银杏六种银杏苷单体的制备、分离及抗肿瘤活性研究

摘要

银杏酚是一种生物活性化合物银杏叶L、参展优秀抗肿瘤活动。为了研究银杏的构效关系，采用制备高效液相色谱法，先后分离得到4个银杏单体(C13:0, C15:1-Δ8, C17:2-Δ9, 12, C15:0)和2个银杏异构体(C17:1-Δ10, C17:1-Δ12)并进行了鉴定。MTT分析结果表明，银杏中所有的单体均存在细胞毒性抗HepG2和HGC细胞。具有不饱和侧链的银杏单体比具有饱和侧链的银杏单体具有更强的抑制作用。的集成电路₅₀银杏苷C15:1-Δ8、C17:2-Δ9、12、C17:1-Δ10、C17:1-Δ12对HepG2和HGC细胞的影响依次为:5.69和3.94、19.95和11.09、19.79和10.22、22.76和11.4 μg/mL。其中银杏C15:1-Δ8的细胞毒性最强，IC50值最低。对于两个银杏C17:1异构体，Δ10的双键比Δ12的双键具有更高的抗肿瘤活性。带有两个双键的银杏C17:2的IC50值与带有一个双键的银杏C17:1的IC50值接近。

关键字

银杏叶L.银杏，分离，鉴定，抗肿瘤活性

介绍

银杏叶它被认为是“活化石”，已经在地球上存在了2亿年[1]。提取的银杏叶含有萜烯三内酯和黄酮醇苷等生物活性成分的叶子(EGb)已被用于治疗许多疾病，包括阿尔茨海默病心血管疾病痴呆记忆力减退和脑损伤缺血(2]。如今，叶黄素是欧洲和美国最广泛使用的草药之一[3.]。据报道，有三种类型的烷基酚(银杏酸、腰果酚和腰果酚)存在于银杏，并且由于不同的生产工艺，在商业提取物中以不同的浓度出现[4-6]。这些引起接触性过敏的烷基酚已被确定为EGb中的有害成分，大多数雷竞技网页版制造商应在EGb761加工过程中去除它们[7]。虽然口服银杏烷基酚的毒性从未得到证实[8-10]，大多数供应商将其提取物的含量限制在5ppm [11，12]。然而，一些治疗期望的效果已被报道银杏烷基酚，如抗氧化活性，抗肿瘤活性[13-15]。这些突出的生物活性引起了人们对烷基酚的研究兴趣，因为它的结构和作为一种治疗剂在治疗疾病中的潜在应用癌症还有其他疾病。

银杏酸是6-烷基水杨酸的衍生物，烷基侧链长度从13到17个碳不等，有0、1或2个双键。银杏酸在加热时可通过脱羧作用转化为银杏醇(3-烷基酚)[16]。我们在前期的研究中发现银杏醇还具有良好的抗癌作用和热稳定性，然后分离出银杏醇C13:0、C15:1和C17:1，并将它们分离出来抗对抗癌细胞的作用进行了测试[17]。但银杏C17:1不是单一的化学物质，在GC-MS分析中呈现出两个完全相同的质谱峰(1:1)[17]。银杏C17:1的同分异构体尚未分离鉴定，其生物活性也尚未进行比较。

为了得到银杏醇C17:1单体，采用制备高效液相色谱法对银杏醇进行分离。银杏C17:1和其他银杏单体的异构体通过分馏法纯化和分离。化合物的结构通过紫外、红外、气相色谱-质谱、1h - nmr、13理化性质。采用MTT法比较其抗肿瘤活性。

结果与讨论

制备隔离

根据中描述的隔离程序图1，提取银杏酸转化为银杏醇[17]。用制备高效液相色谱法分离银杏酚[18]。在Welch Ultimate AQ-C上获得了最佳分离工艺18高效液相色谱柱用MeOH-H洗脱2O (86:14, v/v)， 24ml /min。在最佳条件下，银杏苷在68分钟内被分离，并在制备色谱图(图2）.为了获得单一的化学物质，对每个峰进行分割和收集。从图2图中1-4峰是对称的，但第5峰呈肩峰状，这意味着它不是一个单一的化合物。将第5个峰按58.5~59.0、59.0~60.7、60.7~62.3、62.3~63.4、63.4~64.3、64.3~66.0、66.0~67.5 min的时间顺序划分为7个峰段，采用高效液相色谱法对各峰段进行分析，各峰段均呈单一对称形状，且保留时间相同。从峰1 ~ 4中依次得到G-1、G-2、G-3和G-4，从峰5中同时得到G-5和G-6。六种化合物的HPLC纯度见图3。

银杏的鉴定

通过GC-MS进一步鉴定了这些化合物的纯度(图4）.G-1、G-2、G-3、G-4、G-5、G-6的总离子色谱图(tic)见数字4-4 f，均表现为单峰和对称峰。6个化合物的纯度分别为100%、98.1%、100%、100%、96.7%和99%。

6个化合物的结构通过紫外、红外、1核磁共振,13碳核磁共振波谱(表1)及气相色谱-质谱(图4）.在表1,1六种化合物的H-NMR谱数据显示存在一个甲基(δH约0.90 ppm, t, J = 6.8 Hz, 3H)，长链亚甲基(δH约1.30 ppm, b)和1,3取代苯(δH7.15(t, J = 7.6 Hz，1H)， 6.76(d, J = 7.6 Hz，1H)， 6.66(m, 2H) ppm)。在红外光谱(3330 cm-1)处，羟基的存在得到了证实。表1在质谱(MS)上，碎裂峰为108(甲酚)。图4）.它们的紫外光谱(λ马克斯(甲醇)= 275 nm)相同(表1）.所有数据表明，这六种化合物均为3-烷基酚[19，20.]。它们在烷基链的长度或烷基链上双键的数目和位置上是不同的。

根据实验数据，推导出了烷基链的长度和不饱和度1核磁共振,13质谱中的C-NMR和分子离子峰数字4-4 fG-1、G-2、G-3、G-4、G-5和G-6的分子离子峰(m/z 276、302、328、304、330和330)分别对应于烷基链为C13:0、C15:1、C17:2、C15:0、C17:1和C17:1的银杏。G-5和G-6用相同的质谱分析。假设这两种化合物对应于双键位置不同的异构体或顺反异构体。

为了确定G-2 (C15:1)、G-5 (C17:1)和G-6 (C17:1)的双键的确切位置。它们的双键被KMnO氧化分解4和NaIO4，产物与(CH)甲基化3.哦)2男朋友3.采用气相色谱-质谱法(图5）.从氧化产物甲酯的分子离子峰可以推断出烷基链上双键的位置[20.]。例如，G-5在δH5.36 (2h)， δC129.9 (2C) ppm在烷基链上显示一个双键。从甲基酯产物的质谱中m/z 278处的分子离子峰(图5 b）.烯基碳在δ处被观察到C27.2 ppm，因此双键为顺式[21]。因此，G-5被鉴定为3-[(10Z)-十六烯基]苯酚。根据质谱(MS)的分子离子峰(m/z 250和306)确定G-2和G-6的双键分别为Δ8-C15:1和Δ12-C17:1。图5一个和5度）.因此G-2被鉴定为3-[(8Z)-十八烷基]苯酚，G-6被鉴定为3-[(12Z)-十七烷基]苯酚。19-22]。

G-1、G-3和G-4的光谱数据与前人报道一致[19-22]。这些化合物分别被鉴定为3-三烷基酚、3-[(9Z, 12Z)-庚二烯]苯酚和3-五烷基酚。它们的结构公式列在图6。

6个化合物中，3-三烷基酚和3-五烷基酚为白色粉末，3-[(8Z)-五烷基]酚、3-[(9Z, 12Z)-十七烷基]酚和3-[(12Z)-十七烷基]酚为浅黄色油。

银杏单体抗肿瘤活性研究

MTT法检测6种银杏单体对肝癌HepG2、HGC和SW480细胞的抑制作用。6种单体分别以5、10、20、30、40 μg/mL的浓度作用细胞48 h。结果表明，银杏单体对HepG2和HGC细胞均有明显的生长抑制作用，而对SW480细胞有明显的生长刺激作用，抑制率为负(图7）.值得注意的是，不同的癌细胞对生物活性化合物的敏感性各不相同。的集成电路50测定6个单体(C13:0, C15:1-Δ8, C17:2-Δ9, 12, C15:0, C17:1-Δ10, C17:1-Δ12)对HepG2和HGC细胞的作用值(表2): 43.28和37.98 μg/mL、5.69和3.97 μg/mL、19.95和11.09 μg/mL、38.94和29.73 μg/mL、19.79和10.22 μg/mL、22.76和11.4 μg/mL。HGC细胞对IC值较低的银杏单体更敏感50值高于HepG2细胞。具有不饱和烷基侧链的银杏对HepG2和HGC细胞的毒性高于具有饱和侧链的银杏。在4种侧链不饱和的银杏单体中，银杏C15:1的抗肿瘤活性最高。Lee等人也报道了类似的工作。[23他们报道腰果酚C15:1比腰果酚C17:1对A549、MCF-7细胞具有更强的抑制活性。银杏醇C17:1-Δ10对HGC和HepG2细胞的活性高于银杏醇C17:1-Δ12。然而，带有两个双键的银杏醇C17:2-Δ9, 12并不比只有一个双键的银杏醇C17:1表现出更强的细胞毒性。此外，我们前期的研究表明，两种异构体组成的银杏醇C17:1混合物对A549、U251和SMMC7721细胞的抑制作用强于银杏醇C15:1单体[17]。假设:银杏异构体C17:1-Δ10和C17:1-Δ12在银杏C17:1混合物中具有协同作用。

实验部分

材料和化学品

Sunlight-dried银杏叶该植物于2012年10月采自中国江苏省，由药学院生药学实验室鉴定。代金券标本存放于中国江苏大学药学院生药学实验室。

甲醇(HPLC级)购自中国医药股份有限公司。HPLC实验采用娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。除特别说明外，本研究中使用的其他化学品均为分析级。DMEM和胎牛血清购自Gibco公司。3-(4,5 -二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯基溴化四唑(MTT)和(CH3.哦)2男朋友3.-14%(批号101624954)购自Sigma。

一般分析

以甲醇为溶剂，在日本岛津UV-2450光谱仪上获得紫外光谱。使用二氯甲烷作为稀释剂，在Nicolet Nexus 470 FT-IR光谱仪(Thermo Electron Corp.， USA)上记录FT-IR光谱。

采用Agilent 1260高效液相色谱系统，包括G1311A泵和G1314b VWD检测器(Agilent Corp.， USA)进行所有实验。使用Agilent Chemstation B.02软件进行数据收集和处理。分析采用SHIMADZU shipp -pack VP-ODSC18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)。流动相为甲醇和水(90:10,v/v)，流速为1.0 mL/min。在275 nm处对银杏苷进行检测。

GC- ms分析使用ITQ1100选择性检测器连接TRACE GC Ultra (Thermo Scientific, USA)，配备TR-5MS毛细管柱。载气采用氦气，线性压力为0.38 MPa。进样量为1μL。烘箱温度程序如下:初始温度为100℃，持续2min，然后以20℃/min的速度上升至240℃，持续20 min，达到240℃。注入器温度保持在250℃。EI光谱在25 ~ 550 Da范围内获得。

在CDCl中使用Bruker DRX500核磁共振谱仪采集核磁共振光谱3.工作频率为400兆赫1H分析和在100兆赫下13C分析，用四甲基硅烷(TMS)作为内标。

银杏单体的制备与分离

许多研究人员描述了从银杏叶或银杏叶中分离银杏酸的制备方法[16-18，22]。进一步决定大致遵循Yang等人描述的程序。[17]。脱酸根据Paramashivappa等人的描述，对银杏酸进行了测定。[16]。整个分离纯化过程在图1。简而言之，干燥银杏叶石竹提取得到石油醚提取物，石油醚提取物经硅胶柱分离色谱法用石油醚- eto洗脱2-HCO2H (89:11:1, v/v/v)得到银杏酸馏分。银杏酸与氢氧化钙在140℃下混合2 h，用石油醚(60-90℃)提取，浓缩得到棕色油。棕色油进一步提纯得到银杏。

银杏单体的分离采用两台WK500LC-500P高效液相色谱泵、SPD-500紫外检测器和Marathon XT手动进样器(旭宇科技有限公司)。杭州，中国)配备1ml回路。这次分离发生在韦尔奇终极AQ-C上18HPLC柱(250 mm × 21.2 mm, 10 μm)，以甲醇- h为流动相洗脱2O (86:14, v/v)，流速为24.0 mL/min, 280 nm紫外检测器对银杏单体进行监测。

KMnO对银杏烯链的裂解作用4和NaIO4

通过氧化降解测定双键的位置[20.]。银杏单体(1mg)溶解于1ml ter-BuOH中，然后溶解于1ml 5mm KMnO中4/ 20mm NaIO4和1ml的4mm Na2有限公司3.是补充道。反应混合物在27℃下振荡1 h。产物用(CH)甲基化3.哦)2男朋友3.-14%，甲酯产物经GC-MS(色谱柱，TR-5MS)鉴定。最后一个双键的位置是由甲酯产物推导出来的。

癌细胞系和培养

HepG2 (肝细胞癌)、HGC(胃癌)及SW480 (结肠癌)来源于上海生物化学与细胞生物学研究所(中国上海)。将细胞置于含有10%胎牛血清、100单位/mL青霉素和125 mg/L链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5% CO的湿化气氛中培养2。

抗肿瘤活性测定

采用MTT法测定银杏酚的体外抗肿瘤活性。5 × 104取对数生长期的HepG2、HGC和SW480细胞分别制成/mL细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔培养板上，每孔100 μL，培养24 h，分别加入100 μL的6种银杏酚。同时设对照孔，每组设6个平行孔。再培养24 h后，每孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，再孵育4 h，然后去除生长培养基，每孔中加入100 μL DMSO。培养板充分振荡。反应停止后，用酶标仪(Bio-Rad, USA)检测570 nm处的吸光度值。细胞生长抑制率按下式计算:

统计分析

数据以均数±SD表示。统计学分析采用SPSS 16.0软件进行Student 's检验。

结论

采用制备反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对银杏醇进行了一步分离，从银杏醇同系物中分离得到了6个银杏醇单体。首先从银杏C17:1混合物中分离鉴定了两个银杏异构体C17:1-Δ10和C17:1-Δ12。结果表明，具有不饱和侧链的银杏单体抗肿瘤活性高于具有饱和侧链的银杏单体。银杏C15:1在所有单体中抑制作用最强。对于银杏C17:1异构体，Δ10的双键比Δ12的双键具有更高的抗肿瘤活性。银杏醇C17:2与银杏醇C17:1具有相似的抗肿瘤活性。

确认

本研究得到国家自然科学基金(81372404)资助。镇江市社会发展基金项目(SH2015072)和江苏省高等学校重点学科建设项目。

表格一览

表1 表2

数字一览

图1 图2 图3 图4 图5 图6 图7

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