乳清蛋白-麦芽糊精缀合物的制备及功能表征

摘要

乳清蛋白(WP)与麦芽糖糊精(MD)通过美拉德反应，通过对乳清蛋白浓缩70和麦芽糖糊精的冻干混合物进行干热处理，在90°C和80%相对湿度下2小时。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定糖基化程度，用2,4,6-三硝基苯磺酸法测定糖基化程度。采用衰减全反射傅里叶变换红外技术对WP-MD的结构变化进行了评价光谱学．WP与MD糖基化后等电点向pH值较低的方向移动，其乳化性能优于WPC和WPC-MD混合物。当pH值在3.0-7.0范围内评估时，与WPC相比，缀合物具有更好的溶解性，特别是在蛋白质的等电点附近。结果表明，WP-MD缀合物具有较好的功能性能，可进一步作为食品级壁材用于食品体系中微纳米乳剂的制备。

关键字

乳清蛋白，麦芽糊精，美拉德反应，缀合物，功能性质

简介

蛋白质在食品工业中被广泛应用，因为它们能够添加独特的功能特性，如乳化、起泡、凝胶和溶解属性[1］．牛奶蛋白质，尤其是乳清蛋白，已被广泛用作食品中的乳化剂[2]由于它们的两栖性[3.］．它们形成坚固而有凝聚力的保护膜，有助于防止液滴聚集[4］．乳清蛋白由α-乳清蛋白、β-乳清蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白和蛋白蛋白胨(多肽)组成，含有丰富的人体必需氨基酸，具有较高的营养价值营养价值．分离乳清蛋白及浓缩乳清蛋白[5]是食品中用作乳化剂的两种乳清制剂。除了营养价值外，乳清蛋白还被研究为表面活性剂[6]和生物活性化合物的输送系统，如药品［7]和营养品[8］．另一方面，在一定条件下，由于蛋白质的聚集或沉淀，乳清蛋白的功能特性会变差。这种效应在接近蛋白质等电点的pH值时最为明显。此外，对牛奶蛋白成分的成本和功能需求的不断增加，产生了对特殊牛奶蛋白成分的需求，这些成分具有在特定食品成分中使用所需的功能特性。

麦芽糊精是淀粉水解产物，由α -(1,4)和α -(1,6)连接的d -葡萄糖聚合物和/或葡萄糖当量小于20的低聚物组成。麦芽糊精(MD)作为食品中的稳定剂(质地和膨大改性剂)广泛应用于食品工业乳剂［9］．不同葡萄糖当量的商业MDs (DE 2-20)具有不同的物理化学性质，包括溶解度和粘度。然而，具有相同葡萄糖当量的麦芽糊精也可能具有非常不同的物理化学性质，这取决于其制备过程中使用的水解程序和淀粉的来源/组成[10］．

已证实，蛋白质的功能特性可通过与多糖和较小糖的共价键进一步改善[11］．乳蛋白可通过物理、化学和/或酶处理进行修饰，以获得所需的功能特性[12］．由于各种安全问题，在食品应用中，并非所有这些方法都适合生产改性蛋白质。通过美拉德反应将蛋白质与多糖结合是蛋白质改性的最佳方法，被认为适合于食品应用[13］．

的美拉德反应是一种自发和自然发生的反应，与乙酰化、脱酰胺化、琥珀酰化和其他可用来改善蛋白质功能特性的化学方法相反。美拉德反应主要分为三个阶段;初级、中级和高级。该反应发生在初始阶段，蛋白质可用的电子氨基(主要的反应氨基是赖氨酸)与还原糖的羰基缩合，通过形成席夫碱生成阿莫多化合物[14］．中间阶段涉及到amadori化合物在广泛产品中的降解结果。反应的最后阶段形成“类黑素”[15］．干式加热方法是蛋白质-多糖结合的首选方法，因为这种方法是在最佳的水活度下进行的，与湿式加热方法相比，发生反应所需的时间更短。

在本研究中，乳清蛋白被糖基化麦芽糊精采用干热处理方法对所制备的偶联物进行SDS-PAGE、ATR-FTIR、糖基化度、颜色、乳化性能溶解度是pH值的函数。

材料与方法

材料

乳清蛋白浓缩物(WPC-70)采购自现代乳业有限公司。Karnal,哈里亚纳邦。麦芽糊精(MD)采购自孟买Hi Media Laboratories ppt . Ltd.。周期酸、希夫试剂和三硝基苯磺酸均来自Sigma Aldrich Ltd.。

糖基化乳清蛋白的制备

WPC(70)和MD分别按质量比1:1和1:2 (WPC: MD)溶解于蒸馏水中。水化8小时后，将乳清蛋白和麦芽糊精溶液混合，pH调整为7.0。然后，这些样品被冷冻干燥以除去水分，并被研磨成粉末。粉末在90°C、80% RH条件下干热处理2小时。使用含有饱和KCl溶液的预热干燥器保持80% RH。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)

SDS-PAGE按照Laemmli方法[16]使用12% w/v的溶解凝胶和5% w/v的堆积凝胶。将样品溶液(6mg蛋白/ml)与等体积含有ß-巯基乙醇的样品缓冲液混合，煮沸5min。将制备好的样品20 μl装入每孔，在制冷温度下恒压210 V、功率6 W、电流70 mA进行电泳，直至指示染料到达凝胶底部。用蛋白质(0.25%考马斯亮蓝G-250)和碳水化合物(1%周期性酸性希夫(PAS)溶液)对凝胶片进行染色[17］．

测色仪器

用装有Universal软件(version 10)的Colorflex®(Hunter lab, Reston, Virginia, USA)测量Hunter色度坐标(L* a* b*)来确定共轭物中发生的美拉德反应的程度。仪器在测量前用标准的白、黑瓷砖进行校准。将干燥的WPC或WP-MD共轭物放入培养皿中，测量L* a* b*色坐标。光源为双光束氙气闪光灯。在L* a* b*色彩空间系统中，L*值(明度/暗度)范围为0(黑色)到100(白色)，a*值(红色)范围为-60(绿色)到+60(红色)，b*值(黄色)范围为-60(蓝色)到+60(黄色)。色强(C*)按下式计算:

C * = (²+ b²)½

糖基化度

用2,4,6 -三硝基苯磺酸(TNBS)法测定未反应胺的糖基化程度[18，并作了一些修改。在测定前，将5%的TNBS溶液(Sigma- Aldrich Inc.， St. Louis, MO, USA)稀释在0.1 M碳酸氢钠水溶液中，使TNBS总浓度为0.01% w/v，制备新的TNBS工作溶液。在pH为8.5的0.1 M碳酸氢钠溶液中制备WPC和各共轭溶液200 μg/ml。将TNBS工作液与样品溶液按体积比:TNBS工作液=2:1混合。混合物在37°C的水浴中孵卵2小时，然后加入10% w/v SDS溶液和1n HCl，使混合物的体积比:SDS: HCl=6:2:1终止反应。以蒸馏水为空白，用紫外-可见分光光度计在335 nm处测定最终混合溶液的吸光度，分三次。

衰减全反射傅里叶变换红外(ATR-FTIR)光谱

样品的光谱在4 cm处使用FTIR光谱仪(IR Affinity-01, Shimadzu, Japan)与金刚石晶体细胞ATR和内置IR- solution软件测量^－1决议。光谱是用吸收来测量的。每个频谱平均超过30次扫描与4厘米^－1决议。光谱的波数范围在1400到1800厘米^－1，其中覆盖了典型的酰胺I和酰胺II峰进行分析。

电动电势

zeta电位样品用Malvern Nanoparticle Analyzer (Zetasizer软件，version 7.03)测量。分散体在蛋白浓度为5mg /mL的去离子水中制备，pH为3.0 ~ 7.0，使用0.1 N HCl和0.1 N NaOH，用0.45 μm注射器膜过滤后进行分析。报告每个样品三次测量的平均值。等电点确定(值等于零zeta电位)。

乳化性能

结合物的乳化性质用[19作了一些修改。将共轭物(0.7% w/v蛋白质)溶解在90 ml 0.06 M磷酸盐缓冲液中，pH 7.0，含有0.01% (w/v)叠氮化钠(水相)，在室温下，在中等磁搅拌条件下搅拌1小时。将水相与60 ml油相(大豆油)混合，并用Omni GLH在15,000 rpm的速度下均质1分钟，制备乳液。在刻度管中以2600 g离心5 min，测量体系的总体积(WV)和乳液相体积(EPV)。乳化活性表示为:

对于乳液稳定性(ES)，乳剂在80°C下保持30分钟，然后在冰浴中保持15分钟，最后在1300 g下离心5分钟。乳液稳定性计算为:

蛋白质溶解度

根据Mohanty等人的方法，测定了WPC、WPC- md混合物和乳清蛋白-麦芽糊精缀合物的溶解度随pH值的变化。[20.］．将200mg样品精确称量，并将(1% w/v蛋白质)分散到250ml玻璃烧杯中20ml蒸馏水中。然后根据需要使用0.1 N HCl或0.1 N NaOH将分散液的pH值调整在3.0-7.0范围内(单位间隔为0.5)。对分散液进行适度磁搅拌1小时。在适度磁搅拌30分钟后，重新检查每个样品的pH值，并在必要时重新调整。取14 ml分散液于15 ml离心管中，1000g离心20 min。离心后，滗出上清液，用Whatman No. 1滤纸过滤。用Bradford法分别用过滤上清液和初始分散液测定可溶性蛋白含量和总蛋白含量[21］．

统计分析

所有统计分析均采用MS-EXCEL-2010软件包和GraphPad Prism 5.0进行。结果以三次重复的均数±标准误差(SE)表示，采用方差分析(ANOVA)检验显著性。

结果与讨论

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

乳清蛋白的糖基化被SDS-PAGE证实为多糖图1．如前所述，SDS-PAGE被用作蛋白质-多糖缀合物的表征工具[22-24］．用考马斯亮蓝染色法鉴定蛋白质成分(图1a及1C)并进行周期性酸染色鉴定多糖成分(图1 b)．原生WPC、WPC- md(1:1和1:2)(未经热处理)混合料(MW约为14.0、18.0和70.0 kDa)主要表现为α-乳清蛋白、β乳球蛋白和牛血清白蛋白。WP经麦芽糖糊精糖化后(WP- md、1:1和1:2缀合物)，α-乳清蛋白和β-乳球蛋白对应的原生条带消失，在比β-乳球蛋白高的MW范围内出现涂抹带，牛血清白蛋白对应的条带也移到更高的MW范围内。结合2小时后，α-乳清蛋白对应的条带完全消失，这表明α-乳清蛋白比之前报道的其他乳清蛋白更容易与MD结合[25］．目前的发现是为了纪念Liu和Zhong [23，24］．同样，戈登等人。[26]报道，酪蛋白酸钠与麦芽糖糊精的结合被证实为没有明显的条带，并在更大的MW范围内形成弥散条带，尽管物质的体积在25,000-37,000 g范围内，考虑到单个酪蛋白中赖氨酸的不同摩尔质量和数量，这在分子量的预期范围内。高MW材料的存在表明一些聚合或者发生了交联。这些结果与Shepherd等人的结果非常相似。[13]表明共轭和交联已经发生，导致“未修饰”材料的完全损失和更高分子量材料的形成。

O 'Regan和Mulvihill M [27]也表明，这种结合导致了特有的天然酪蛋白带的消失，天然带明显转向了大范围的高分子量偶联蛋白。NaCN-MD100粗偶联物的部分蛋白染色物质也残留在堆积分离凝胶的界面上，说明存在过大分子量无法穿透分离凝胶的高分子量产物。纯化偶联物对蛋白质染色电泳模式影响不大。但纯化后的共轭物中不存在无法穿透分离凝胶的大分子量MW物质，说明纯化去除的物质主要由高分子量美拉德反应产物组成。

颜色

颜色测量是在蛋白质和多糖结合过程中发生的高级美拉德反应(棕色)程度的一个指标。在本研究中，测量了培养WPC、WPC- md混合物及其共轭物干粉的颜色坐标(L* a* b*)，并计算了它们的颜色强度(C*)。本文给出了培养WPC、WPC- md混合物及其共轭物的色强结果表1WP-MD共轭物的色测与目测基本一致。Hunter色度坐标(L* a* b*值)表明，WP-MD偶联后a*、b*值增加，L*值降低，而L*值表示美拉德反应中的黄色。Wang和Zhong [28奥里根和马尔维希尔[29］．由于缀合物是通过美拉德反应形成的，因此缀合物的颜色对于这些成分的潜在应用非常重要。奥里根和马尔维希尔[29]的研究结果表明，与NaCN和MD100相比，MD100与NaCN的偶联会导致a*和b*值增加，而L*值下降。与NaCN-MD100粗偶联物相比，纯化后偶联物的a*和b*值均有所降低，L*值略有下降，这表明纯化后偶联产物的颜色有所改善，这可能是由于纯化后偶联产物去除了一些不被离子交换树脂吸附而形成的美拉德产物。

表1。乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物-麦芽糊精混合物和乳清蛋白-麦芽糊精共轭物的颜色坐标和颜色强度。

糖基化度

以游离胺与2,4,6 -三硝基苯磺酸(TNBS)反应为基础，测定了糖基化程度。在335 nm处较高的吸光度值表明有更多的游离胺未与多糖反应，因此糖基化程度较低。如图2与对照(WPC)和WPC- md混合物(热处理前)相比，共轭物的吸光度值显著降低(p≤0.05)，因此糖基化程度更高。所得结果纪念了Wang和Zhong的发现[28］．他们发现，pH为6.0时糖基化程度最高，糖基化程度越高，热稳定性越好，这是由于MD分子附着在蛋白质分子上，其空间位阻特性更强，从而防止了加热过程中蛋白质的聚集[23，24］．在弱酸性pH值[30.］．

衰减全反射傅里叶变换红外光谱

乳清蛋白的偶联导致二级结构含量的改变[23，24］．波数3480−3440、3260−3270、2960−2878和1350−1300 cm的特征吸收带⁻¹分别被分配到- OH， - NH， - CH和C - N拉伸的振动[31］．峰顶位于1641厘米左右⁻¹1532厘米⁻¹，分别属于酰胺I和酰胺II，是蛋白质的特征[32］．据报道，酰胺I的吸收带在1639 cm处⁻¹表示C=O基团的谱重叠，加上面内−NH弯曲和C=N连接[33］．WPC、WPCMD混合物及其共轭物的FTIR光谱。吸收带在1520厘米处⁻¹归因于一个质子化胺基团[34］．WPC的主要吸收波段在1639 cm⁻¹(酰胺I)和1529厘米⁻¹(酰胺II)移至1631厘米⁻¹1539厘米⁻¹WP-MD 1:2共轭(图3)到1633厘米⁻¹1533厘米⁻¹为WP-MD 1:1共轭(图3 b)分别与MD糖基化后，表明氨基的消耗和由于美拉德反应形成席夫碱。在1639厘米处吸收带减少⁻¹并在1529 cm处增加⁻¹表示在美拉德反应中，伯胺基向仲胺基的转变。

电动电势

WPC, WPC- md混合物和WP-MD共轭物的zeta势的大小显示在图4．结果表明，乳清蛋白经麦芽糖糊精糖化后，ζ电位值减小，等电点向较低的pH值偏移。WPC、WPCMD(1:1)混合物、WPC- md(1:1)共轭物、WPC- md(1:2)混合物和WPC- md(1:2)共轭物的等电点(pH值对应于零ζ电位)分别为5.05、4.95、4.05、4.95和4.01。糖基化后等电点向较低值的偏移已在前面显示[23，24，35］．乳清蛋白的糖基化改变了蛋白表面电荷的分布，导致等电点的降低。等电点的降低可能是由于MD糖基化后蛋白表面碱性赖氨酸含量的降低，这是由pH低于等电点时糖基化乳清蛋白的ζ电位比WPC低的幅度所支持的。缀合物的最低等电点表明蛋白质结构的显著变化与最高糖基化程度相一致[28如3.3节所述。

乳化性能

本研究通过30% (v/v)油掺入水乳化剂的配方研究了乳化剂的乳化性能。从乳化活性和乳化稳定性两个方面对其乳化性能进行了评价。据推测，通过多糖糖基化对蛋白质进行化学修饰可以改善乳化性能，特别是在低pH值时，因为等电点和溶解度将被改变，分子完整性将保持[36］．谢博德等人[13]的研究表明，酪蛋白酸钠可以通过Amadori重排与1,4链接多糖(例如麦芽糊精)化学结合[37]而没有过度的后amadori - Maillard反应，以形成具有提高乳化活性和低pH稳定性的新型乳化剂。

乳化活性

它是从图5一个WP-MD结合物的乳化活性显著(p≤0.05)高于对照(WPC)和WPC- md混合物(未经热处理)。质量比为1:2时，WP-MD的共轭物乳化活性最高(89.67%)。这可能是由于WP-MD在1:2 (w/w)的比例下具有最佳的空间稳定性。阿赫塔尔和狄金森[38]表明乳清蛋白与MD在1:2 (w/w)的比例下高度相容，形成具有优异乳化性能的共轭物。蛋白质-多糖1:2的比例比1:1的比例具有更高的乳化活性，这是为了纪念Xie和Hettiarachchy的发现[39］．虽然一些未反应蛋白以1:1比例偶联的存在可能略微有利于其乳化能力，但较高的多糖浓度提供了更好的空间位稳性，从而提高了乳化活性。Mishra等人[40]研究表明，与单独使用UF WPC相比，UF WPC-果胶复合物具有更高的乳化活性。与WPI和阿拉伯胶(一种含有天然糖蛋白的乳化剂)相比，用WPI-葡聚糖缀合物制备的乳化能力和乳化稳定性也有所提高[22］．

乳状液的稳定性

在乳化活性方面，WP-MD共轭物的乳化稳定性也显著(p≤0.05)高于WPC和WPC- md混合物。如图5 b在质量比为1:2时，WP-MD的共轭物具有最高的乳液稳定性(86.83%)。在同时含有蛋白质和多糖的乳液体系中，蛋白质在油水界面形成一个吸附的相干粘弹性层，而多糖通过其在水相中的增稠和凝胶行为赋予稳定性[41］．与WPC稳定乳状液相比，共轭稳定乳状液的稳定性有所提高，这是因为共轭蛋白分子在液滴表面形成了比非共轭蛋白更大的聚合层，MD部分向外挤压成连续相，提供了更好的空间稳定性，从而防止液滴聚集和聚结[38］．结合百里酚对保留百里酚的积极影响与文献报道的与MD结合后乳清蛋白乳化性能的改善相一致[38，42］．在加速保质期测试条件下，NaCN - md共轭稳定o/w乳状液在储存20天后的稳定性优于NaCN稳定乳状液[29］．

溶解度

溶解度是蛋白质的一个重要功能特性，它影响蛋白质的其他功能。WPC、WPCMD混合物和WP-MD缀合物的蛋白质溶解度随pH值从3.0到7.0的变化图6．观察到，在整个pH范围内，共轭物的溶解度明显高于WPC和WPC- md混合物(p≤0.05)，特别是在WPC的等电点附近。这可能是由于偶联在蛋白质的等电区具有防止沉淀的保护作用[29，43］．所得结果证实了Shepherd等人的发现。[13]，并归因于蛋白质净电荷的变化，以及由于附着的糖残基而引起的水合作用。同样，O 'Regan和Mulvihill [29]报道，与NaCN相比，NaCN - md缀合物具有更好的溶解度，特别是在蛋白质的等电pH值附近。蛋白质-多糖缀合物溶解度的提高归因于大块的高度亲水多糖附着在蛋白质上[44］．

结论

乳清蛋白-麦芽糖糊精的高分子量结合物是通过无毒、经济和食品级自然发生的美拉德反应制备的。用SDS-PAGE证实了麦芽糖糊精糖基化乳清蛋白分子量的增加。用ATR-FTIR和糖基化程度分别验证了糖基化过程中的结构变化和氨基消耗。与乳清蛋白相比，与MD糖基化后乳清蛋白的等电点向较低的pH侧下降。乳清蛋白-麦芽糊精缀合物在整个pH值范围内(3.0-7.0)具有更好的乳化性能和溶解度，特别是在乳清蛋白的等电点附近。

上述结果表明，乳清蛋白-麦芽糊精缀合物具有较好的功能性能，可进一步作为食品级壁材用于微/纳米乳剂的制备食物系统．

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们感谢印度哈里亚纳邦Karnal的ICAR国家乳业研究所所长提供必要的设施，并感谢ICAR在纳米技术平台CRP下提供资金。

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