急诊室SARS-CoV-2变异筛查政策显示2例接种ChAdOx1-S的患者因Alpha变异而中度感染

摘要

随着COVID-19大流行的演变和变异的出现，实地监测疫情非常重要。只有基因组测序才能准确地分型变异，但这种方法昂贵、耗时，不适合常规使用。RT-qPCR检测所关注的主要突变，尽管局限性更大，但是一种快速、可靠和负担得起的替代方法。

摘要

随着COVID-19大流行的演变和变异的出现，实地监测疫情非常重要。只有基因组测序才能准确地分型变异，但这种方法昂贵、耗时，不适合常规使用。RT-qPCR检测所关注的主要突变，尽管局限性更大，但是一种快速、可靠和负担得起的替代方法。

关键字

COVID-19;冠- 2;病毒基因组;低氧血症

简介

急诊室是COVID-19患者的主要门户之一。在我们机构，在实验室进行的检查中，10%以上涉及通过急诊室入院的病人。在大流行开始以来的几个月里，出现了关注变体(VOC)和兴趣变体(VOI)，并在社区中传播。一些作者报告了传染性或免疫逃逸与SARS-CoV-2的刺突蛋白突变之间的联系[1-4］．然而，精确地确定变异类型需要对病毒基因组进行测序。此外，下一代测序(NGS)只能在专门的实验室进行，交货时间往往超过一周，不符合临床实践。此外，该方法昂贵、费力，不适合大规模应用。最近几个月，已经开发了其他替代方法，并通过RT-qPCR检测VOCs中最常遇到的具有临床意义的突变。与NGS相比，即使这些分析提供的基因组信息更少，但它们的优势是比NGS便宜8倍左右，并且可以常规纳入PCR平台进行常规筛查。因此，在获得一线阳性检测24小时后即可获得结果。本研究的主要目的是评估SARS-CoV-2突变对COVID-19患者预后的影响。

材料与方法

在37天内，我们审查了就诊于急诊室并被诊断为SARS-CoV-2的患者的记录。RT-qPCR检测N501Y、E484K基因突变及H69/V70基因缺失。

设置

该评估于2021年3月5日至4月11日在布鲁塞尔地区一家拥有550张床位的公立医院进行。我们的3个急诊室之一收治的所有连续患者，均有任何COVID-19检测的迹象，且SARS-CoV-2结果呈阳性。对每位患者进行为期2个月的临床随访。

数据收集

由一名急诊医学主管回顾性审查这些病历。收集的指标包括人口统计学、COVID-19史、以前接种COVID-19疫苗的概念(包括疫苗类型、接种剂量和最后一次注射日期)和临床数据。还记录了测量参数(入院时和最差时PO2、CRP、d -二聚体)以及每位患者的结局(住院、转院、ICU住院、住院时间和死亡率)。

COVID-19感染诊断

1需要对病毒基因组进行测序。此外，下一代测序(NGS)只能在专门的实验室进行，交货时间往往超过一周，不符合临床实践。此外，该方法昂贵、费力，不适合大规模应用。最近几个月，已经开发了其他替代方法，并通过RT-qPCR检测VOCs中最常遇到的具有临床意义的突变。与NGS相比，即使这些分析提供的基因组信息更少，但它们的优势是比NGS便宜8倍左右，并且可以常规纳入PCR平台进行常规筛查。因此，在获得一线阳性检测24小时后即可获得结果。本研究的主要目的是评估SARS-CoV-2突变对COVID-19患者预后的影响。材料和方法在37天内，我们回顾了就诊于急诊室并被诊断为SARS-CoV-2的患者的记录。RT-qPCR检测N501Y、E484K基因突变及H69/V70基因缺失。该评估于2021年3月5日至4月11日在布鲁塞尔地区一家拥有550张床位的公立医院进行。 All consecutive patients admitted to one of our 3 emergency rooms with any indication for a COVID-19 testing and with a positive SARS-CoV-2 result were included in the study. For each patient, a clinical follow-up was carried out over a 2-month period. Data collection The medical records were reviewed retrospectively by a single emergency medicine supervisor. The metrics collected were demographics, history of COVID-19, notion of previous COVID-19 vaccination (including vaccine type, number of doses received and date of last injection) and clinical data. Measured parameters were also recorded (PO2 at admission and worst, CRP, D-Dimers) as well as the outcome of each patient (hospitalization, transfer to another hospital, admission to the ICU, length of stay and mortality). Diagnostic of COVID-19 infection Patients were considered positive according to the results of the RT‐qPCR. The analyses were performed as follows: all the samples tested were fresh nasopharyngeal swabs taken from UTM-RT swabs (Copan SpA, Brescia, IT) or from Vacuette Virus Stabilization Tube (Greiner Bio-One International GmbH, Kremsmünster, Austria). First-line molecular analyses were performed either by Transcription Mediated Amplification using the Aptima® SARS-CoV-2 assay kit (Hologic, San Diego, CA, USA) on a Panther platform, or by PCR using the Allplex® kit (Seegene Technologies, Seoul, South Korea) after extraction with the STARMag Viral DNA/RNA 200 C Kit (Seegene Technologies, Seoul, South Korea) on a STARLet platform (Hamilton Company, Reno, NV, USA). The positive results were retested with RT-qPCR with extraction using the Novaplex™ SARS-CoV-2-variants I kit (Seegene Technologies, Seoul, South Korea), targeting the RdRP gene and the following mutations: deletion H69/V70, N501Y and E484K. The search for mutations is considered positive when the cycle threshold (Ct) is less than or equal to 33 cycles. The amplification step was performed using a CFX96 C1000 thermal cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

统计分析

使用MedCalc 10.4.0.0版本(MedCalc软件，奥斯坦德，比利时)进行统计分析。描述性统计方法用于分析数据。p值<0.05被认为显著。

结果

在为期37天的研究中，纳入了125名covid -19阳性患者:52名女性，73名男性，中位年龄(95%置信区间(CI);极端)50.7岁(50.4-56.8;14.0 - -95.1)。既往无患者报告COVID-19病史。5例患者接种了ChAdOx1-S疫苗(Vaxzevria®，阿斯利康，牛津，英国)，其中2例接种了2剂。接受一次剂量的患者在第一次剂量后4、7和14天入院，接受两种剂量的患者在第二次剂量后2和9天入院。表1显示了接种疫苗患者的特征。入院时74例(59.2%)患者出现呼吸困难，27例(21.6%)患者出现消化系统症状，54例(43.2%)患者出现发热，70例(56%)患者出现一般状态退化。住院71例(56.8%)，其中重症监护室21例，转院6例。住院时间(2个月复查)为12天(95% CI: 8.8-14.2)， 7例患者在数据分析前仍在住院。8例患者(6.4%)在观察后1个月内死亡(入院至死亡时间[95% CI]: 13.5天[6.1-23.2])。死亡原因均与COVID-19有关:病毒性肺炎导致低氧血症(N=2)或心肺骤停(N=1)，与COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合征(N=4)和继发性肺栓塞(N=1)。

表2住院、ICU和死亡患者PO2、CRP和d -二聚体检测结果。数值比较采用Mann-Whitney u检验。在不同类型的患者中，d -二聚体水平没有观察到差异。CRP水平在需要住院的患者、ICU住院患者和死亡患者中显著升高。ICU患者的PaO2在全球范围内较低。在急诊室给予以下治疗:低分子肝素44.8%;糖皮质激素40.0%;抗生素13.6%。19.2%的患者采用对症治疗(扑热息痛、止咳药)。E484K、N501Y突变和H69/V70缺失分别占6.4%、84.8%和82.4%。表3显示突变组合与患者预后之间的关系。Kruskal-Wallis方差分析不允许强调具有不同变异的患者在住院、ICU住院和死亡率方面的显著差异。所有8例死亡患者(中等年龄[95% CI]: 72.6岁[60.1-84.8])H69/V70缺失和N501Y突变检测均呈阳性。其中一名患者在7天前服用了ChAdOx1-S。对照RdRP基因的中位Ct (95% CI)为20.9(20.5 ~ 22.4)个周期。

表2患者类别参数。

表3。急诊室和整体变异的分布。

讨论

RT-qPCR在VOC检测中的临床定位

监测SARS-CoV-2变体至关重要，因为一些VOCs具有临床意义。这种监测已经在国家监测计划层面上进行了评估，但测序能力有限，现场参与者也可以在VOC和VOI检测中发挥作用。急诊科参与COVID-19筛查，包括高危接触者和症状与COVID-19相符的患者。雷竞技网页版在我们的机构，SARS-CoV-2的分子检测结果可在24小时内获得，而在比利时，对VOC最常见突变的搜索通常在48小时内进行。此外，自本研究结束以来，一线检测有时直接在患者床边使用快速护理点分子筛查方法进行。其性能相当于经典的RT-qPCR，并在短短10分钟内产生定性结果。然后，对于COVID-19阳性结果，现在系统地执行用于VOCs检测的RT-qPCR，从而检测最频繁的突变。我们可以检测到H69和V70H69/V70)缺失和N501Y和E484K突变，这些突变影响所有的刺突蛋白。实施这一新程序后，通过指定24小时内检测到的突变，可以返回COVID-19阳性结果。此外，用PCR检测VOCs比用NGS检测更可靠。 Indeed, the performance of NGS is poor for Ct above 25, while PCR can detect mutations up to Ct 33, and therefore in samples with much lower viral loads. In our series, 31 samples out of 125 (24.8%) with a Ct>25 would potentially not have been interpretable by NGS.

H69/V70缺失首先在丹麦被描述，并与未能使用某些分子方法检测编码刺突蛋白的S基因有关[5］．这种变体在比利时很常见。2020年9月左右出现了VOC B.1.1.7、B.1.351和P.1，其中包括N501Y突变。VOC B.1.351和P.1(南非和巴西)结合了N501Y和E484K突变。VOC B.1.1.7(英国变种)结合H69/V70和N501Y，但也可能出现E484K突变。这是比利时最常见的VOC。虽然N501Y显著增加了它们的传染潜力，但E484K会影响抗体中和[4，6，7］．

VOC对ChAdOx1-S疫苗逸出的影响

VOCs的表型影响现在得到了更好的理解。例如，B.1.1.7涉及的传播风险增加[8]，并可能加重病情(有住院的风险[9]或死亡[10])。世卫组织COVID-19流行病学每周更新现已详细说明对疫苗的影响[11但数据仍然碎片化。目前仍需要加强对疫苗逃逸病例的监测和报告。Lopez Bernal等人最近表明，单剂量ChAdOx1-S可提供对COVID-19的显著保护，并可进一步预防持续至少6周的严重疾病，包括对抗英国变异担忧(B.1.1.7)。他们还得出结论，单剂量这种疫苗在防止因COVID-19入院治疗方面的有效性约为80% [12］．相比之下，Madhi等人的研究表明，由于B.1.351[13]变异，ChAdOx1 nCoV-19疫苗的两剂方案并没有显示出对轻中度COVID-19的保护作用。本研究的主要目的是评估SARS-CoV-2突变对COVID-19患者预后的影响。我们利用了最常见变异的可用性结果，以便将它们的存在与通过急诊科入院的患者的临床影响联系起来。正如预期的那样，含有H69/V70和N501Y(假定为VOC B.1.1.7)的样本占主导，几乎代表了80%的阳性患者。在调查时，野生病毒(武汉-胡-1)仅占阳性病例的11.2%。无论突变结果如何，超过一半的患者需要住院治疗，近30%的患者需要住在ICU。观察到的差异表3差异无统计学意义(P > 0.05)。虽然x平方分布检验不能证明突变与死亡率之间的显著关系，但本系列中所有死亡患者都是推定的B.1.1.7变异的携带者。有趣的是，其中一位85岁的老人接种了疫苗，但一周前只接种了一剂ChAdOx1-S疫苗。伯纳尔等人[12]已经证明了ChAdOx1-S疫苗对70岁以上患者的疗效，但这种疫苗只有在首次注射3周后才能提供真正的保护。除本病例报告外，预计还将进行进一步的研究，以评估ChAdOx1-S对死亡率的影响。

在我们的研究中，我们还报告了两例住院患者(60.5岁和82.3岁)，尽管接种了两剂疫苗，但对B.1.1.7变异引起的中度COVID-19没有疫苗保护。在这些患者中发现的突变也为H69/V70和N501Y。我们目前的方法可以识别假定的B.1.1.7, B.1.351和P.1变体。随着COVID-19流行病学的演变，继续认为我们的方法没有检测到突变就意味着不存在野生病毒的结论变得非常危险。事实上，在过去几周，比利时出现了印度变种(B.1.617)， Novaplex™sars - cov -2变种I试剂盒无法检测到。这些变体是L452R突变的携带者，我们打算在第三行中常规使用的变体ii版本可以突出显示。

结论

对SARS-CoV-2变异的常规系统监测可以在当地反映流行病学及其演变。虽然RT-qPCR对突变的搜索远不如测序准确，但它可以在所有医院的范围内进行，并有可能针对最常见的VOCs。此外，制造商正在努力开发新产品来检测新出现的变种。在我们的系列中，住院率非常高，这可能反映了进入急诊室的COVID-19患者与正在咨询家庭医生的患者之间的偏见。总死亡率为6.4%，其中包括一名接受了疫苗剂量的患者。在纳入的患者中，有两人接种了两剂ChAdOx1-S疫苗，但仍感染了COVID-19，症状严重到足以住院。据我们所知，这是首次在接受了这两剂疫苗的患者中发现B.1.1.7变种的中度COVID-19感染。

参考文献

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