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国际创新研究期刊》的研究在科学、工程和技术

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患病率和筛选潜在的铁(III)和锰(VI)耐药微生物在工业土壤

宝贝,V1Rajakumar,年代2Ayyasamy,点3 *
  1. 博士学者,Periyar大学微生物系萨勒姆011年- 636年,印度
  2. 助理教授、海洋生物技术、Bharathidasan大学Tiruchirappalli 024年- 620年,印度
  3. 微生物学系助理教授,Periyar大学,萨勒姆011年- 636年,印度
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文摘

地球微生物学是地球科学的一个重要分支,目前的学习特征可耕种的土壤细菌从金属的基础工业。特征的细菌也会遇到铁和锰耐药能力高达6000 ppm的铁和锰。在大多数金属分离的菌株耐药密切相关的其他培养细菌,铁和锰耐药菌methylotrophicus KM001063隔离(SS3)附属于厚壁菌门的成员,由16 srdna符合基因序列分析,它有94%到最近的比赛出现在基因库数据库

关键字
金属电阻、土壤提取、总铁和锰,筛选。

我的介绍。
土壤是一个关键的组件在农村和城市环境中,并在这两个地方土地管理是土壤质量的关键。采矿业、制造业和合成产品的使用(如农药、颜料、电池、工业废料和土地应用的工业或国内污泥)可以导致金属污染的城市和农业土壤。金属污染导致一致的环境问题,因为生活在低水平的不溶性形式有毒本身[1]。因此,金属污染被认为是其中最不利人类健康和环境危害[2]也减少作物产量和土壤微生物活性[3]。特别是金属工业污染导致土壤生态系统变化,多样性,结构和功能[4]。
采样区域在Tamilnadu萨勒姆地区,地理上5205.30平方公里。4收入部门中,萨勒姆和Mettur主要选择抽样,因为这些地区金属行业中占到了4.14%和10%矿物基础产业(非金属)。萨勒姆地区的主要工业区,共有265家大型和中等规模行业分布在整个研究区域。在给定的研究中,工业这样的地方塞伦钢铁厂(Salem) Pottaneri (Mecheri块)和Jalakandapuram (Nangavalli块)选择采样站点。因为萨勒姆和Pottaneri还拥有一个大型产业和在Nangavalli金属和非金属行业发生。
微生物栖息在浅层和深层土壤,土壤蓄水层和沉积物,特别是异化的铁还原菌有重要的作用在金属如铁和锰的循环和氧化的有机化合物厌氧条件[6]。大部分工作在环境微生物学,土著微生物发挥重要作用的微生物隔离受污染的网站建议的影响周围的化学环境。超过100株的兼性厌氧金属(根)防细菌(根)修改厌氧浓缩文化从深海热液喷口动物群孤立在这个假单胞菌isachenkovii, p . sulfincola Shewanella oneidensis和美国frigidimarina菌株被选为其厌氧金属(根呼吸过程[7]。在给定的研究中,铁和锰在属微球菌耐药菌株,芽孢杆菌,气单胞菌属、假单胞菌和棒状杆菌分离及其金属抗性筛选。尽管明显的多样性铁(III)和锰(IV)耐药微生物群落分析和效率更高的金属公差范围用于修复研究[8]。这项研究还集中在铁和锰耐药细菌从金属工业土壤样本。本研究的目标是不仅分离和描述细菌隔离从选择金属污染的网站在萨勒姆地区,TamilNadu,还要确定铁和锰的抵抗能力确定耐金属隔离。

二世。材料和方法
采样地点
萨勒姆位于约160公里(99英里)东北哥印拜陀和西南约340公里(211英里)的州首府钦奈。塞勒姆是泰米尔纳德邦的第五大城市人口在钦奈,哥印拜陀,马杜赖,Tiruchirappalli分别和第四城市化。城市的面积是100平方公里(39平方英里)。萨勒姆位于11.669437°N, 78.140865°E。平均海拔278米(912英尺)。这座城市被山包围在四周,即Nagaramalai在北方,Jarugumalai在南方,Kanjamalai在西方,Godumalai东部和Shevaroy山北东[9]。
样品收集
土壤样本采集(1 - 10厘米深度)从三个不同的位置在萨勒姆附近的金属污染的网站钢铁厂,萨勒姆(11º37“N, 78º04”E),不锈钢制造、Jalakandapuram, Nangavalli(11º42“N, 77º53”E)和金达尔西南分公司,Potteneri, Mettur(11º47 N, 77º47“E)(图3.2.2)。收集土壤样本被命名为S1/2/3, J1/2/3 P1/2/3和他们保持清洁无菌袋和储存在4°C的标签。收集土壤样本通过筛子(2毫米)去除大块的碎片。物理、化学和生物学参数从收集土壤样本进行了分析。
物理化学参数的分析
元素分析,收集土壤样本被风干,地面和通过0.6毫米直径的不锈钢网。混合样品的2 g在250毫升玻璃烧杯和消化8毫升的王水(浓盐酸和硝酸的混合3:1ratio)砂浴2小时。蒸发干燥附近后,样本与10毫升的2%硝酸溶解,过滤,然后用蒸馏水稀释至50毫升。每个样品的金属浓度分析了原子吸收分光光度法(AAS)。质量保证是通过双重决定和保证使用空白校正背景和其他来源的错误[10]。给定的土壤中可溶性铁和锰形式估计1,10-phenanthroline方法[11]和[12]formoldoxime方法。土壤的pH值测量样本由含水土壤提取物的制备(1:2.5,w / v)和测量玻璃电极的酸碱计(Cyberscan,模型:pH值510)在20°C [13]。土壤含铁(III)分析了氧化草酸铵提取[14],然后总铁和锰是量化的比色(上述)方法样品处理还原剂羟胺或者,原子吸收光谱法用于测量样品的总铁与草酸铵提取处理。相关的大量的耦合的氧化矿物形式也获得的总离子浓度之间的区别在提取和分数之和的可溶性形式的金属估计先前步骤中提取步骤。
细菌的分离和鉴定
土壤样本连续稀释在纯无菌蒸馏水稀释然后标准倾注平皿法进行了利用营养琼脂凝固后所有的盘子都孵化24小时37°C。在隔离的研究中,所有实验一式三份和可培养的细菌计数数据受到单向方差分析(方差分析)来确定主要可培养的细菌网站在三个不同的领域。可行的计数细菌计数测定可见殖民地每毫升集落形成单位(cfu /毫升)。独立殖民地选择基于形态学,形状和颜色。所有的菌株被反复纯化裸奔在营养琼脂和储存在4°C进行进一步的研究。孤立的细菌鉴定到属的分类学研究的形态特征(形状、大小、革兰氏反应和能动性),文化特征(营养琼脂殖民地,偏文化、刺文化)和生理特征(运动性、氧化酶、过氧化氢酶反应,利用葡萄糖的氧化淀粉水解和发酵试验)。识别采用基于Bergey限定的细菌学手册[15]。
16 s rDNA基因测序和系统发育分析
选中的细菌分离株用于放大16 s rDNA,一群细菌分离悬浮到50μl无菌蒸馏水。DNA隔离是使用标准程序执行[16]给定的DNA作为模板用于PCR。放大使用普遍的细菌基因组DNA提取的16 s rDNA引物Bact27F正向引物(5 ' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ')和Bact1492R反向引物(5‘ggt TACC TTG TTACGA CTT-3”)。PCR进行25μl反应混合物5μl DNA提取的模板,0.2毫米的引物Bact27F Bact1492R, 0.2毫米的核苷酸和1 U的Taq提供1 x缓冲区(Fermentas,汉诺威,德国)。热循环中执行MJ minicycler (MJ研究PTC(列车自动控制系统)100年,美国),由最初的95°C变性为0.05 h紧随其后30 95°C的周期为3秒,55°C 1分钟,2分钟72°C,紧随其后的是最后一个在72°C扩展6分钟。分析了PCR产物0.5 kb在1.5% (w / v)琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭1 x TAE缓冲区(0.5μg /毫升)之前进行进一步分析。放大产品与旋转柱纯化(美国Amicon Centricon 100列)遵循制造商的规格,紧随其后的是乙醇沉淀。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和测序,放大16 s rDNA碎片被用作DNA测序模板。多重序列比对和NJ情节进行了使用CLUSTALX,引导执行的分支模式的再现性分析。
筛选铁(III)和锰(IV)宽容的细菌
每个细菌隔离的metal-tolerance模式是由最低抑制浓度(MIC)的方法。分析成绩的金属盐被用来准备10000 ppm氯化铁和硫酸锰溶液的浓度分别是filter-sterilized和添加到50毫米Tris-buffered营养琼脂(NAT)媒体[17]根据所需水平的确定的公差范围为每个分离金属离子。使用的浓度范围是100到6000 ppm的铁(III)和锰(IV)在NAT盘子。一夜之间文化的现货接种生长在营养肉汤(Himedia)稀释105细胞/毫升作为接种体。文化发展在给定初始浓度(100 ppm)的金属(铁(III)和锰(IV))因此转移到下一个浓度,根据原始的评估和复制的每个净化细菌分离和孵化30ºC 48小时那么增长也得分和金属宽容筛选[18]。

三世。结果与讨论
领域的地球微生物学,主要研究微生物过程生成地质环境和各种地球化学记录在这些过程中,即微生物与矿物相互作用,在极端环境微生物生态学和分子地球微生物学[8]。铁和锰的生物地球化学循环是公认的一个环境重要的过程不仅因为这些元素是所有生物主要以可溶性形式最需要的养分。,孤立的细菌在金属工业土壤为基础,在这铁和锰耐药检测的能力。
土壤理化参数的收集
土壤的pH值样本微酸性中性,他们从6.91到8.16不等。光的红色、棕色、深黑色彩色和富含粘土粒子被发现在研究区土壤。金属浓度的土壤样品进行了分析通过使用原子吸收光谱法,收集到的土壤中,铁浓度被发现最大(5.8 ppm)在站点1土壤(表1)。给定的地下土壤含有金属氧化物处理草酸铵(pH-3)提取了2.35,1.26和2.71%的铁,0.4,0.38和1.09%的锰site1,分别为2和3。土壤含有总铁和锰由草酸铵萃取酸性消化,估计为81345点,6845 .79毫克/公斤高量在萨勒姆工业土壤,在网站有58790。4和6373 .41点网站3毫克/公斤,估计为77209 5和4363 .04点分别毫克/公斤
图像
典型土壤矿物沉积物从工业场所粘土土壤由细粒度特征也存在Fe-oxides强烈影响的土壤特性如颜色、表面大量的离子和分子的吸附,土壤聚合和氧化还原行为[19]。土壤中氧化铁的存在属性会导致红棕色到暗褐色斑点的产生的不同铁氧化物的浓缩。先前的报道表明铁氧化物也有非常低的溶解度和作为强大的颜料,因为它给许多土壤红、黄、橙棕色甚至在低浓度(百分之几)[20]。
铁是微生物增长的基本要素之一,但它的氧化态(铁氢氧化物)是一个强大的吸附剂为有毒的砷[21]。各种矿物形式的铁(III)可以利用广泛的菌株作为终端电子受体[22]。虽然在土壤和水铁矿是一种常见的Fe-oxide发现出现红棕色被其他颜料的颜色如果没有蒙面。它有一个缺乏有序结构类似hemati te和以前称为无定形ferrichydroxide [23]。在自然环境中,水铁矿通常存在于土壤或沉积物或生物的地方或快速氧化的铁(II)发生在表面区,所以通常被认为是一个相对年轻的铁氧化物。如果氧气变得不足,在地下面积的情况下,给予足够的时间,可以预期将水铁矿一个更稳定的铁氧化物。在这项研究中,不同铁浓度587 - 813 g / kg, Mn像43 - 6800 g / kg金属基础工业的土壤。
最高的氧化还原波动雷克林豪森地区的报道,德国北莱茵-威斯特法伦州土壤(范围840 mV)和定期强烈降低条件得到土壤中含有溶解铁浓度,但增加总铁量少,从316年到412 g / kg水铁矿占主导地位(Fe)总额的51%是在针铁矿啊地平线(24%),也显示合适的pH值/嗯条件也可以认为菲独家礼物的形式价/ Fe3 + [24]。在这个报告中,收集工业土壤的pH值,中位数pH值(土壤溶液的pH值6.91到8.16)(表1)在中性点是因为H +释放氧化过程会导致更少的可溶性和不溶性金属氧化物的存在形式。
土壤样本中细菌菌落
异养细菌可数范围104年稀释,党卫军样本值的方差分析给出了f值是103.40,PS土壤样品11.19和JS样本值22.48,PS的P值,JS和SS土壤样本范围0.0094,0.0016和0.00分别为(图1)。自野生的P值小于0.05,有显著统计学差异意味着细菌种群(CFU / g)从一个水平的采样位置到另一个在95.0%的置信水平。总共有90种不同的菌株分离金属污染土壤样品。孤立的殖民地从板块根据他们不同的形式纯化,接种到新鲜营养琼脂板使用平板划线分离技术。这些文化都是维持在4°C进行进一步的研究。分离和纯化细菌培养(魔法石,第1章从网站1日SS20 JS1在网站2和PS1 PS21 JS40网站3土壤样本)被选为识别。采样环境包含著名的矿物混合物浓度的一个潜在来源的细菌,因为大量的菌株被分离从低浓度的土壤三种不同金属基础工业场所的萨勒姆地区。
图像
识别细菌隔离
基于形态学、生理生化特征表明,应变接近革兰氏阳性和革兰氏阴性孤立的成员。确定细菌从受污染的土壤,图2显示大多数隔离17%受到假单胞菌(20日17 14%,分别给定3网站)也醋菌17.6%(25日14和14%)旁边这杆菌16.3%(15、29和5%),然后乳酸菌10%,微球菌8.6%,棒状杆菌6.6%,产碱杆菌属和梭状芽胞杆菌6.3%,Acidophilum 2.33%,肠杆菌科和等都1.66%最后1.3%德克斯氏菌属鉴定在90隔离从三个不同的网站(图2)。在任何细菌,生态研究识别隔离给出了一个具体讲讲关于社区的结构,从而使理解的作用属在特定的环境生物地球化学过程。本研究给出了初步通用识别给定的金属污染土壤的异养细菌。同样,在金属工业的身手稀释尤其Talanagari的土壤样本,阿里格尔,U。P,印度隔离不同组的细菌如假单胞菌和芽孢杆菌物种[25]。
图像
在给定的3工业场所、网站1中占主导地位,醋菌芽孢杆菌在网站2可能表明,细菌隔离条件和每个细菌隔离的性质和生理特征主要取决于采样站点的生理[26]。
分子识别
16 s rDNA基因的序列与参考生物基因库。部分放大645和773个基点的16 s rDNA序列片段SS3 SS12隔离和提交NCBI数据库搜索使用Blastn分别证实这种细菌的种类。选择,铁和锰耐遵守隔离分类群的芽孢杆菌的分子识别测序放大16 s rDNAs methylotrophicus (SS3)基因组存入基因库与加入数字KM001603核苷酸序列数据库。金属耐药菌株的系统发育分析表明,20株聚集在厚壁菌门组(图3)属于几个杆菌sp.它们之间与94 - 96%的相似性。芽胞杆菌科应变SS3 (KM001063)显示96%相似的最近的亲戚杆菌methylotrophicus CBMB205, plant-growth-promoting细菌从根际土壤分离[31]。
图像
铁(III)和锰的主要筛选(IV)宽容的细菌
铁(III)和锰的结果(IV)宽容的菌株(表2),90例孤立出现在基础培养基中没有任何金属离子,在这81个细菌分离株能生长在一个包含100 ppm的NAT铁(III)。这些隔离被转移到更高浓度的铁(III)、媒介只有14个隔离有铁阻力1000 ppm。隔离受到属微球菌(SS2),芽孢杆菌(SS3、SS12 JS43和信息),气单胞菌属(JS10)和假单胞菌(JS49 & PS15)出现在6000 ppm的浓度。但隔离像棒状杆菌(JS3),不同的隔离是芽孢杆菌属的(魔法石,第1章,JS7、JS8 JS16和JS38)不能增长增加浓度即。,6000 ppm的铁(III)。Mn (IV)宽容也类似于耐铁而是杆菌(魔法石,第1章)、假单胞菌(PS1)对1000 ppm锰。但在6000 ppm, 6隔离杆菌(SS3, JS43和信息)和假单胞菌(JS49, PS1和PS15)耐更高浓度的锰。
细菌是最丰富的生物重金属进行直接或间接的影响,在获得形式在周围环境也重复长期接触金属施加选择压力,有利于微生物的扩散是宽容/耐这压力由于进化不同的机制(如流出,金属离子的络合或减少或使用它们作为终端电子受体在无氧呼吸[26]。在地球微生物学、金属耐药微生物发挥重要作用在重金属污染土壤的生物修复。
图像
本研究结果显示,大部分的细菌分离株生长良好的低浓度铁(III)包含媒体,减少数量的细菌生长在更高浓度的铁含媒体。表2显示,90个细菌隔离能够生长在基础培养基没有任何金属,在这81年抵制100 ppm, 45到500 ppm, 14 5000 ppm,只有8隔离容忍6000 ppm NAT中三价铁。同样,拉赫曼et al .,(2009)[27]报道,许多抗隔离减少由于金属浓度的增加,165年他的报告在450隔离抵制500 ppm, 20 1000 ppm, 5为1500 ppm,只有假单胞菌sp。C - 171抵制2000 ppm的六价铬在基础培养基。埃利斯et al,[34]报道,金属细菌隔离受污染的网站拥有宽容Gram-positives属于芽孢杆菌的微生物种群,节细菌属、棒状杆菌和革兰氏阴性细菌的好药,如假单胞菌、产碱杆菌属、Ralstonia和洋葱。
Mn耐药性或多或少类似于耐铁但另外几个隔离在铁锰电阻电阻,除了杆菌、微球菌在站点1中,孤立的芽孢杆菌,假单胞菌、气单胞菌属、棒状杆菌属在网站在网站2和3中芽孢杆菌和假单胞菌具有更高的耐铁(III)的1000 ppm。这些分离株进行金属的最大公差到6000 ppm,属微球菌(SS2)杆菌(SS3、SS12 JS43和信息),气单胞菌属(JS10)和假单胞菌(JS49 & PS15)出现6000 ppm的铁(III),但在Mn (IV)的存在,6隔离杆菌(SS3, JS43和信息)和假单胞菌(JS49, PS1和PS15)对高锰浓度6000 ppm。这些结果表明,不同的金属毒性对细菌隔离可以解释的情况下细菌隔离,每个细菌的个性特征和生理隔离[30]。
Karelova等。[28]孤立的各种压力和多金属抗假单胞菌分离株(EK-I1、EK-I52 EK-I59, EKI64)从土壤重metal-contaminated从西南斯洛伐克。然而,芽孢杆菌sp,最初认为是典型的土壤细菌,尽管他们的优势对植物生长有益的行动在恶劣的环境,因为它被隐藏的潜力发展与可预测agrobiotechnological代理生产次生代谢产物的特性。在给定的研究中,芽孢杆菌数量精确修改为高浓度的重金属会增加能力的铁和锰金属污染土壤的生物修复,因为通常更高浓度的抑制作用的金属是一种常见的现象,发生在细菌修复[29]。这些适应性主要认可由于各种染色体,转座子和质粒介导的抗性系统细菌[30]。

四。结论
特别适合于高浓度的微生物种群的金属氧化物会增加治理土壤污染工业金属的能力。本研究的结果表明,芽孢杆菌methylotrophicus KM001063可以用于金属工业土壤的修复,因为它有更高层次的两个铁(III)和锰(IV)抵抗能力。

诉承认
作者衷心感谢UGC,新德里NON-SAP计划下的财政支持来完成这项研究工作。作者还感谢头,微生物学系提供的设施。

引用
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