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P - ISSN: 2347 - 2286
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1乔莫肯雅塔大学农业和科技,生物科学学院的邮政信箱62000 - 00200年内罗毕,肯尼亚
收到日期:06/05/2015接受日期:02/16/2016发表日期:02/26/2016
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香蕉是世界第三最重要的淀粉类食物和在发展中国家广泛种植需要大量氮化肥商业种植成本和过度使用时对环境有害。促进植物生长rhizobacteria是细菌在根际与根和可以提高植物的生长。我们孤立和确定相关的rhizobacteria香蕉(穆萨spp。)从根际土壤样本收集七Juja香蕉农场,肯尼亚和评估潜在的生物肥料。我们获得20 19有可能固氮细菌分离和从乙炔还原试验观察,而18磷酸盐溶液化活动。系统发育分析集群分离成三个门由六种不同的属:假单胞菌,芽孢杆菌,Staphylobacterium, Chryseobacterium、链霉菌属和Paenibacillus spp。这项工作表明,香蕉根际细菌隔离港植物生长促进特征,可以利用生物肥料在农业推广的增长以及生产香蕉。
Rhizobacteria;根际;生物肥料;穆萨spp。
根际土壤薄层,立即围绕着植物根系(1),有丰富的营养元素,因为连续的腐烂植物的活动。该区域与固体颗粒混合和自由生活的一个活跃的社区有益的细菌2),通常被称为plant-growth-promoting rhizobacteria (PGPR)。
香蕉植物(穆萨spp。)不定和水平根增殖表层土,不能得到更深层次的土壤剖面水分和养分与其他水果作物。未开发的根系统能够抑制基本矿物养分的利用率从而限制了大规模生产不良热带土壤条件下的香蕉。在最近的过去一直对土壤微生物由于其重要性日益增加的兴趣在维持土壤肥力,因为它已被证明,植物生长可能刺激vitamin-related和病原体压制激素由根际细菌(3]。相互关联的细菌获得养分释放植物的根的增长,因为他们把根际分泌代谢物(4),增加植物的生长被rhizobacteria直接作为生物肥料对寄主植物提供营养或间接的积极影响根的生长和形态(2]。
以前,Ngamau等人,丽娜等人已经证明了多样化的香蕉内生细菌与潜在限制利用的氮和磷的营养物质在香蕉植物生长5,6]。我们假定热带香蕉根际港是一个广泛的多样性的PGPR不仅帮助有益的共生关系,可能通过抑制致病菌刺激植物生长。由于生物肥料广泛接受作为肥料的来源与显著增加作物产量(7),我们将在此描述的PGPR香蕉根和确定潜在的使用作为生物肥料在香蕉的生长。
样本收集、隔离和剖析
从根际土壤样本地区收集在2012年6月从烹饪和成熟的品种穆萨从七种虫害Juja农场,肯尼亚。他们收集的挖掘香蕉植物根系周围的20 - 40厘米,擦洗的土壤根基。根际土壤根,被擦洗系列稀释5倍接种过的对媒体的物品、酵母提取甘露醇琼脂和营养琼脂(HIMEDIA) 24小时30ºC。个别殖民地无菌挑选和条纹在无菌新媒体净化他们,产生纯文化形态,生化和分子特性。纯文化克分类和测试:硫化氢生产过氧化氢酶利用率、脲酶生产、硝酸盐还原、IMViC测试、淀粉、酪蛋白、明胶水解使用标准方法如卡布奇诺和谢尔曼(2002)所述8]。
表征rhizobacteria植物生长促进特征
隔离是评估基于能力的固氮酶活性降低乙炔(C2H2乙烯(C)2H4)由乙炔还原试验72小时30ºC的隔离5毫升氮在10毫升瓶免费的半固体琼脂。乙炔添加12% v / v浓度和决心在岛津制作所产生的乙烯气相色谱仪(GC-9A、日本)后12小时9]。使用一个注射器,1毫升的乙烯生产注入了GC机器,每个孤立的保留时间测量。
隔离是评估基于能力的固氮酶活性降低乙炔(C2H2乙烯(C)2H4)由乙炔还原试验72小时30ºC的隔离5毫升氮在10毫升瓶免费的半固体琼脂。乙炔添加12% v / v浓度和决心在岛津制作所产生的乙烯气相色谱仪(GC-9A、日本)后12小时9]。使用一个注射器,1毫升的乙烯生产注入了GC机器,每个孤立的保留时间测量。
基因组DNA提取和16 s rrna的放大
16 s rRNA基因的细菌隔离放大了使用通用引物聚合酶链反应27 f 5“-GAGTTTGMTCCTGGCTCA-3”和1492 r, 5“-TACGGYTACCTTACGACT-3”(美国Bioneer)被Embley和Stackebrandt (1994) (12使用一个股份公司,22331型热循环(德国汉堡)。
PCR Taq 0.2个单位组成的混合物,20 pmol 27 F底漆,20 pmol 1492 r反向引物,1.25毫米混合核苷酸(试剂盒),10 x PCR缓冲(试剂盒),1毫升的模板DNA和29.8毫升的PCR水。热项目初始变性在94°C 5分钟,变性在94°C 30年代,引物退火在43°C 2分钟,在72°C链扩展1.5分钟35周期,紧随其后的是最后在72°C扩展5分钟。基因的扩增子被纯化喷气净化设备(热费希尔科学Inc .)和受到DNA测序根据生产的协议(Macrogen、韩国)使用27 F (5“-GAGTTTGMTCCTGGCTCA-3”)和1492 r (5‘-TACGGYTACCTTACGACT-3)引物。
序列加工使用浓度均Pro软件(www.technelysium.com.au)和对齐使用CLUSTALω程序(http://www.clustal.orgused)。他们用于爆炸对序列搜索主持美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库,以确定他们的亲密邻居使用(BLASTn算法,http://www.ncbi.nih。政府所描述的Altschul et al。13]。系统发育树构建使用neighbor-joining方法(14)通过使用大型V5.10包(www.megasoftware.net)在进化距离计算使用可能性最大的综合方法(15]。获得统计值分支的支持,引导与1000年进行复制和所有网站,包括空白序列比对,被成对地在系统发育分析(16]。16 s rRNA基因的部分序列存入基因库和加入数字KP797914 KP797931序列数据库。使用朴素贝叶斯的分类任务是确认rRNA RDP网站上的分类器在95%的置信水平17]。
评估经济增长的增强对组织培养的影响香蕉植株
基于植物生长促进特征筛选之前,即五株Chryseobacterium spp。芽孢杆菌megaterium,芽孢杆菌强直,假单胞菌monteilii和链霉菌属种虫害的评估控制温室条件下植物生长增强。细菌培养准备如前所述,米娅等人被感染香蕉组织培养植株通过浸渍3月大的植株进入特定细菌隔离治疗48小时室温蒸馏水在用于控制实验。植株的生长在无菌营养惰性Cocopeat媒体(Amiran、肯尼亚)补充氮、磷和钾(氮磷钾)缓释肥料在5级(0 gms 2.5 gms 5 gms, 7.5 gms和10 gms)在三个复制(随机区组设计18]。
农艺植株的特点:高度、直径和数量的绿色和干树叶评估每隔14天为3个月(19)之后,植物被轻轻连根拔起,狼狈地采样清洗掉下的媒体运行自来水和测量鲜重。植株干重被烘干后在80ºC 14天基本营养水平的氮、磷、钾、钙、铁和镁是根据评估板(20.]。
统计分析
性状数据,意味着±SD从三个实验复制收集进行分析。差异性状参数中细菌治疗由方差分析测试过程使用SPSS软件(方差分析)。学生学习任务是用来评估每个治疗之间的变化对控制实验(沃波尔1986)。被认为是显著的概率5% (P≤0.05)。
隔离对香蕉根际的分离和分析
隔离和培养后,20纯分离获得67份土壤样本根据菌落形态和生化特征揭示相关细菌的多样性。固氮酶活性被认为在19隔离,18(90%)可溶性磷酸盐虽然菌株产生的生长素吲哚乙酸激素。过氧化氢酶活性在所有的隔离(表1)。
表1。形态、生理生化特征的rhizobacteria Juja香蕉农场隔绝,肯尼亚。
的芽孢杆菌种虫害和假单胞菌种虫害隔离显示强烈的磷增溶活动比其他隔离。假单胞菌种虫害的磷酸盐溶解活动1.6是最高的,其次是芽孢杆菌种虫害有磷酸溶解指数1.5和1.45磷酸琼脂试验(表2)。植物生长促进rhizobacteria的增溶能力被认为是最重要的一个特征与植物磷营养有关。土壤和种子接种与磷酸盐增溶的微生物(PSM)已被用于改善作物生长和产量的增溶的固定和应用磷酸盐(21]。
所有芽孢杆菌隔离有固氮酶活性的一个芽孢杆菌种虫害显示0.7547μl /毫升的浓度最高,其次为另一个0.1515μl /毫升固定氮(来显示他们的潜力表2)。从表2,Chryseobacterium种虫害显示0.069μl /毫升的固氮酶活性和0.0145μl /毫升这可能是一个潜在的氮素固定者因为这些属的成员表现出令推广活动,他们是普遍的一些高等植物的共生体22,23]。
表2。磷酸溶液化的程度在琼脂和乙烯产生的细菌分离物的浓度。
两个葡萄球菌种虫害固氮酶和磷酸溶液化能力被确定,我们的知识还没有从香蕉根际分离。这个病例属促进植物生长几乎没有记载。氮对香蕉是一个至关重要的元素,因为这可能是一个限制因素在生产和经济增长的香蕉。Ahemad和汗表明,氮是香蕉植物所需的营养物质一般为其最佳生长和生产力1,24]。
孢子形成PaeniBacillusxylanilyticus标识显示有前途的植物生长促进固氮酶和磷酸盐溶液化的活动。一些种类的Paeni芽孢杆菌一直显示能力修复大气氮体外(25]。
虽然据报道香蕉根际的优势种之一,本研究孤立的只有一个假单胞菌monteilii固氮酶和磷酸溶液化的能力。这种细菌被认为属于生态重要的子群p . putida在殖民香蕉植物根际环境26]。只有两个链霉菌属种虫害发现尽管被显示为重要微生物存在于香蕉根的根际拮抗植物病原真菌(27]。链霉菌属菌株促进香蕉植株的生长提供铁。
细菌鉴定使用16 s rRNA的放大
细菌的系统发育关系隔离测序是推断使用邻居加入方法。十八(18)序列的20个隔离在这个研究包括两(2)被排除在后续分析自嵌合体。序列从不同属的细菌隔离集群:分为三个隔离葡萄球菌spp。两个(10%)为链霉菌属spp。,两个(10%)Chryseobacterium NW50 jejuense压力,而11(55%)归类为属于属芽孢杆菌。有100%的序列相似性,Paeni分离为特征芽孢杆菌spp。,假单胞菌monteilii应变水生生物研究所2329 B (图1)。
图1所示。邻居加入phylog enetic树显示的位置从Juja香蕉根际的隔离,肯尼亚。18株从七个不同农场Juja被孤立在这项研究中以粗体字体表示。的加入数字序列在parantheses表示。引导值是数字1000节点基于复制。的16 s rRNA基因序列Methanoculleus嗜热微生物是一个外围集团。
评估经济增长的增强对组织培养的影响香蕉植株
接种的植物有5个选择隔离了积极的增长影响香蕉组织培养植株处理5 gms, 7.5 gms和10 gms的氮磷钾施肥水平水平高度,直径,干重的绿叶和质量与各自的控制。的直接影响植株上的菌剂不能成立,因为混杂肥料水平效应。意味着工厂直径(cm)和隔离的绿叶植株处理假单胞菌monteilii链霉菌属和种虫害高于他们的控制,同样观察到在处理植株的平均直径Chryseobacteriumspp。芽孢杆菌megaterium和芽孢杆菌强直菌株10 gms肥料水平。植株处理链霉菌属种虫害隔离注册增长明显高于所有参数(p < 0.05)。所有的高度和干重显著高于5株(p = 0.000),除了进行测试假单胞菌monteilii高(p = 0.007)。直径明显高于植物处理链霉菌属spp。(p = 0.000) 10 gms肥料水平(图2)。的总累积氮、磷、镁和钙高(p = 0.00000684、0.000163、4.46分别e-09和3.77 e-05)后的治疗接种隔离。这可能归因于接种的影响在这些营养物质的吸收。然而,摄入钾、锌和铁不会受到各种因为没有观察到的治疗和控制之间的差异。植物生长促进rhizobacteria接种香蕉上大大增加了组织培养的发展和增长香蕉植株(19]。
图2。选择Juja细菌分离菌对香蕉的影响植物生长(平均直径,B:意思是高度,C:的意思是绿叶,D:意思是枯叶,E:意味着质量干重)。星号(*)意味着控制明显不同(p < 0.05)。
目前的研究表明,香蕉根际细菌隔离假单胞菌,芽孢杆菌Staphylobacterium Chryseobacterium,链霉菌属和Paeni芽孢杆菌属在Juja,肯尼亚港口植物生长促进这些隔离特性,因此可以作为生物肥料在农业推广的增长以及生产香蕉。
本研究支持的研究资助的研究,生产和推广部门(RPE)乔莫•肯雅塔大学农业和Technology-Kenya。我们愿意承认部门园艺和植物学(JKUAT)和他们的技术人员技术支持,本研究主张他们的实验室设施。
特别欣赏到圣扎迦利先生Ndung 'u (JKUAT)对他的支持在样本收集和温室实验。
