大豆内生真菌的种群变异与多样性

摘要

本文对大豆内生真菌定植种群的变异进行了研究。对大豆(C.V. JS-335)不同生育期(营养期和生殖期)的内生种群进行了研究。从营养生长期(v1 ~ v5)分离得到182株(28.88%)，从生殖生长期分离得到448株(71.11%)。随着植物的生长，内生种群逐渐增加，但在生殖阶段的开始，即R1-R8，内生种群开始减少，并在R8阶段达到稳定值。在植株成熟的V5期(25.00%)和R3期(37.03%)内生植定植量最大。内生真菌分离株属于07属;链孢菌，曲霉菌，枝孢菌，炭疽菌，镰刀菌，青霉菌和根枯菌。我们的研究为了解内生微生物在其独特的生态栖息地提供了有价值的见解。

关键字

大豆内生真菌种群方差(Glycine max (L) Merril)

简介

植物与微生物的相互作用一直是研究的首要领域。这些相互作用可能有益，也可能有害。微生物内生菌通常被定义为植物相关微生物，它们在植物活体内部组织中定植，不会引起任何明显的症状或立即的过度负作用，可以从表面消毒的植物组织中分离出来[1,2]。几乎所有植物都是内生微生物的寄主，而内生微生物通常是真菌、细菌和放线菌[3]。这些微生物既包括对寄主植物没有直接影响的共生物种，也包括互惠共生体[4]。因此，内生定殖提高了寄主的生态适应性。因此，内生菌可被视为宿主的真正伴侣。

内生菌与寄主植物之间的密切联系可以在不伤害植物的情况下形成，已被证明可以改善和促进寄主植物的生长，并减轻植物病原体和/或各种环境胁迫引起的疾病症状[5]。内生植物已被证明对寄主植物的健康有益，包括对草食、热、盐、疾病和干旱的耐受性，并增加地下和地上生物量。因此，内生定殖提高了寄主的生态适应性。独特的生态位使内生细菌成为农业应用中具有吸引力和潜在前景的工具，特别是那些具有促进植物生长和激活植物防御机制[2]等商业特征的细菌。几种细菌内生菌已被报道为可能改善和促进植物健康的潜在生物防治剂[6]。

各种报道表明，内生植物存在于许多植物物种的各种组织类型中，这表明在大多数植物[7]中普遍存在。内生种群可能来源于常见的土壤群落，在不同的植物群落[8]中有很大的多样性。这项研究

内生微生物种群的结构、分布、相互作用及在宿主体内的功能对了解其生态作用具有重要意义。

微生物群落结构的分析具有重要的现实意义;结果可用于评估释放菌株的命运及其对常驻微生物群落的影响[10]。因此，本研究对定殖大豆内生细菌种群的分布和多样性进行了研究。

材料与方法

大豆原生内生微生物的分离

研究区域

瓦希姆(北纬20º05 ' 58.90 "，东经7º08'1.82 "，海拔60米)位于印度马哈拉施特拉邦的Vidarbha地区中部。该地区气候炎热潮湿半干旱，土壤类型为深粘土至浅黑土(图1)．

样品收集

从Washim地区的6个不同地点，即Washim、Mangrulpir、Manora、Karanja、Risod和Malegaon，筛选健康大豆植株。在每个地点，从3个不同的子地点随机收集样本。在每个亚位置随机选择3-5株健康植物。大豆的生长阶段按照McWilliams[8]的规定进行鉴定，收集各生长阶段的代表样品，即营养(V1-V5)和生殖(R1-R8)。这些植物被连根拔起，密封在塑料袋里，贴上标签。所有样品采集后立即进行处理。

表面消毒

收集到的植物在自来水下清洗去除土壤，并进一步分离成植物部分，即根、茎和叶。所有根、茎和叶样品在蒸馏水中洗涤两次，然后表面消毒[2,3]。在70% (v/v)乙醇中浸泡1分钟，在0.1% HgCl2中对根和结节浸泡3分钟，而对叶和茎分别浸泡5分钟。然后用无菌蒸馏水清洗组织十次。

表面灭菌后的无菌性检查分别通过监测切片印痕和冲洗冲洗水在选择性培养基上是否存在微生物生长，即，细菌在30℃下在营养琼脂上生长6天，放线菌在30℃下在甘油酵母提取物琼脂上生长6天，真菌在30℃下在土豆葡萄糖琼脂上生长7天[2,3]。无生长被认为是表面灭菌的阳性试验。

内生真菌的鉴定

表面消毒后，用无菌刀片和镊子将样品切成5-7 mm的薄片，无菌转移到含有添加链霉素(100 mg/mL)[3]的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养板上。每板镀4片表面灭菌的植物材料(根、茎、叶)，实验重复3次。为了监测生长缓慢和产孢量低的真菌的生长，一半的培养皿在25±2°C下培养，另一半在37°C[3]下培养。在长达30天的时间里，每天对这些板进行监测，以观察从片段切割端生长的真菌。真菌分离株在常规培养和形态学特征的基础上进行鉴定，并与现有标准文献[11,12,13,14,15,16]进行比较，进一步纯化并在PDA上4°C保存。百分比定殖频率计算为真菌定殖的片段数量与总片段数量的关系[3,18]。对分离得到的所有内生真菌菌株均进行致病性试验，忽略病原菌[17]。

结果与讨论

内生真菌种群的变异

最初，内生真菌的数量随着植物的生长而增加(表1)．然而，在生殖阶段开始时，即R1-R8，内生种群开始减少。因此，随着植物衰老，观察到内生种群的下降。

在V5营养期(54)分离到的内生真菌最多，定植率(CR)为25%，其次是V4期(49/CR= 22.68%);在R3繁殖期(80/CR= 37.03%)，其次是R4期(73/CR= 33.79%)。在营养生长期V1、V2和V3分别获得16株(CR= 7.40%)、26株(CR= 12.03%)和37株(CR= 17.12%)，而在生殖生长期R1、R2、R5、R6、R7和R8分别获得60株(CR= 27.77%)、68株(CR= 31.48%)、66株(CR= 30.55%)、48株(CR= 22.22%)、33株(CR= 15.27%)和20株(CR= 9.25%)。

据报道，本地和引进内生植物的种群存在显著差异。这些变化归因于植物来源、植物年龄、组织类型、取样时间和环境[19]。土壤类型在很大程度上决定了内生植物种群[20]。取样地点、组织特异性、组织年龄或相关植被等因素均可影响内生植物群落组成[21]。

其中，地理差异被认为是最重要的之一。从同一种植物中分离出来的分类群往往根据每个个体的位置而有所不同。寄主植物的年龄和卫生状况也会对内生植物群落的组成产生一定的影响。内生种群受寄主发育阶段、环境条件和实验地点地理位置等不同因素的影响。此外，植物的基因型或品种对内生群体[6]也有显著影响。

我们的发现与以前的报告一致。包括大豆在内的农艺植物内生细菌的数量在0 ~ 6.0 log10 CFU/样品组织之间变化。内生细菌的数量受植物生长阶段的影响。在生殖成熟期(R1-R3)，与其他生长阶段[19]相比，种群数量最大。研究发现，大豆生长阶段和[6]取样组织类型对细菌种群密度有显著影响。

本研究还与Prakamhang[22]内生细菌在栽培水稻根系中密度最大的报道有关。一般来说，根中的细菌数量较多，茎和叶[19]的细菌数量较少。而在圣凯瑟琳[23]范围内，不同产地的香僵菌放线菌平均数量差异不显著。不论水稻生育期和土壤类型，大多数内生细菌都是从根系中回收的(2 X 10⁵- 3 * 10⁶CFU/g鲜重)与水稻其他部位相比。茎样中内生细菌种群密度为4 × 10^3.- 10⁵CFU/g鲜重，叶组织群体密度最低，为1 × 10^3.- 2.7 x 10⁴CFU/g鲜重[22]。

随着植株老化，内生种群数量呈下降趋势。内生种群从营养阶段到生殖阶段的减少可能是由于植物成熟和衰老过程中无法获得必需的营养物质[6,7]。随着植物的成熟，微生物的营养需求达到最佳，从而获得稳定的内生种群。由此可见，植物成熟度与内生种群存在一定的一致性。

植物的内生种群是高度可变的，有时是短暂的。本研究中观察到的内生真菌种群差异得到了其他观察的支持，这些观察发现内生细菌种群密度受到大豆生长阶段和组织样本[6]的影响，并指出随着植物年龄的增长，内生真菌分离株[3]的数量会减少。黄瓜根系内生放线菌种群数量初步增加，种群密度为4.56 log10 CFU g-1鲜根重[25]。

内生真菌的分离鉴定

共分离出630株内生真菌;182只(28.88%)来自营养生长阶段，448只(71.11%)来自生殖生长阶段(表2)，定殖率为22.43%。从植物部位来看，从根中分离出279个(44.28%)，从叶中分离出185个(29.36%)，从茎中分离出166个(26.34%)。结果表明，从营养期获得的分离株数量多于生殖期。以根为主要进入部位，数量最多，其次为叶和茎。

在目前的调查过程中，从总培养种群中分离出20个不同的真菌分离物(表3)，在大豆不同生育期均有频繁和普遍的记录。分离株分别来自07属，即;链孢菌，曲霉，支孢菌，炭疽菌，镰刀菌，青霉菌而且丝核菌。在20个分离株中，链格孢属(04),曲霉属真菌(03),枝孢属(02)刺盘孢属(02)镰刀菌素(04),青霉菌(03)和丝核菌(03)。这些分离株被选择并保存用于进一步研究。

镰刀菌素(20%)和链格孢属(20%)以大豆内生真菌为主。然而,曲霉属真菌,青霉菌,而且丝核菌分布适中，优势度为15%。然而,枝孢属而且刺盘孢属不太频繁，平均10%。

内生真菌在不同寄主中的多样性已被探讨。我们关于内生真菌多样性的发现与不同的研究相关。与葡萄品种相关的真菌的多样性(葡萄在加那利群岛(西班牙)和亚速尔群岛(葡萄牙)种植的Hortaea werneckii(Horta) Nishimura和Miyaji, Alternaria alternata (Fr.) Keissl.，答:tenuissima(需要雇)威尔特郡,曲霉菌．，Pestalotiopsis spp．，Botryosphaeria parvaPennycook & Samuels，黄芩A.J.L.菲利普斯，球状毛囊，内生赤霉素而且青霉菌属而且青霉菌spp[21]。

葡萄内生真菌群落(labrusca cv。尼亚加拉罗萨达)从巴西SP的Salesopolis收集的叶子包括Aporospora terrricola，普鲁兰软梗菌、白叶枯病菌、炭疽炭疽菌、红孢霉、黑叶枯霉、菜叶枯霉、黑壁枯霉，黄黄酮类，谷草镰刀菌，糖醋F.，芒果桂树，隐杆线虫，针叶线虫，白毛原毛菌，毛条虫，白侧耳菇，非洲普密松，毛条菌,Xylaria berteri[26]。

Abdel-Mottal等人(2010)分离出44株。药用植物内生真菌muoscyamus L包括互隔链孢霉、烟曲霉、夏威夷Drechslera、枯萎菌、柑橘青霉、二重新链孢霉、肉豆蔻甲状基质菌而且Ulocladium chartarum以及6株非致病性真菌，即交替链孢菌，支孢支孢菌，小枝支孢支孢菌，弯曲菌，紫紫青霉而且Ulocladium chartarum[27]。

从田菁(Sesbania grandflora, L.)叶和茎中分离得到28株内生真菌。Pers被隔离。其中茎分离出24株，叶[28]分离出4株。从玉米根中分离出的内生丝状真菌属镰刀菌素sp．而且顶孢菌属，光松属，拟青霉属，Phaeoacremonium属。而且支孢子虫属球孢海狸草属、窄叶海狸草属、互炼海狸草属。和T.[29]。

从台湾22种药用植物[30]中分离得到内生真菌。156株内生真菌中，樟科15科21属67株，芸香科16科27属89株。最丰富的属是炭疽菌，桂枝菌，低氧菌，黑孢菌，褐孢菌而且木虱，尤指炭疽菌属．14株分离株Phomopsis spp．有15个分离株。此外，种毛囊，交链菌，茎菌，粪菌而且Cyanodermella樟科中存在Podospora、leptosperia和Pilidiella。

结论

从目前的研究来看，随着大豆发展的进展;内生种群增加。成熟期种群密度较高，此后种群数量呈下降趋势。因此，大豆内生种群受植株发育阶段的影响。此外，内生真菌的研究为发现具有生物技术效用的新菌株提供了创新和活跃的机会。

确认

作者感谢新德里大学教育资助委员会根据XIth计划在重大研究项目计划下提供财政援助。

参考文献

1. 内生植物-一个术语的演变，以及对其使用和定义的澄清。Oikos;1995, 73(2): 274 - 276。
2. 洪培青，李志强，李志强，等。大豆内生细菌的分离与鉴定。Omonrice。2004;12:92 - 101。
3. Pimentel IC, Glienke-Blanco C, Gabardo J, Stuart RM和Azevedo JL。大豆内生真菌的鉴定与定殖Merril)在不同环境条件下。巴西生物工程学报。2006;49(5):705-711。
4. Procopio REL, Araujo WL, Maccheroni WJr。Azevedo JL。桉树内生细菌群落的特征。Genet Mol Res. 2009;8:1408-1422。
5. Hasegawa S, Meguro A, Shimizu M, Nishimura T.和Kunoh .内生放线菌及其与寄主植物的相互作用。Actinomycetologica。2006;20(2): 72 - 81。
6. Kuklinsky-Sobral J, Araujo WL, Mendes R, Geraldi IO, Pizzirani-Kleiner AA, Azevedo JL。大豆相关细菌的分离、鉴定及其促进植物生长的潜力。环境微生物，2004;6:1244-1251。
7. McInroy JA, Kloepper JW棉花和甜玉米原生细菌内生菌的调查。植物学报。1995;173:337-342。
8. McWilliams DA, Berglund DR, Endres GJ。大豆，生长和管理(A-1174)， NDSU推广服务。北达科他州立大学法戈分校，北达科他州58105;2004.可用:http://www.ag.ndsu.nodak.edu。
9. e-ISSN: 2320 - 0189
10. p-ISSN: 2347 - 2308
11. RRJBS |第三卷|第四期| 2014年10月至12月
12. 李志强，李志强，李志强，等。马铃薯内生细菌群落对Erwinia carotovora亚种感染的响应。Atroseptica。应用环境微生物学。2002;68:2261-2268。
13. 霍曼，Rodríguez-Kábana R，克洛珀JW。线虫与内生细菌的相互作用，见:A. Ogoshi K, Kobayashi Y, Homma F, Kodama N, Kondo, Akino S.(编)，植物生长促进根瘤菌-现状与未来展望。Nakanishi印刷，札幌。pp.243 - 245;1997.
14. 强奸犯KB和芬内尔DI。曲霉菌属巴尔的摩的威廉姆斯威尔金斯公司;1965.
15. 萨勃拉曼尼亚的履历。菌丝，ICAR出版，新德里;1971.
16. Barron GL. The Genera of Hyphomycetes from soil, Rebert, E. Kriengner publishing;1972.
17. 艾利斯，黄藻亚菌类，CAB国际。英联邦真菌学研究所出版，英国萨里郡邱园;1993.
18. Barnett HL和Hunter B.不完美真菌的图解属，IV版。由明尼苏达州圣保罗APS出版社出版;1998.
19. 吉尔曼JC。土壤真菌手册，印度第二版，生物技术书籍德里;2001.
20. Mahesha B.大豆多重抗病的研究，论文提交给农业科学大学，达尔瓦德，农业科学大学农业学院植物病理学系，植物病理学家庭科学硕士学位，达尔瓦德- 580005;2006.
21. Gehlot P, Bohra NK和Purohit DK。印度沙漠的重要石乔木种——银杏内树皮内生菌群。美欧学报，2008;1(1):01-04。
22. Zinniel DK, Lambrecht NB, Harris ZF, Kuczmarski D, Higley P, Ishimaru CA, Arunakumari A, Barletta RG和Vidaver AK。农艺作物和草原植物内生定殖细菌的分离与鉴定。应用环境微生物学。2002;68:2198-2208
23. 康涅狄格州VM。和佛朗哥CMM。微生物接种剂对小麦根系原生放线菌内生菌数量的影响(末端限制性片段长度多态性)环境科学与工程学报，2004;29(4):344 - 344。
24. Garoe N, Cabrera R, Lisbel RBR, Evelyn DS, Cristina G, Andreea C和Nelida B.在加那利群岛和亚述尔群岛分离到的葡萄内生真菌作为潜在的灰葡萄孢生物控制剂:Fr。林业生物技术。2012;16(1):1- 6。
25. Prakamhang J, Minamisawa K, Teamtaisong K, Boonkerd N, Teaumroong N.栽培水稻内生重氮细菌群落中国环境科学，2009;23.El-Shatoury S.， Omnia EK, Waleed EK, Ahmed D.芳香achillea fragrantissima(菊科)放线菌的抑菌活性。埃及自然毒素杂志，2009;6(2):1-15。
26. Hardoim PR, van Overbeek LS, van Elsas JD。细菌内生菌的性质及其在植物生长中的作用。微生物学杂志，2008;16:463-471。
27. El-Tarabily KA, Nassar AH, Hardy GE和Sivasithamparam K.内生放线菌对黄瓜病原菌piium aphanidermatum的促生长和生物防治。应用微生物学杂志，2009;
28. Brum MCP, Araujo WL, Maki CS和Azevedo JL。labrusca L. (Niagara Rosada)内生真菌及其对尖孢镰刀菌的生物防治潜力。生物化学学报，2012;11(4):4187-4197。
29. Abdel-Motaal FF, Nassar MSM, El-Zayat SA, El-Sayed M. A.和Ito S.埃及仙子内生真菌抗真菌活性的研究。中国机械工程学报，2010;42(4):2883-2894。
30. Powthong P, Bajaree J, Acharawan T, Pattra S.田菁内生真菌提取物抑菌活性评价珀耳斯。国际医药生物医学杂志，2012;3(2)，132-136。
31. Orole OO和Adejumo TO。真菌内生菌对四种玉米枯萎病病原菌的活性研究。中国微生物学杂志，2009;3(12):969-973。
32. 何敏，钟伟，黄华，钟伟，钟伟。具有抗菌性能的樟科和芸香科植物内生真菌的鉴定。57 Taiwania。2012;(3):229 - 241。