l . monocytogenes而且l . innocua或者将它们固定在动态薄片上，并结合平板计数进行磁分离测试。所有测试的肽都没有显示出任何结合或不再显示出特异性l . monocytogenes。

Flachbartova等人使用NEB博士-12mer噬菌体显示库对多药耐药进行了筛选l . monocytogenes目的是筛选与细胞表面结合的肽，以分离和表征新型抗菌肽。在溶液中经过4轮筛选，从20个噬菌体克隆中分离出DNA并进行测序。10个克隆编码序列NHLSTPVWSITG，简称L1, 4个克隆编码序列DQFVHDVKGTKH，简称L2, 6个克隆编码序列NSWIQAPDTKSI，简称L3。

在浓度为200 μM时具有杀菌效果。两者都对能量代谢有显著影响，因为它们导致ATP水平显著下降。这两种多肽对真核细胞均无毒性作用，通过XTT法测定，也没有显示出任何溶血活性。物理化学性质测定表明，L2的净电荷为正电，L3的净电荷为中性，总疏水比分别为25%和33%。抗菌肽的净正电荷是与带负电荷的膜结合所必需的[41，42］．两种肽与其他抗菌肽的序列相似(各约35%)[34］．

结论

李斯特菌病是一个重大的公共卫生问题。尽管使用抗生素治疗，仍有30%的报告病例是致命的[3.］．近年来，李斯特菌病的发病率稳步上升[43]，此外，多药耐药菌株l . monocytogenes，李斯特菌病的病原体，被描述为[44-47］．微生物检测在确保食品安全方面发挥着重要作用。对食源性病原体进行快速和针对不同物种的监测是预防人类感染的最有效方法[48］．目前，耗时的基于培养的方法是金标准，但在开发适合现场检测的快速检测方法上花费了大量精力。更先进的方法包括聚合酶链反应(PCR)、DNA杂交或依赖生物选择性探针捕获和检测细菌或其他指示生物分子的方法，如ELISA、免疫磁分离或生物传感器技术[48］．

尽管付出了大量努力[49-53]，没有足够选择性和敏感性的多克隆或单克隆抗体用于检测l . monocytogenes可以被开发。高敏感性是专性的，因为可能存在于食品中的细菌数量非常低，特异性是至关重要的，因为李斯特菌属的细菌广泛分布在环境中，但仅l . monocytogenes对人类有致病性[9，27］．抗体片段和特异性肽，可能存在于噬菌体克隆上，可以成为抗体的一种有吸引力的替代品，并提供持久性、稳定性和低成本的标准化生产[54-56］．

抗体片段和多肽都可以通过噬菌体展示轻松选择，该方法已成功应用于许多不同的研究领域，包括癌症研究、阿尔茨海默病研究和传染病[23，57，58］．

关于选择抗体片段或多肽来结合l . monocytogenes，在本文综述的所有文章中，都使用了整个细胞作为靶标。细胞表面是由脂质、碳水化合物和蛋白质组成的复杂混合物[59，60),而l . monocytogenes包括13种血清型，依赖于体细胞和鞭毛抗原的变异。为了确保所得探针的特异性，反选择或减法选择几乎应用于本文综述的文献中描述的所有噬菌体显示方案[25，30.，31，33］．在Carnazza及其同事和Flachbartova等人发表的文章中，没有进行减法轮选择，也没有对所得探针的特异性进行测试[32，34］．虽然生物筛选是一个简单的过程，但结果强烈依赖于多种因素，如反相选择、靶标性质、文库组成和实验参数[23］．由于噬菌体库中含有大量噬菌体，这些噬菌体会与筛检过程中使用的不同材料结合，如塑料、链霉亲和素、牛血清白蛋白或其他阻断材料等，因此必须严格消除假阳性。重要的一点是结果探针的亲和性。在倾向上，多肽的仿射性不如抗体，其KD在微摩尔范围内。只要探针由噬菌体表示，亲和性效应就会发挥作用，因为探针会不止一次出现，这取决于它们融合的噬菌体蛋白质。在NEB博士肽库中，肽被融合到噬菌体外衣蛋白III，并被表示为5倍。在Carnazza等人使用的库中，多肽与外衣蛋白pVIII融合，并以150到300个拷贝表示。如果合成所代表的多肽，亲和效应就会丧失，亲和性会显著降低。有趣的是，在这里回顾的大多数文章中，合成肽的结合特性没有被证明。

l . monocytogenes优先影响免疫系统缺陷者、孕妇、年幼者和老年人，30%的病例可导致致命后果[3.］．耐多药临床和食源性分离株的出现迫使人们需要新的治疗策略。l . monocytogenes对抗菌肽高度敏感，这为开发新的治疗策略或食品防腐剂铺平了道路。细菌的生长受到人类防御素和一些植物来源多肽的强烈抑制[61］．抗菌肽具有非特异性的作用机制，常导致细胞壁破坏或抑制细胞壁相关过程，或抑制核酸、蛋白质或酶的产生[62-65］．一些抗菌肽，如白蛋白A，属于IIa类细菌素，结合l . monocytogenes具有比其他革兰氏阳性细菌更高的亲和力，并且已在生物传感器平台中用作实时细菌检测的生物识别元件[66］．

Flachbartova等人使用组合噬菌体展示分离肽结合到al . monocytogenes多药临床分离物。令人惊讶的是，尽管只选择了表面结合，但三种选择的肽中有两种显示出抗菌活性，它们之间没有显示出任何明确的一致序列模式。肽的作用模式以及结合表位在细胞表面将是非常有趣的，但尚未揭示。

确认

这项工作得到了TechnologieAllianzOberfranken (TAO)和adalbert - rap - stiftung的支持。

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