ISSN: 2321 - 6204
Benie CKD1,2*,Dadie1,2,Guessennd NK2,3,Kouame ND1,Yobouet英航1,4,又名1,4,Koffi医学博士1和尼日尔米2,3
1科特迪瓦阿比让,Nangui-Abrogoua大学,生物技术和食品微生物学实验室(LMBM),科特迪瓦阿比让
2细菌学和病毒学科特迪瓦的巴斯德研究所(IPCI),科特迪瓦阿比让
3费利克斯大学Houphouet Boigny,医学科学教师,科特迪瓦阿比让
收到的日期:01/12/2016;接受日期:06/12/2016;发布日期:12/12/2016
访问更多的相关文章研究和评论:食品和乳品雷竞技苹果下载技术杂志》上
假单胞菌是一种代理食品变质,但其作用在某些地方的污染产品是未知的。本研究的目的是评估物种多样性和假单胞菌的流行污染牛肉,新鲜和熏鱼在一些市场出售。共182个样本包括95牛肉,41鲜鱼和46熏鱼收集和分析。假单胞菌琼脂的溴棕三甲铵梭链孢酸钠Cefaloridine (CFC)基地和溴棕三甲铵琼脂用于假单胞菌种虫害隔离根据ISO 6887 - 2标准的方法。菌株首次以API 20 ne,然后经聚合酶链反应(PCR),使用16 s rRNA和rpoB基因。铜绿假单胞菌的血清型的菌株是由一个幻灯片凝集试验。假单胞菌的患病率为97.9%,87.8%和63.1%分别在牛肉,新鲜的鱼和熏鱼。总共有158(97.5%)由16 s rRNA隔离被证实为假单胞菌。铜绿假单胞菌多数物种的患病率是46.8%,26.6%,p . putida为8.2%,p的荧光。大多数铜绿假单胞菌血清型的患病率为20.3%,14.9%,12.2%和12.2%分别为O11 O5, O16 O7血清型。 The study revealed a high prevalence of P. aeruginosa serogroups which represent a risk for human health. It requires improving the health management of the food chain of the products analyzed to prevent their possible alteration or reduce the risk of infections.
假单胞菌、牛肉、鱼、血清型,科特迪瓦
假单胞菌,主要是铜绿假单胞菌是一个主要的代理与院内感染和食物中毒(1- - - - - -3]。有一个物种的出现假单胞菌种虫害表达各种致病因素(4,5]。在假单胞菌,铜绿假单胞菌知道是危险的。事实上,铜绿假单胞菌形成生物膜赋予高功率殖民的食物变质,耐防腐剂、消毒剂和抗生素(6- - - - - -8]。的患病率铜绿假单胞菌感染是11.5%在欧洲,17%在发展中国家。食品行业协议的特殊性铜绿假单胞菌由于其快速增长的能力,形成生物膜(2]。
在人类假单胞菌也孤立。最常见的孤立的物种铜绿假单胞菌、荧光p, p . putida和p . stutzeri [9]。总体死亡率相关铜绿假单胞菌也是评价高达70%,死亡率约为40% (5,10]。许多因素被铜绿假单胞菌毒性。我们注脂多糖(LPS)这是一个重要的毒力因子有内毒素的作用。有限合伙人包括疏水脂质分子的本质部分,中央核心的低聚糖和多糖的另一部分定义为O抗原或O多糖(2,4被牵连进毒性的主要因素。当前的流行病学数据表明,大多数的20种血清型的国际抗原方案(iat) IATS-O1,血清型2 (IATS-O2, IATS-O5和IATS-O16), IATS-O6, IATS-O11负责70%的铜绿假单胞菌感染(2,11]。的毒性之间的关系铜绿假单胞菌和不同血清型研究[2,11,12]。
分泌毒素的菌株有III型分泌系统(tts),外毒素(ExoU)通常是11种血清型,而6血清型菌株与表型相关的外毒素U (ExoU) - (13]。此外,据报道,一些铜绿假单胞菌种能够诱导高抵抗抗生素[7,12,13]。
假单胞菌无处不在,因为他们的性格,可能很难生活在生态位14]。他们可以从食物如孤立;牛奶、乳制品、肉类、鱼和海鲜3,15- - - - - -17]。假单胞菌细菌psychrotrophic变质的肉和指标上可以生长在室温下0ºC至30ºC [18]。鱼和肉是西非的重要在人们的饮食(19- - - - - -21]。他们还在低蛋白饮食提供一个有价值的补充,基本的维生素和矿物质(22]。动物产品(肉、鱼)大大有助于食品安全、营养和减贫19,23]。
在科特迪瓦,渔业和养殖持有一个相对重要的地位在全国社会经济平衡,因为;他们住大约有500000人,占国内生产总值(GDP)的3%。然而,尽管鱼和肉的营养价值高,他们是高度易腐食品和面临巨大的约束,限制他们的生产力和竞争力。保护模式,吸烟鱼和销售条件的不同以及屠宰、切割和牛肉的尸体可能导致产品污染的分布。如果有些工作做的描述假单胞菌与院内感染和环境(15,24)数据稀缺或不存在的普遍性和多样性假单胞菌菌株污染动物产品。
本研究的目的是评估属的患病率和多样性假单胞菌种虫害隔绝牛肉,新鲜的鱼和熏鱼出售在阿比让,科特迪瓦。
材料
牛肉,新鲜的鱼和熏鱼是用作生物材料。鱼组成的竹荚鱼(大西洋马鲭鱼);沙丁鱼(萨迪纳pilchardus)和鲤鱼(鲤属carpio)。假单胞菌绿脓杆菌写明ATCC 27853是作为质量控制的参考应变。
研究网站
跨类型研究在阿比让,科特迪瓦的经济资本和位于Ebrie泻湖,南部的国家(图1)。阿比让选择,因为它是一个原始的区域高生产和消费的牛肉和鱼。阿比让也大多数50亿人消耗大量的牛肉和鱼。这项研究是在五区进行如Port-Bouet,博博,Yopougon, Adjame Bingerville。这个螺栓是在这些地区根据其重要性的生产和销售牛肉和鱼和制造商和商人同意参与这项研究。
抽样
这项研究主要针对牛肉,新鲜的鱼和熏鱼。鱼的竹荚鱼(大西洋马鲭鱼);沙丁鱼(萨迪纳pilchardus)和鲤鱼(鲤属carpio)。样本收集从1月到2015年4月。牛肉是在销售市场和屠宰场。新鲜的鱼和吸烟主要市场的摊位。新鲜的鱼也带到阿比让渔港。共182个样本包括95个样本的牛肉、41个样本鲜鱼和46熏鱼的样本。二百克的每个样品被放在兜包袋。所有样本收集立即被存储在一个包含carboglaces冷却器+ 4ºC和运输为分析实验室。 Analyzes were performed within two hours following sampling.
隔离和枚举的假单胞菌种虫害食品矩阵
10 g的数量从每个样本的牛肉,新鲜的鱼和熏鱼是在90毫升无菌蛋白胨水混合(Oxoid有限公司、英国)聚乙烯袋和混合三角胸衣400(英国Colworth) 2分钟。1毫升每个样本都被添加到9毫升trypticase酱油汤(TCS) (Bio-rad法国)。用无菌蛋白胨水样本连续稀释0.1% (Difco) (101到104)[25](NF EN ISO 6887, 2004)和表面镀有0.1毫升一氯氟化碳(溴棕三甲铵、梭链孢酸钠cephaloridin)假单胞菌基地琼脂(Oxoid代码:0559年,英国)补充SR0103 (Oxoid,翰斯,英国)和溴棕三甲铵琼脂(Biokar、巴黎、法国)。假单胞菌氯氟化碳琼脂基地补充SR0103用于隔离假单胞菌种虫害,溴棕三甲铵琼脂用于隔离的假单胞菌绿脓杆菌。
对氯氟化碳假单胞菌基地琼脂补充额外的SR103,假单胞菌sp殖民地粘液,灰色,色素或不是。然后,在溴棕三甲铵琼脂,假定假单胞菌绿脓杆菌分离菌落产生蓝绿色,棕色或荧光色素沉着。18 - 24小时后的孵化(+ / - 1 h) 37ºC,选择包含30至300的培养皿殖民地和殖民地根据ISO 13720标准计算方法(26,27](ISO 13720, 2010)。ISO 7218,(2007)被用来评估和执行假单胞菌殖民地。
的识别假单胞菌
五个假定的殖民地假单胞菌(描述的隔离和枚举假单胞菌种虫害食品矩阵)氯氟化碳假单胞菌基地和溴棕三甲铵琼脂。他们有营养琼脂和孵化37ºC 24 h (+ / - 1 h)子文化。每个人假单胞菌种虫害和假单胞菌绿脓杆菌被证实的国王和王B琼脂(Biokar诊断、BM10508、法国)分别在41ºC和37ºC孵化24 h。特定色素的生产允许的分化假单胞菌绿脓杆菌和假单胞菌sp。因此,生产荧光黄绿色色素(pyoverdine)具体假单胞菌spp强调在王B中、生产(pyocyanine)特定荧光蓝色色素假单胞菌绿脓杆菌在国王。
API 20不带(BioMerieux SA、马西l 'Etoile、法国)被用于确定初步的生化的菌株和物种被确定使用API数据库。
的分子特征假单胞菌由16 s rRNA和rpoB基因检测
DNA模板制备细菌悬液的沸点200μl MilliQ (OD600年= 0.6)在安全锁埃普多夫管10分钟。管是立即在冰上冷却5分钟和离心机(20.000 g×10分钟,5ºC)。上层清液被随后保持在-20ºC,用作PCR模板DNA的研究。
每个基因的单一PCR鉴定进行了2μl模板DNA,每个引物0.1μl(20毫米)(组成DNA技术,法国),0.2μl脱氧核苷三磷酸腺苷(10毫米),5μl 5 x PCR缓冲,1.5μl Mgcl2(2毫米)和0.5 U ' Taq DNA聚合酶(Promega公司)的总量25μl。
DNA 16 s地区执行放大使用底漆集16 sf-16sr [3)(16科幻5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ';16 sr 5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)和以下热剖面在94ºC 2分钟;5 94ºC组成的周期45秒,1分钟55ºC, 72ºC 2分钟;35个循环组成的92ºC 45年代,60ºC 45 s, 72ºC 2分钟;最后的72ºC扩展2分钟;和最终冷却4ºC。DNA rpoB地区执行放大使用底漆集rpoB F”(5 ' -CAGTTCATGGACCAGAACAACCCG-3 ')和rpoB R (5 'acgctggttgatgcaggtgttc-3),调整头寸rpoB基因序列的1552年和2298年假单胞菌绿脓杆菌UCBPP-PA14 (CP000438)。
rpoB DNA是放大使用以下协议:初始变性(3分钟94ºC),紧随其后的是30周期的变性(1分钟94ºC),退火(1分钟58ºC)和扩展(2分钟72ºC),用一个7分钟的最后扩展72ºC。放大了10μl PCR产物的分离在1.5%琼脂糖凝胶在120 V 30分钟。放大后,琼脂糖凝胶在溴化乙锭(0.5μg /毫升)和分子成像探测到凝胶Doc™EZ(美国Bio-Rad)。
血清学分型的假单胞菌绿脓杆菌分离株
O-serotypes都由一个幻灯片凝集试验使用四个池(OMA OMC,中耳炎,OMF)和20单价抗血清,O1和O20(赛诺菲巴斯德诊断),根据制造商的建议。
统计分析
输入的数据与数据处理软件SPSS 20.0统计(美国IBM公司,SPSS . n:行情),芝加哥)和转移到Excel。统计分析与软件进行XLSTAT 2014.1和Ri386 3.0.1软件。描述性统计(频率、平均值、标准偏差)被用于定量变量。几何方法被用来计算数量。数量转换为八进制数数对数(log10)为了正常分布。
卡方检验是用来测试变量之间的关系。变量之间的差异被认为是显著的,p < 0.05。
显示克隆血清型和食物之间的关系矩阵,主成分分析(PCA)是提升层次分类(AHC)执行。AHC,病房标准使用层次分析。
普遍存在的假单胞菌在各种动物产品
根据表1的总体发病率假单胞菌在动物产品是86.8%。更高的牛肉97.9%,紧随其后的是87.8%的新鲜的鱼。最低的患病率在熏鱼63.1%被发现。
表1。普遍存在的假单胞菌在各种动物产品。
动物产品 | 数量的样品 | 菌株的假单胞菌 | 假单胞菌患病率(%) |
---|---|---|---|
牛肉 | 95年 | 93年 | 97.9 |
新鲜的鱼 | 41 | 36 | 87.8 |
熏鱼 | 46 | 29日 | 63.1 |
总 | 182年 | 158年 | 86.8 |
分子识别假单胞菌
分子识别的假定应变16 s rRNA基因证实了他们的属于假单胞菌(表2)。在162的隔离假单胞菌158(97.5%)被证实积极通过PCR扩增片段的16 s rRNA基因的1351个基点(图2)。然而74种铜绿假单胞菌后被API20NE经rpoB基因PCR方法(图2 b)。
表2。菌株的频率由16 s rRNA确认和rpoB基因。
基因 | 假定的隔离假单胞菌N = 162 | ||
---|---|---|---|
证实了物种 | 有效的 | 百分比 | |
16 s rRNA | 假单胞菌SP | 158年 | 97年,5 |
rpoB | 假单胞菌绿脓杆菌 | 74年 | 46岁,8 |
CP:积极的控制,假单胞菌绿脓杆菌写明ATCC 27853;CN:负控制;M:标志基因统治者100个基点(长椅上,100个基点DNA阶梯,Promega公司,美国)。
CP:积极的控制,假单胞菌绿脓杆菌写明ATCC 27853;CN:负控制;M:标志基因统治者250个基点(板凳,1 kb DNA阶梯,Promega公司,美国)。
的多样性假单胞菌孤立的从各种动物产品
的表3显示的多样性假单胞菌和他们的物种隔离在这个研究。铜绿假单胞菌比其他人更孤立,p . putida 26.6%和46.8% p与8.2%的荧光。p . dimunita p . stutzeri p chlororaphis和p . putrefaciens也孤立的频率低于2%。
表3。的多样性假单胞菌孤立的从各种动物产品。
种 假单胞菌 |
不同种类的假单胞菌从动物产品分离 | |
---|---|---|
数量的菌株(N) |
频率(%) |
|
铜绿假单胞菌 | 74年 | 46.8 |
p . putida | 42 | 26.6 |
p .荧光 | 13 | 8.2 |
p .不过 | 10 | 6.3 |
p . dimunita | 2 | 1.3 |
p . stutzeri | 1 | 0.6 |
P.chlororaphis | 1 | 0.6 |
P.putrefaciens | 1 | 0.6 |
假单胞菌。sp | 14 | 8.9 |
总 | 158年 | One hundred. |
普遍存在的假单胞菌物种动物产品
假单胞菌绿脓杆菌感染率(29.7%)在牛肉中发现所有动物产品是高于新鲜的鱼(10.1%)和熏鱼(6.9%)(图3)。这项研究还表明,p . putida在牛肉的患病率为24.1%,高于p .荧光的患病率(4.4%)。p .不过患病率的牛肉,新鲜的鱼和熏鱼还不到4%。假单胞菌chlororaphis只是孤立的熏鱼的患病率为0.6%。而假单胞菌stutzeri和P。putrefaciens发现只有新鲜的鱼同样的患病率(0.6%)(图3)。
种流行的假单胞菌绿脓杆菌
血清型O11患病率为20.3%主要是孤立的,其次是种O5 14.9%。然而血清型O16和O7有相同的患病率(12.2%)。种O8, O9、O15 O1, O10, O12, O2和O4患病率低于7%(表4)。血清型O11和O5孤立在牛肉,新鲜的鱼和熏鱼的患病率从12.2%至2.7不等(图4)。O7 O16血清型和孤立的牛肉和新鲜的鱼与患病率从9.5%至2.7不等。种O9和O12隔绝牛肉和熏鱼患病率从9.5%至2.7不等。研究表明,血清型O1, O4, O8和O15孤立只有牛肉患病率从6.8%至2.7不等(图4)。此外,血清型O10和O2孤立只有新鲜的鱼和熏鱼患病率为2.7和1.4%。
表4。血清型的多样性假单胞菌绿脓杆菌与动物产品。
假单胞菌绿脓杆菌血清型 | ||
---|---|---|
血清型 | 数量(n = 74) | 患病率(%) |
O11 | 15 | 20.3 |
O5 | 11 | 14.9 |
O16 | 9 | 12.2 |
O7 | 9 | 12.2 |
SN | 8 | 10.8 |
O8 | 5 | 6.8 |
O9 | 5 | 6.8 |
O15 | 4 | 5.4 |
O1群 | 2 | 2.7 |
O10 | 2 | 2.7 |
O12 | 2 | 2.7 |
O2 | 1 | 1.4 |
把O4 | 1 | 1.4 |
血清型分布假单胞菌绿脓杆菌
图分布表明,绝大多数的血清型是牛肉。这些种O16, O15、O11 O8, O7, O5, O4 O1群;种O12, O9特定于熏鱼和O2。新鲜的鱼,只有O10血清型。然而不是serotypeable都与牛肉和熏鱼(图5)。
的识别假单胞菌后生理生化特征是有用的,但这并不足以区分假单胞菌(3,16]。同时,传统的微生物的识别方法假单胞菌从食物、环境和临床样本是可靠的;他们需要几天完成。隔离污染食品的快速检测是非常重要的治疗决定农业(1]。识别微生物物种的PCR有可能迅速放大的序列所独有的特殊有机体(16]。
这项研究的结果证实,正确的识别和表征假单胞菌和假单胞菌物种只能通过结合文化、生化和分子测试。分子的结果显示,97.5%的既定隔离属于假单胞菌属。这么高的分子识别速度表明,基因组研究是需要确认的具体分类地位假单胞菌spp [3,16,28]。动物产品的微生物分析的结果表明,总体患病率假单胞菌在动物产品是86.8%。这么高的患病率可能的事实假单胞菌细菌,主要铜绿假单胞菌非常参与食物变质。
这个物种可以适应各种环境由于其高遗传可塑性。它还可以开拓殖民地和感染几乎所有解剖网站(2,28,29日]。的患病率假单胞菌牛肉价格高97.9%,紧随其后的是新鲜的鱼为87.8%。最低的患病率在熏鱼63.1%被发现。这种污染水平的差异是用这一事实来解释假单胞菌发展在高水分活度的产品优先。事实上,水分活度的牛肉(72% - 97%)和新鲜的鱼(73% - 95%)高于熏鱼(10% - 30%),因此影响食物的味道和容易退化(18,30.]。
此外,患病率高假单胞菌牛肉中观察到的类似报道Abd [1];Franzetti和Scarpellini3]。假单胞菌被调查产品表明,牛肉,新鲜和熏鱼在阿比让市场销售受损,因为他们是psychrotrophic细菌指标或蚀变指数受污染的产品3,14,16]。然而,患病率较低假单胞菌观察到熏鱼期间,这一事实可以解释吸烟,烟雾粒子吸收鱼,抑制细菌生长的产品表面(30.]。这些细菌的存在的熏鱼样品可以解释为post-contamination由于恶劣的条件和存储市场(3,31日]。
各种物种属于属假单胞菌被隔离在这个研究。大多数的假单胞菌物种隔离在这个研究铜绿假单胞菌(46.8%),p . putida(26.6%)、荧光和p (8.2%)。主要存在的三个物种可能是合理的,因为事实上这些物种可以茁壮成长在不同的环境中能够生长在环境温度(25 - 300ºC) (9,30.]。
这些结果与报道Abd [1]和Franzetti [3孤立的各种]假单胞菌物种在不同食品包括牛肉和鱼1,3,16]。的高患病率铜绿假单胞菌和p . putida可以解释,这两个物种是通常存在于人类,动物,植物及其涉及人畜共患病(2,9,12]。假单胞菌stutzeri, p . chlororaphis和p . putrefaciens pH值较低,因为他们在特定条件下发生了,水分活度(aw)和温度(18]。
的患病率铜绿假单胞菌和p . putida牛肉价格高,降低分别在新鲜的鱼和熏鱼。这么高的患病率在牛肉可以解释,这种类型的产品是窝藏等病原体的能力铜绿假单胞菌物种和p . putida多出现在饮用水的环境和在战斗中32,33]。这种流行也可以解释为这两个物种是能够生活在粘膜,蛀牙和身体的牛肉和污染屠宰后的成品。的患病率假单胞菌荧光,p .不过,p . stutzeri, p . putrefaciens和p . chlororaphis不到5%的三种类型的产品。这可以解释为这些物种可能污染这些产品类型。
这项研究还强调了各种血清型的假单胞菌绿脓杆菌与动物产品。种O11、O5 O7和O16主要血清型孤立在这个研究。这些结果可能是由于这些血清型主要是参与动物感染(12]。相同的观察是由陆等人表明,血清型O11与生产弹性蛋白酶和一些酶分泌的III型分泌系统(tts)本身参与肺损伤。
他们在他们的研究中发现,血清型O11菌株是最致命的(12]。O11和O5血清型孤立的牛肉比新鲜的鱼和熏鱼。血清型O1, O4, O8 O15孤立的只在牛肉;血清型O2和O10分别孤立熏鱼和新鲜的鱼。这种多样性的血清型可能是合理的,因为事实上菌株孤立在这个研究应该接触环境、水产和动物品种。雷竞技网页版
这些结果同意的陆et al。12人孤立在他们的研究中,相同数量的假单胞菌绿脓杆菌血清型与不同的数据大相径庭。与我们的研究中,这些作者并没有孤立O5 O16血清型。然而,他们孤立的血清型O3和O6多数研究血清型O6(29.3%)和O11 (22.8%)。这些差异可以解释为分析样本的数量,矩阵的性质和抽样的网站。
其他研究已经表明,血清型O1孤立只有牛肉和O11孤立的牛肉;新鲜的鱼和熏鱼与严重院内感染相关11,12]。这些血清组负责分泌的胞外酶外逸,ExoT和ExoU2,12]。这些酶不启动感染但促进组织的炎症和破坏细菌的传播。与慢性感染相关的房屋通常是由于铜绿假单胞菌通过诱导细胞凋亡(2,12]。实际上,当引入挂式酶真核细胞,这种蛋白质破坏肌动蛋白丝诱导细胞毒性和抗吞噬作用。
挂式和ExoT O11相关血清型是通常与死亡率相关的动物(12,14]。主成分分析表明,血清型O16, O15, O11, O8 O7, O5 O4和O1群与牛肉,新鲜和熏鱼。同样的分析表明,新鲜的鱼的特点是种O10和种O12熏鱼,O9和O2。相关非serotypeable菌株都是牛肉和熏鱼。这属于血清型是由于许多毒性因子和微生物感染的能力等几种类型的主机植物、昆虫和动物。
结果表明,正确的识别和描述的假单胞菌物种只能通过结合生理、生化和分子测试。本研究强调了存在和属的多样性假单胞菌在动物产品。的物种假单胞菌大多是孤立的铜绿假单胞菌,p . putida和p .荧光。研究还发现高发病率铜绿假单胞菌属于血清型风险。铜绿假单胞菌的血清型孤立的,最常见的和已知的潜在致病性血清型O11, O5, O7 O16。所有这些血清型可能与变更相关的因素,个人的抵抗和毒性;这需要改善的健康管理食物链产品的分析,以防止其可能的变更或减少感染的风险,可能与这种情况。
作者欣然承认细菌学和病毒学的巴斯德研究所科特迪瓦、食品科学和技术部门,大学的微生物学和分子生物学实验室Nangui Abrogoua以及生产者、销售者肉类和鱼类在科特迪瓦的贡献做这项工作。作者没有宣布任何利益冲突。