木聚糖酶的生产和表征从曲霉属真菌寄生阶层Caatinga 5963从土壤分离

文摘

丝状真菌5963年,曲霉属真菌寄生URM是选择在不同种类的曲霉属真菌生化反应,对木聚糖酶的生产。部分纯化木聚糖酶的酶活性和具体活动从5963年曲霉属真菌寄生URM是1116国际单位/毫升和6245国际单位/毫升,分别。温度和最佳pH值对木聚糖酶被发现是50°C和5.5,分别。许多报告应用程序的木聚糖酶,其作为膳食补充剂使用单胃的动物的发挥了重要作用,因为它可以提高营养物质的利用率。在这个工作努力是为了增加知识可用木聚糖酶产生的淹没培养从曲霉属真菌寄生阶层5963年和部分描述

关键字

水下栽培;丝状真菌;描述;木聚糖酶;Caatinga

介绍

homopolymeric骨干的木聚糖,由β- 1,4 0-acetyl D-xylopyranose有关单位和短链分支,alfa-L -arabinofuranosyl,alfa-D-glucuronyl残留。由于其复杂的结构synergystic所需的行动和许多酶之间的相互作用是其完全崩溃,但endo-β-1 4-xylanase (1, 4-endoxylanases(1, 4-β-D-xylan xylo-hydrolase, EC 3.2.1.8)是最重要的角色在depolymeratation木聚糖骨干(1,2]。木聚糖酶聚集显著关注全球由于他们在修改谷类食品、无与伦比的作用—面包烘烤(3,4]。另一个快速应急推力是其作为饲料添加剂等单胃的家禽和猪(5- - - - - -7]。从而提高饲料转化率,身体体重增加和生产的产量8,9]。木聚糖酶是由藻类、原生动物、软体动物、甲壳类、昆虫、陆生植物的种子,细菌和许多真菌物种属于曲霉菌属,通常在自然界发现的(10]。然而,丝状真菌木聚糖酶酶的潜在工业使用,因为它们是有趣的在大量生产的酵母和相比细菌(11];此外,丝状真菌的使用有很多优势,因为这些是公认的“一般安全”,被认为是一个优秀的细胞外酶的来源,主要是由于其高生化多样性(12]。这些真菌可以隔绝自然资源如土壤、水、植物、等等,不同的生物群落,如Caatinga只巴西生物群系,小了,所以以极大的生物技术可能被发现。

因此,这项工作的目的是生产和部分产生的木聚糖酶的特点曲霉属真菌寄生URM 5963,丝状真菌Caatinga土壤隔绝,与他们的工业应用的属性,特别是工业饲料。

材料和方法

微生物

曲霉属真菌寄生阶层从阶层获得5963年收集的真菌学、联邦大学的伯南布哥,巴西,保持管含有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。孢子形成的真菌生长在培养皿中包含Czapek琼脂为5天28ºC。

生产的玻璃瓶

木聚糖酶是厄伦美厄烧瓶内使用125毫升,包含酵母树皮提取物(0.5%)、木薯(2%)、(0 5%)葡萄糖和50毫升水。浓度的培养液准备106毫升孢子¹,发酵是维持在26°C和130转72 h。

木聚糖酶pre-purification

木聚糖酶是由丙酮沉淀pre-purified通过添加溶剂粗提物的比率30%酶和70%的丙酮;材料然后在5000转离心20分钟在4°C。沉淀溶解在50毫米醋酸缓冲,pH值5。随后,决定总蛋白质和酶活性的测定和沉淀酶被用于其他程序。

测定总蛋白质含量的酶提取

布拉德福德的方法被用来测量总蛋白质含量(13]。吸光度的解决方案是使用分光光度计测量595海里(Biochrom天秤座S6^®英国剑桥大学)。

酶测定

木聚糖酶活性决定根据贝利等描述的方法。14),和自由糖分析di-nitro——发布的水杨酸所描述的方法,如米勒(15]。一个单位的酶活性被定义为所需的酶生产1μmol还原糖(测量各自的单糖)每分钟通过水解各自指定的试验条件下原油衬底。

pH值对酶活性和稳定性的影响

木聚糖酶的酶活性的最佳pH值是决定使用不同的缓冲区在50 mM:醋酸缓冲(pH值4.2 - -6.0),磷酸缓冲(pH值6.0 - -7.0)和Tris-HCl缓冲区(pH值6.5 - -8.0)。pH稳定性是由孵化反应混合物在同一个缓冲区。整除拍摄在0、120和180分钟来确定每个时间点的木聚糖酶的活动。酶活性测定如前所述。

温度对酶活性和稳定性的影响

最适温度是由测量的木聚糖酶活性的粗提物在不同温度范围30 - 80°C。确定热稳定性,这种酶受到相同温度的最佳温度。整除拍摄在0、120和180分钟来确定他们的具体活动。每个时间点的样本受到酶活性测量如前所述。

的激活或抑制金属离子对木聚糖酶的活动

下列离子浓度进行了测试在5和10毫米的铜^{2 +}、锰^{2 +}、Na +铁^{2 +}、锌^{2 +}、镁^{2 +}、钙^{2 +}K⁺和钠⁺。木聚糖酶的抑制或激活度是评价通过对酶提取离子和抑制剂30分钟,其次是木聚糖酶活动的测量。

动力学参数

动力学参数,五个不同浓度的山毛榉木木聚糖(4 - 12 g.L¹)在恒定的酶浓度准备。化验标准下进行试验。动力学参数(K_米和V_马克斯从Lineweaver-Burk情节)计算确定。

效果模拟单胃的上部消化道条件对木聚糖酶的活动

模拟单胃的消化测定体外,被博伊斯和沃尔什(16]。肠道消化模拟测试的化合物通过添加胰蛋白酶和1%牛磺胆酸4 h。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶谱

聚丙烯酰胺凝胶电泳根据执行(sds - page)方法Laemmli [17),使用凝胶4.9%和15.4%的浓度来实现分离。样本生成条件发酵生物反应器中产生的最佳产量和发酵浓度mg.mL 100人和200人¹蛋白质。乐队的分子质量是决定使用LabImage 1 d软件(Loccus生物技术、巴西)。的酶谱进行聚丙烯酰胺凝胶(15.4%),根据Matteotti描述的方法等。18]。

统计分析

Statistica Version 7.0 (Statsoft,塔尔萨)软件用于数据的图形分析。所有的实验进行了一式三份,结果表示为平均值±标准偏差(SD)。的影响变量和回归系数的意义取决于学生的t测试(p < 0.05) (19]。

结果与讨论

的木聚糖酶的活动曲霉属真菌寄生阶层5963年调查在不同pH值使用birchwood木聚糖为底物。我们的结果表明,酶仍活跃在pH值与最大活动范围从4.2到8.0不等pH值在5.0 (图1)。pH值对木聚糖酶的稳定性的影响进行了研究。木聚糖酶产量从5963 a .寄生URM显著增加随着时间增加,剩余活动得到最大值(163年4%)在180年后min-incubation pH值6.0 (图2)。

木聚糖酶活性也决定在标准试验条件下在不同的温度下(图3)。结果表明,xilanase活动随着温度的增加而增加,达到最大值在30 - 60°C之后急剧下降在70°C和80°C。热稳定性是决定通过测量剩余活动孵化后纯酶在不同的温度。酶保留其全部活动后180 min-incubation 50°C。

大多数的真菌木聚糖酶报告日期是最佳活跃在酸性pH值(pH值4.5 - -6.5)或中性pH值范围(20.- - - - - -22]。通常,大多数从真菌木聚糖酶的最佳温度通常是45到60°C (23- - - - - -26]。

金属离子的影响酶活性所示表1。在试验使用离子浓度5毫米,只有Ca^{2 +}离子不影响酶活性。席尔瓦et al。21),使用木聚糖酶产生的曲霉属真菌tamariiURM 4634,报道,Ca^{2 +}离子不影响酶活性在1毫米(101.1%),然而当分析5毫米时,抑制剩余活动为93.1±0.07%到6.9%。10毫米离子影响最大的酶活性是Fe3 +和Mg^{2 +},酶保留85.52±0.16,86.93±0.28剩余活动,分别。最高的价值发现的抑制所有化验(5和10毫米)为15.74%,酶保持84.26±0.00%的剩余活动。用黑曲霉US368, Hmida-Sayari et al。19)发现抑制当受到酶Mn 20±0.03%^{2 +}离子。这一结果表明,木聚糖酶曲霉属真菌寄生5963年URM有潜力用于饮食单胃的动物,尤其是矿物补充治疗是在动物生产。

表1。的激活或抑制金属离子对木聚糖酶的活动。

产生的木聚糖酶的动力学常数曲霉属真菌寄生URM 5963 1.5 g.L¹(K_米)和9.19 U mL¹(V_马克斯);根据这个值,相比与其他真菌物种K_米,指出,该木聚糖酶可以被认为是更具体的底物利用一次K值_米较低:黑曲霉GH10 (2.43 g.L吗¹)(Chantasingh等。)271957)和黑曲霉DSM (25 g.L¹)(他et al。)但不如木聚糖酶由特定的曲霉属真菌tamariiURM 4634(0.464)(席尔瓦等)。V_马克斯值xylanse从曲霉属真菌寄生5963 (9.19 U.mL阶层¹)低于获得黑曲霉DSM 1957(5000μmol /分钟/ mg)(他等)曲霉属真菌tamariiURM 4634 (63.39 U mL¹)[21,28]。

在这项研究中产生的木聚糖酶表现积极的存在消化酶从单胃的动物体外。酶活性最低的是大约37.75%的胃条件(胃蛋白酶+盐酸),和它的活动是高于6%,以应对肠道活动(63.5%在胰液素和胆汁提取试验和81.7%胰蛋白酶和牛磺胆酸)。完整的消化模拟时,木聚糖酶活性为194.7%,结果越好。曲霉属真菌产生的木聚糖酶tamarii URM 463421)获得了更好的性能在胃条件下65%的酶活性,但在instestinal和完整的消化其性能是最低(分别高于70%和106%)比木聚糖酶由曲霉属真菌寄生阶层5963年。相同的microrganism(产生的木聚糖酶曲霉属真菌tamariiURM 4634)但在不同条件下更敏感的条件模拟单胃的消化活动越来越低(胃蛋白酶- 22%;胰液素+胆汁中提取29%;tripsin +牛磺胆酸(- 44.53%)29日]。这些结果表明,酶保留其活动或强的消化酶从单胃的动物,和体内消化系统组件的存在可以提高酶的性能(16]。

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