酶解法制备低分子壳聚糖及其性能评价

摘要

目的:采用酶解法制备低分子壳聚糖。材料与方法:利用纤维素酶和果胶酶将高分子量壳聚糖还原为低分子量壳聚糖。对制备的低分子量壳聚糖进行了粘度平均分子量(Ostwald粘度计)、理化参数和傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)分析。结果:纤维素酶和果胶酶联合使用能有效降解壳聚糖，制备低分子量壳聚糖，ftir -光谱分析表明，两者在结构上无显著差异，分子量无显著差异。以纤维素酶和果胶酶为原料，在5h的反应时间内酶解制备了粘度平均分子量为15kda的低分子量壳聚糖。结论:酶解降解壳聚糖等高分子材料的分子量是一种安全有效的方法。

关键字

酶解;纤维素酶;Molecularchitosan;粘度

简介

壳聚糖是由几丁质脱乙酰生产的，由β-(1-4)连接的2-氨基-2-脱氧-d -吡喃葡萄糖和2-乙酰氨基-2-脱氧-d -吡喃葡萄糖组成。壳聚糖在食品、制药、化妆品、农业和医药等领域有着广泛而独特的应用，受到了广泛的关注。壳聚糖很好地溶于稀释的酸，但其溶液，即使在低浓度(0.1%-0.3%)是不溶于水的，具有高粘度和鱼腥味涩味，这限制了它们在实践中的使用。低分子量壳聚糖(LMWC)已成为人们日益关注的课题。低分子量壳聚糖在中性水溶液中的溶解度比高分子量壳聚糖高，从而拓宽了其在抗菌、抗真菌和抗肿瘤等方面的应用[1-4］．

低分子量壳聚糖(LMWC)可以通过化学或酶解聚合壳聚糖来制备。化学方法可以通过酸性或氧化解聚来实现。酸性解聚是使用高浓度的盐酸、磷酸或硫酸进行的。酶促法基于特定的酶，如壳聚糖酶[5-7]或使用非特异性酶[8，9]包括溶菌酶、纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶和果胶酶[10-15］．

物理和化学方法的缺点

但化学降解存在一些缺陷，包括苛刻的水解条件，低收率的化学修饰葡萄糖环。壳聚糖的物理降解需要特殊的设备，所产生的分子量无法控制[16-17］．

低分子量壳聚糖的优点

•低分子量壳聚糖在中性水溶液中的溶解度高于高分子量壳聚糖。

•高分子量壳聚糖的特点是鱼腥味苦涩，这限制了它的使用。水溶性低分子量壳聚糖无苦味。

低分子量壳聚糖，平均分子量为5- 20kda，具有增强的功能生化意义。5-10 K Da对oxyporum镰刀菌、fuomopsis fukushi、Alternaria alternate [18］．

•平均分子量大于5 KDa的大鼠在喂食富含胆固醇的饮食14天后血清胆固醇升高

•低分子量壳聚糖还降低了结肠癌发生的早期肿瘤前标志物的发生率[18-23］．

•壳聚六聚物抑制小鼠Sacroma -180和Meth-A肿瘤生长[18-22］．低分子量壳聚糖被用作抗肿瘤和免疫刺激剂。

材料与方法

制备低分子量壳聚糖所用的材料有壳聚糖(HIMEDIA)乙酸(RANKEM)、纤维素酶和果胶酶礼品样品(太阳辉光制药)和氯化钠(Chemspure)。

酶解法制备低分子量壳聚糖

以1%v/ V的乙酸为原料，制得pH为3.0左右的壳聚糖(1.0%W/V)溶液。向上述溶液中加入酶，在37℃下持续搅拌3-5小时[19，20.］．水解后，在1000℃下灭活10 min，用2 M NaOH调整pH至12，使产物具有较高的聚合度(DP)。悬浮液被离心;不溶性残渣用双重蒸馏水冲洗，并冻干，得到LMWC (表1）.

表1:酶解法制备低分子量壳聚糖。

制备低分子量壳聚糖的性能评价

用奥斯特瓦尔德粘度计测定粘度平均分子量:用奥斯特瓦尔德粘度计测定粘度平均分子量。这项工作所使用的溶剂是10毫升0.5 M醋酸和20毫升0.25 M氯化钠的混合物[19］．试验分三次进行，以获得一致值。平均粘度分子量由以下公式计算。

相对粘度

相对粘度增量(或比粘度)是粘度差(或流出时间)与溶剂粘度差(或溶剂流出时间)之比。

降低粘度(或粘度值)

固有粘度

特性粘度[η]可以定义为:

通过绘制粘度与浓度的函数关系，可以通过外推聚合物溶液到零浓度来估计特性粘度。

Mark-Houwink方程:描述聚合物特性粘度与其相对分子质量(分子量)关系的方程为:

其中[η]是特性粘度，K和a是常数，其值取决于聚合物和溶剂的性质以及温度，M通常是相对分子质量平均值之一。

外观:对制备的低分子量壳聚糖的外观进行了研究。

利用密度:将制备好的低分子量壳聚糖和原料壳聚糖称量，收集，倒入10ml刻度缸中。从2.5 cm高度敲击该体系100次，然后测量填充壳聚糖和低分子量壳聚糖的体积。丝锥密度计算公式如下:

体积密度:将壳聚糖和低分子量壳聚糖放入刻度圆筒中，测定表观堆积密度，并按原样测量体积和重量。

百分比压缩指数:压缩性是粉末在压力下体积减小的能力。它是通过比较体积密度和抽头密度来确定流动特性的方法之一。表2）.

表2:百分比压缩指数。

将制备好的低分子量壳聚糖和壳聚糖称量，收集，并倒入10ml的刻度筒中。将该系统敲击100次，然后测量填充壳聚糖的体积。它是在刻度缸中填充的攻丝前体积与攻丝后体积之比。

其中V和Vo为敲击后和敲击前样品的体积。

傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)分析采用KBr盘法在4000 ~ 400 cm-1范围内对低分子量壳聚糖进行了红外光谱分析。所有光谱均在室温下记录，扫描45次，分辨率为4 cm-1 [21-23］．FTIR研究证实，与普通壳聚糖相比，所得低分子量壳聚糖在结构上没有变化。

制备低分子量壳聚糖的性能评价

壳聚糖粘度平均分子量的测定:计算了不同时间间隔的壳聚糖和制备的低分子量壳聚糖产品的粘度平均分子量，并将结果描述在表3 - 5而且图1 - 2．

表3:用粘度法评价壳聚糖平均分子量。

表4:纤维素酶和果胶酶制备低分子量壳聚糖5h的评价。

表5:LMWC制备的粘度、平均分子量综述

K=0.001424, a=0.96， η= (1115.8+716.42)/2=916

粘度平均分子量，Mv = 1123197 Da

从表5结果表明，随着纤维素酶和果胶酶联合反应时间的延长，壳聚糖的分子量显著降低。在5 h的反应时间内，原料壳聚糖的分子量从1123197 Da显著降低到15 K Da。所得的低分子量壳聚糖产品被选作进一步的评价研究。

外观:所制得的低分子量壳聚糖为灰白色、中等细的粉末。

利用密度:对壳聚糖和制备的低分子量壳聚糖进行了抽丝密度的测定，并对结果进行了描述表6．

表6:高、低分子量壳聚糖的比较

体积密度:对壳聚糖和制备的低分子量壳聚糖的容重进行了测定，并对结果进行了描述表6．

百分比压缩指数:对壳聚糖和制备的低分子量壳聚糖的压缩指数进行了测定，并对结果进行了描述表6．

的表6所示为堆积密度、抽头密度和卡尔指数的结果。从这些值可以看出低分子壳聚糖和高分子壳聚糖的密度和卡尔指数的差异。从卡尔指数结果可以看出，高分子量壳聚糖和低分子量壳聚糖的流动性能都很差。

傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)分析对制备的低分子量壳聚糖进行了红外光谱研究，并与初始壳聚糖进行了比较。这些结果表明，初始壳聚糖和低分子纤维素的主链结构是相同的。NH2氨基在3440 cm-1附近有一个特征峰，由于-OH基团的存在而被峰重叠。在2900 cm-1附近的吸收峰的出现归因于-CH2的不对称拉伸振动，低分子量碳水化合物强度的快速降低可能归因于壳聚糖水解后的降解。一个价格吗?分子量峰值在1660 cm-1左右，这表明-C =O基团更容易形成更强的氢键，聚合物链的断裂导致壳聚糖分子量下降。结果显示无显著性?酶解前后两种样品的主要结构差异不大，但主要水解产物的分子量降低(图3）.

结果

采用纤维素酶和果胶酶对壳聚糖进行酶解，在5 h的反应时间内，壳聚糖的分子量由1123197 Da显著降低至15000 Da。FTIR研究表明，除了分子量外，结构没有明显变化。对初始高分子量壳聚糖和低分子量壳聚糖的抽丝密度、容重和压缩指数等理化性质进行了研究，并对结果进行了比较。结果表明，纤维素酶和果胶酶的组合酶对分子质量的降低是有效的，而不是单个酶。

结论

酶法的分子量降低比物理和化学法的解聚更安全有效。纤维素酶和果胶酶的酶解可用于壳聚糖等聚合物的减重。

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