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P - ISSN: 2347 - 2286
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1环境和病毒性肿瘤重点实验室,北京大学生命科学和生物工程、北京科技大学、中国Beijing100124
2国家病毒性疾病控制和预防研究所,中国疾病预防控制中心和传染病预防和控制国家重点实验室,中国Beijing100052
3中国西南野生动物资源保护重点实验室(教育部)生命科学学院、中国西部师范大学,中国南充
4病原生物学、基础医学学院河北联合大学、河北唐山。传染病部门,国家医学中心La Raza IMSS,墨西哥城,墨西哥
收到日期:08/04/2015接受日期:22/05/2015发表日期:26/05/2015
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HPV DNA的存在在食管鳞状细胞癌病例被报道反复从唐山地区的中国和其他地区食管癌的发病率高。在当前的研究中,研究人类乳头状瘤病毒的存在在食管鳞状细胞癌,112福尔马林固定石蜡包埋组织样本的ESCC唐山HPV16/18E6进行评估,HPV16/18E7, P16和P21蛋白免疫组织化学方法。112个样本将两人乳头状瘤病毒PCR阳性和阴性组分别为83和29例。从73年83幻灯片的PCR阳性组(87.95%),48(57.83%)、75年(90.36%)和72年(86.74%)HPV16/18 E6的幻灯片有积极的反应,分别HPV16/18E7, P21和P16。来自29个PCR - 14(48.27%)和15例(51.72%)显示阳性染色反应分别为P16和P21。结果显示良好的直接关系的两个常见的癌蛋白的表达,P16和P21,更高的积极的幻灯片和人乳头状瘤病毒特定蛋白质的72/83(86.74%)的P16和75/83(90.36%)的P21群积极的人乳头状瘤病毒PCR,在与较低的正导致负人乳头状瘤病毒PCR的15/29(51.72%)和14/29(48.27%)分别P16和P21。在这项研究中,P16和P21涉及两个好标记高表达ESCC癌组织与HPV感染概率。发现在这项研究中提高HPV参与了食管致癌的可能性。进一步调查与样本量大,不同地区可能是必要的。
免疫组织化学、食管鳞状细胞癌、食道癌癌,人类乳头状瘤病毒,福尔马林固定paraffinembedded组织
食管鳞状细胞癌(ESCC)发生在世界范围内,一个变量(地理分布1]。中国认为是食管癌癌高危区域。中国中国唐山地区与其他地区(Linxian、安阳、汕头)中晚期食管癌的发病率高(EC) (2]。食管癌是常见的癌症之一,从癌症死因第六3]。
人类乳头瘤病毒(HPV)是一种无包膜,与超过200个基因型双链DNA病毒。分子流行病学研究证实了宫颈癌的关系和高危HPV病毒和它最近也被视为non-cervical癌的危险因素(4]。
人类乳头状瘤病毒之间的关系和电子商务已经发表在最近的几十年里,特别是在EC的高流行的地区。人乳头状瘤病毒与食管鳞状细胞癌最初在1982年提出食管鳞状细胞癌在某些情况下显示类似的现象在生殖道HPV引起的病变(5]。然而,由于不同的人乳头瘤病毒感染率,从0%到68%不等,HPV在non-cervical癌的作用仍有争议,与宫颈癌几乎与高危HPV的协会确认(6]。使用不同的方法来评估感染率是这个变化可能的原因之一。聚合酶链反应(PCR),针对不同的病毒DNA片段的扩增,印迹、原位杂交和免疫组织化学是研究的常用方法存在病毒。先前的研究显示大变化在人乳头状瘤病毒的流行ESCC患者根据地理区域,民族和方法用于病毒检测(7]。甚至使用PCR研究,同样的方法,不同的报道HPV DNA患病率ESCC样本(7]。同时,有一个广泛的HPV流行食管肿瘤的报道在同一个国家8]。几个可能的原因研究包括小型研究大小之间的不同的结果,不同的检测方法,实验室内部变化,错误的样本收集导致transcontamination (8 - 10)。污染标本的收集、处理和评估可能导致假阳性结果(10,11]。预防污染被认为是最重要的部分研究HPV,因为这种病毒是一种常见的人类感染,可以参与各种上皮组织和DNA耐洗涤剂用于清洁(12- - - - - -14]。
在人乳头状瘤病毒类型已报告在人类ESCC样本,HPV 16是最常见,其次是其他高危人乳头状瘤病毒类型如HPV-18 HPV-31和HPV-3515,16]。
有一些方法来识别可疑的组织样本,HPV感染的检测DNA或蛋白质表达的细胞感染HPV病毒。最常见的方法用于此目的是PCR,但在这种方法中,如前所述,无污染的过程是非常重要的。由于这一事实,仅使用一个方法确认的HPV病毒感染是不够的。由于更少的假阳性结果,第二个最好的方法来检测HPV病毒感染免疫组织化学方法,检测HPV病毒感染细胞所表达的蛋白质有关。
在这项研究中,我们评估112年唐山地区的石蜡包埋组织中国食管癌高发地区。样品分为两组:一组是由积极的83个样本PCR结果HPV DNA和另一组,29个样品,没有任何导致PCR评估。首先我们的本研究的目的是调查样本的蛋白质表达的细胞显示HPV病毒的存在,已经证实了PCR测试,确认PCR的结果,其次发现HPV感染之间的关系和一些著名的癌症感染细胞表达的蛋白,在这项研究中P16, P21。
112年本研究病理诊断ESCC石蜡包埋组织标本来自病理部门的文件在唐山2008 - 2013。在另一项研究中,所有样品检测人乳头状瘤病毒DNA,根据评估,样品分为两组人乳头状瘤病毒PCR阳性的83个样本和人乳头状瘤病毒PCR - 29个样品。在这项研究中样本分析蛋白表达,三人乳头状瘤病毒基因的特殊蛋白质,人乳头瘤病毒16和18,人乳头状瘤病毒PCR阳性组和两个蛋白质,P16和P21,人乳头状瘤病毒PCR阴性组。标本收集和组织准备的幻灯片使用标准协议来减少可能的组织trans-contamination其他组织块。为了这个目的,我们使用了一个为每个块切片机刀片和年底组织幻灯片准备每一块切片机和水浴仔细清洗。组织部分(4μm)被安装到指定的幻灯片和与特定的单克隆抗体染色所需的蛋白质,人乳头瘤病毒16和18 E6、E7 P16和P21,人类乳头瘤病毒16和18根据南非广播公司的方法。在本研究中我们使用单克隆抗体对人乳头状瘤病毒16和18 E6和人乳头状瘤病毒16和18 E7圣克鲁斯。生物技术、lot.10606和D2709 1:200抗体稀释之前。P16和P21抗体来自ZSGB-Bio,很多zm评选- 0205,一60的稀释。
总之,幻灯片在60º烤30分钟和deparaffinised二甲苯两个15分钟时间,和内源性过氧化物酶灭活幻灯片沉浸于0.3%过氧化氢溶液在室温下10分钟。抗原检索的检索缓冲区(CB)在90º,持续15分钟。血清阻断方案(BSA)被添加到每个组织切片(100μl)然后anti-HPV单克隆抗体蛋白质的利益,人类乳头瘤病毒16和18 E6,人乳头瘤病毒16和18 E7, P16和P21,添加到每个部分和组织孵化一个晚上。清洗幻灯片后,二次抗体、南非广播公司推荐的解决方案添加根据协议供应商(博士德生物技术有限公司,很多SA1021)和少量的解决方案是用来染色幻灯片(lot.zli ZSGB-BIO技术有限公司- 9017)。最后核的可视化,所有幻灯片被苏木精染色剂染色和幻灯片最后脱水后安装。
在这项研究中HPV特定蛋白的单克隆抗体包括HPV 16和18 E6, HPV 16和18 E7和常见的癌蛋白,癌组织P16和P21,选择测试[17]。抗体用于检测HPV-18 P21和16个鼠单克隆抗体和P16和特定的抗体被兔单克隆抗体。
确定这些蛋白的表达可能影响食管恶性进展和发现可能的特殊临床特征之间的关系,所有参数(表1)和包含IHC结果(表2)分析了性别、年龄、类型的癌症和年级通过简单相关分析方法。统计显著性水平是0.05(双方)和所有参与分析使用SPSS v16.0 (SPSS Inc .,芝加哥,IL)。
表1:简短的信息情况下在不同的组。
表2:包含IHC HPV检测频率与不同的抗体在不同的团体。
目前的研究包括112例食道癌。组织学标本分类在两组食管鳞状细胞癌(ESCC), 56.25%(63/112),腺癌,43.75% (49/112)。简短的信息情况下包括年龄、性别、年级和类型的癌症所示表1分别为两个不同的组。根据这些数据我们有明确的性别差异和癌症类型患病率在两人乳头状瘤病毒PCR阳性和阴性组。人乳头状瘤病毒PCR阳性和阴性组我们可以看到大多数的男性癌症类型,但在情况不同的人乳头状瘤病毒PCR阳性和阴性组,高大多数鳞状细胞癌,63.85%(53/83),在PCR阳性组与高多数腺癌,65.51%(19/29),在PCR阴性组。我们的数据也表明,绝大多数的癌症在两组2级。
包含IHC评估之后,我们的数据显示更高的学位HPV-16/18 E6基因表达在人乳头状瘤病毒PCR阳性样品中87.95%(73/83)但没有大P16和P21表达组间差异。所有阳性样品的单克隆抗体显示两种细胞质和核染色反应。和关于显微镜分析,不同类型的细胞包括基底、pre-basal和内部细胞被证明参与积极的反应。每个抗体简要所示的结果表2不同组的样本。
在分析包含IHC结果和临床资料的情况下通过SPSS统计分析软件,简单的相关分析方法,我们没有发现任何有意义的关系的任何类型的蛋白质和临床特征包括性别、年龄、肿瘤类型和等级。
HPV-18/16 E6
从83年的幻灯片组,73年(87.95%)幻灯片阳性染色反应的两种类型的核和胞质染色反应,被发现在不同的幻灯片,但在不同的频率(图1)。这个结果在与人乳头状瘤病毒DNA的评估这些基因片段,在另一项研究中所做的几乎是相同的(18]。
图1:免疫组织化学结果针对HPV-16/18 E6肿瘤样本。人乳头状瘤病毒的阳性表达,由布朗表示免疫组织化学信号,主要分布在细胞质中不同等级的癌细胞。
HPV-18/16 E7
83幻灯片组,这种抗原的阳性结果,HPV-18/16 E7, 48例(57.83%),低于HPV-16/18 E6发病率73/83(87.95%)的积极的结果。像HPV-16/18 E6积极的幻灯片,两种类型的核和胞质染色反应中发现积极的幻灯片强大,但染色反应积极的幻灯片HPV-16/18 E6 (图2)。
图2:免疫组织化学结果针对HPV-16/18 E7在肿瘤样本。积极的样本,通过免疫组织化学方法显示信号,主要分布在组织的不同部分。P16和P21。
这些抗原的积极的幻灯片是72/83(86.74%)的P16和75/83(90.36%)的P21在一组,15/29(51.7%)和14/29(48.2%)的P16和P21in分别组2。像其他抗原一样,两种类型的染色反应阳性样本的观察(图3)。
图3:(左和右)免疫组织化学结果分别针对p16和p21抗原在肿瘤样本。人乳头状瘤病毒的阳性表达,由布朗表示免疫组织化学信号,主要分布在肿瘤细胞的细胞质不同解剖部位的癌组织。
过去二十年许多研究在人乳头状瘤病毒参与食道癌但结果显示HPV感染率从0到67%19- - - - - -22]。甚至有不同的感染率在同一个国家的不同区域的研究样本(23,24]。
采样方法、人口和民族因素、疾病状态和敏感性不同的检测方法被认为是这个品种的主要原因。
HPV感染之间的关系和年龄、性别、肿瘤TNM阶段,吸烟和饮酒已经被分析了。与HPV -受试者相比,饮酒可以被认为是食道癌的危险因素。然而没有统计证据的关系(25]。
HPV检测到很少在食管癌来自西方国家,而有更多的人乳头状瘤病毒的报道参与食管癌从人乳头状瘤病毒高发地区,特别是在中国和南非和中东国家,如伊朗的一部分。因此提出了HPV感染可能发挥作用在食管致癌作用只有高发病率地区(26,27]。
如前所述,在很多研究中有变量结果的人乳头状瘤病毒检出率不同地区相同的高发地区。例如在中国的高发病率地区利益在目前的研究中,许多研究对HPV流行在食道癌症样本但报告显示不同的结果从不同地区的高发病率地区下面列出:甘肃、山东、安阳,汕头,新疆,林西安和唐山的患病率为65%,16%,51.8%,60.2%,53.8%,1.1%,50% (28,29日]。在另一项研究在安阳地区盛行的ESCC(食管鳞状细胞癌),hpv 16感染率高的高村事件(72%)比低事件村(37%)
(17]。然而,人乳头状瘤病毒的参与仍存在争议,因为不同的研究展示了广泛的感染率。有一些原因可能导致这些差异的最重要因素之一是使用不同的方法来衡量感染率。HPV的评价ESCC组织聚合酶链反应(PCR),针对不同的病毒DNA片段的扩增,印迹、原位杂交和免疫组织化学都用于开发数据(17)。
PCR法被认为是最受欢迎的和敏感的方法来评价组织人乳头状瘤病毒。但在石蜡包埋组织,准备组织和提取DNA片段可能是导致污染或失踪的DNA的一部分,有时质量DNA提取可能导致DNA破坏,因此PCR的结果也许不会代表病毒DNA的实际情况组织样本。
在当前研究中评估蛋白表达在癌变组织和使用另一种方法来研究HPV病毒感染,我们用免疫组织化学(包含IHC)方法。
唐山是中国ESCC的高发地区之一,但没有大规模研究ESCC在这个地区。在当前研究中我们得到了112个样本的这个区域检测人乳头状瘤病毒DNA聚合酶链反应。样本分为两组DNA DNA正面和负面。在这项研究中表达人乳头状瘤病毒专门蛋白质DNA阳性组和另外两个蛋白质,P16和P21,两组人检查。
我们的数据证实存在HPV病毒DNA阳性组,由高阳性结果HPV 73/83(87.95%)的特定的蛋白表达。高阳性结果包含IHC评价也可以被视为好确认的准确性HPV PCR过程,在这种情况下,先前的研究[18]。在这项研究中也有很高的表达hpv 16和18 E6的87.95%(73/83)与hpv 16和18 E7, 57.83% (48/83)。这种情况有两种可能的原因;首先是后期E7基因表达与基因E6其次,也许时间还不够E7基因表达,多数情况下显示2级的癌症的临床特点,所以,在这种情况下将积极与包含IHC HPV DNA。另一方面通常低于E6 E7基因的表现。
分析的结果显示出良好的直接关系的两个常见的癌蛋白的表达,P16和P21,更高的积极的幻灯片和人乳头状瘤病毒特定蛋白质的72/83 (86.74%)P21 P16和75/83(90.36%)与积极的人乳头状瘤病毒PCR,第一组与较低的阳性结果的第二组与消极的人乳头状瘤病毒PCR, 15/29(51.72%)和14/29(48.27%)分别P16和P21。在分析结果发现任何病人的临床特征和蛋白表达之间的关系,我们的数据并没有显示出任何特殊的临床特征之间的关系,表1任何四个蛋白质的表达,HPV16/18 E6、E7 P16 HPV16/18和P21。
我们认识到,有一个限制的癌组织质量研究。因为这些癌变组织招募了来自不同地方的唐山地区,其中一些已经存储了多年,可能准备FFPE没有相同的质量在不同的中心。这个因素可能会限制样本的代表性推理。
总之,本研究首先是评价样本使用另一种方法两种方法之间的差异和二次检查结果,比较的结果包含IHC方法和PCR结果的质量检查和确认可渗透的研究[18]的结果。另一方面在这项研究中,P16和P21介绍了两个很好的标记高表达ESCC癌组织与可能的HPV感染。
工作部分拨款支持病毒性疾病预防与控制研究所中国疾病控制和预防中心,为传染病预防和控制国家重点实验室。
格兰特赞助商:支持的研究是中国疾病控制与预防中心和传染病预防和控制国家重点实验室,2011号sklid103;北京环境和病毒性肿瘤重点实验室、生命科学与生物工程学院,北京理工大学(格兰特赞助商:国家863项目,aa02a404 2012号,2014号zx10005002也没有。PXM2014_014204_07_000046)。