生产和优化的Polyhydroxyalkanoate油质的细菌芽孢杆菌ISTC1 Sp

文摘

现在的工作涉及隔离和筛选菌株杆菌sp。ISTC1生产PHA和选定的工艺参数的优化增强PHA和生物量的生产。所选菌株的筛选PHA生产是基于尼罗红染色,荧光显微镜可视化,spectrofluorometric尼罗红荧光测量的细菌培养有0.5% (w / v)葡萄糖作为碳源。用气相色谱-质谱作为3-hydroxyvalerate的存在显示确认PHA积累的分析。检测特征官能团的红外光谱进一步证实了PHA的细菌的生产。响应面方法(RSM)是用于优化pH值、时间和碳源浓度增加PHA生产。将优化的条件与预先优化,几乎增加了60% PHA的生产。因此发现从而建立了生产的PHA杆菌ISTC1 sp。

关键字

优化;Polyhydroxyalkanoate;3-hydroxyvalerate;芽孢杆菌sp;响应面方法

介绍

我们都知道由于人工干预,世界是欢迎我们有这么多奇怪的并发症,但除了这些我们人类创造一个更大的混乱的塑料行业。50多年连续增长,2012年全球塑料产量增至2.88亿吨比2011年增长2.8%和2013年的情况不是更好。它不断上升近2.99亿吨的塑料生产在2013年比2012年高出3.9%的输出,以惊人的速度预计将进一步增加在不久的将来。幸运的优势,这样的生物聚合物表现出相似的物理和机械性能的塑料。有些细菌物种自然积累能力在他们的细胞。因此,一个长期的和成本有效的策略来培养这种类型的微生物可以积累和生产易降解生物聚合物最终将帮助我们在控制塑料行业的这种洪水情况。Polyhydroxyalkanoates (pha)是生物可降解的、生物相容性和热稳定的生物聚合物,合成了几种细菌作为储备食物材料的能源(1)通常在增长的限制营养条件。从结构上看,他们是聚酯,含有(R) -hydroxyacyl单体的单位。PHA可以合成为均聚物或共聚物甚至他们基于所选菌株和混合生长基质的供应。在近150个不同的PHA单体确认直到现在,保利(3-hydroxybutyrate) (PHB),短链长度PHA (scl-PHA) 3 - 5碳原子,是第一个和perfectly-characterized形式。其他形式,一般由微生物合成中等链长pha (mcl-PHA)拥有6到14个碳原子像poly-b-hydroxyvalerate (PHV),聚(3-hydroxyhexanoate)(收购PHH),聚(3-hydro-xyoctanoate)(越南河粉)2)和共聚物聚(3-hydroxybutyrate-co - 3-hydroxyvalerate) (PHBV)和聚(β3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyhexanoate) (PHBHHx) [3),长链长度PHA (lcl-PHA)包含15个或多个碳原子或共聚物scl-mcl PHA共聚物单体的亚基组成的碳(这与4 -4]。革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌已经知道PHA生产但是合成途径可能不同,例如一个enoyl-CoA水合酶,甲基malonyl-CoA PHBV合成途径从糖为代表Ralstonia eutropha,从脂肪酸或碳水化合物由假单胞菌。产碱杆菌属弦,固氮菌vinelandii,沙雷氏菌属spp杆菌,是一些商业上重要的PHA生产菌株。全球生物塑料市场预计将在2021年达到58亿美元。然而,它的高生产成本的主要约束PHA增长市场。因此,有必要寻找低成本可持续的替代和优化工艺参数对高生产这些生物聚合物。近年来,研究人员在这个领域更关注低成本的碳源生产的优化工艺参数生产效率最大化的生物聚合物(5,6]。许多统计技术的一个用于优化响应面方法(RSM)。先前的研究已经报道了使用RSM pha生产增加了不同菌株等芽孢杆菌coagulans,Rhodobacter sphaeroides,沙雷氏菌属sp.和r . eutropha(7- - - - - -9]。本研究的目标是孤立和屏幕菌株芽孢杆菌sp。ISTC1生产、描述和优化的工艺参数用RSM增强PHA和生物质生产。

方法

孤立的微生物和文化条件

样本从大理石的岩石分离palaeoproterozoic变质沈积物Aravali超级集团的拉贾斯坦邦,印度,在热压处理过的蒸馏水溶解。溶解样品(1毫升)无菌过滤和作为培养液(1:10 v / v)在最小盐介质(MSM)包含(g.L⁻¹):Na₂HPO₄•2 h₂啊,7.8;KH₂阿宝₄6.8;MgSO₄0.2;纳米₃0.085;ZnSO₄.7H₂啊,0.05;ZnCl₂0.02;Ca(不₃)₂2.4 h₂啊,0.05。菌株培养在男男同性恋者为15天30°C, 150 rpm和pH值7.5。细菌社区的成员来自男男同性恋者文化传播在LB-agar盘子。形态不同的隔离是分开re-cultured LB-medium和隔夜的文化压力离心机(7000 rpm, 10分钟)和细胞颗粒转移到矿物介质(毫米)(pH值7.0)[10]包含(g.L¹):KH₂阿宝₄1.5;Na₂HPO₄6.78;氯化钠,0.5;NH₄(CH₃首席运营官)3铁,0.06;1米MgSO₄2 mL.L⁻¹;1米CaCl₂0.1 mL.L⁻¹;1 mL.L⁻¹微量金属解决方案(g组成。L⁻¹):ZnSO₄0.1;H₃薄₃0.3;CuSO₄0.006;NiCl₂.6H₂啊,0.020;Na₂MoO4.2H₂啊,0.030;MnCl₂.2H₂啊,0.25,补充以0.5%葡萄糖作为碳源,在有氧条件下孵化30°C和150 rpm,他们的增长模式是决定的基础上吸收分光光度计卡里的595海里,100年生物(瓦里安有限公司、澳大利亚)。

由16 s rRNA方法鉴定细菌

细菌基因组DNA分离与基因组DNA工具包(美国试剂盒Inc .)所规定的制造商。16 s rRNA基因从基因组DNA,采用聚合酶链反应放大通用引物5′GAGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′(向前)和5′-CTACGGCTACCTTGT-TACGA-3′(反向)。使用引物进行PCR扩增DNA在下列条件下热循环:10 - ng模板DNA, 5毫升10反应缓冲区,2.5 U Taq DNA聚合酶,1毫米底漆,1毫米反向引物,每个核苷酸的200毫米和水总量的50毫升。管在94°C孵化五分钟,然后接受下面热循环计划:变性在94°C 2分钟,引物退火55°C 2分钟,在72°C和链扩展2分钟一个额外的扩展时间10分钟的最后一个循环,共30个周期。使用Qiaquick放大DNA纯化PCR净化设备(试剂盒Inc .)、美国),调整到200 ng / mL和克隆pDrive(美国试剂盒Inc .)和发送到SciGenom实验室科钦,印度为测序。测序数据比较和分析了现有的数据库的基因库,国家生物技术信息中心。系统发育树是根据序列。引导共识树(1000张)是由多个序列比对方法使用软件超级有邻居加入,与不同种类的细菌(版本6.111]。

筛选菌株的PHA生产

荧光可视化:观察荧光可视化PHA的积累与尼罗河红测试轻微修改(12]。短暂,1毫升的细菌培养30°C, 150 rpm在基本培养基与0.5%葡萄糖碳源是收获72 h。细胞颗粒从而获得与PBS洗两次(磷酸缓冲盐,pH值7.4)。然后固定在乙醇:醋酸(1:3)10分钟,再用PBS最后沾尼罗红(10 gl¹)5分钟。安装在玻片可视化之前,固定混合是由低熔点琼脂糖在1:1的比例为1%。这使我们继续向可视化在显微镜下用这项工作(100年蔡司HBO荧光显微镜)存在细胞内的PHA的Nile-red橙色荧光的强度以560海里励磁和590 nm发射波长。萤石指标可视化的基础上选定的应变显示荧光,它被选为PHA生产。

Spectrofluorometric观察:观察细菌细胞内积累PHA spectrofluorometrically尼罗红在描述的过程(修改后13]。芽孢杆菌sp.在毫米以0.5%葡萄糖培养。然后在有氧条件下孵化在30°C和150 rpm为7天。荧光细菌培养的测量与10μg /毫升尼罗红染色后在488 nm激发波长575 nm和590 nm PHA发射波长,每24 h为0 h作为控制。表明细胞内的PHA的存在表明了Nile-red橙色荧光的强度用日本岛津公司RF - 5301 PC Spectrofluorophotometer测量。同时,细菌细胞的增长表示为光密度介绍过o。d。邓肯()在卡里的595 nm 100生物紫外可见分光光度计也记录下来。

测定细菌生物量、PHA的提取和计算重量的细胞:芽孢杆菌sp.在毫米以0.5%葡萄糖培养。当时在有氧条件下孵化30°C和150 rpm, 3天(72小时)后收获。离心后(8000 rpm, 15分钟),每100毫升细胞生物量表示为细胞干重文化肉汤、决心、洗涤(MilliQ水)和烘干(60°C, 24 h)称量干球紧随其后。PHA隔离,生物质(冻干细胞)氯仿处理如上所述在确认分析。正己烷沉淀和干样品在克重确定PHA产量每克细菌干重。

确认分析PHA生产

gc - ms分析:学习时的PHA内容菌株,根据冻干和干细胞处理(14]。干细胞最初受到甲醇分解的甲醇(1.7毫升),98%硫酸(0.3毫升),和氯仿在100°C(2.0毫升)140分钟。随后的1.0毫升的水相分离的反应混合物。有机层分层,下层用于气相色谱质谱(GC - MS)分析日本岛津公司GC-MS-QP 2010 +配备了毛细管柱Rtx-5MS(尺寸:0.25微米膜厚度,0.25毫米ID, 30米长)。1μl氯仿的样品注入气喷射器港口和条件设置用细微的修改:初始温度60°C 3分钟;温度从60岁提高到320°C的速度每分钟12°C,保存时间:8分钟)。使用前进一步的数据,数据匹配的gc - ms内置标准质谱库NIST-05 Wiley-8。

傅立叶变换红外光谱分析:芽孢杆菌sp.首次培养与0.5%葡萄糖毫米。72 h后文化是收获和收集细胞MilliQ水清洗和冻干。积累的pha和氯仿提取干细胞在70°C 72 h,然后用10卷的己烷沉淀风干和重(14]。傅里叶变换红外光谱法(ir)是用来记录的PHA光谱干样品使用瓦里安7000红外光谱(美国优秀公司,韦尔斯利,MA)在室温下(27°C)。0.01 g的粘贴干己烷沉淀后剩余样品准备的比率5:100 KBr和频谱是读400 - 4000 cm - 1的范围,申请64扫描每样例4 cm - 1的决议。

透射电子显微镜(TEM):72 h的细菌培养MM被冷却,然后固定4°C。这是立即添加戊二醛(2.5%)紧随其后。然后用PBS缓冲洗(0.1 M, pH值7.2),进一步固定使用1%水锇tetraoxide(如二次固定剂)在室温下2小时。脱水的样本进行分级系列的丙酮(50%、70%、90%和100%)的孵化2 h在每个浓度,除了70%的乙醇,在一夜之间完成。样本与环氧树脂混合物渗透CY212 (TAAB实验室设备、博克斯和英国)。超薄部分被用玻璃刀切割,复染色用2%醋酸双氧铀和0.2%醋酸铅和检查在TEM (2100 f, JEOL、东京、日本)的加速电压120 kV。

优化PHA生产

培养条件优化实验:优化实验芽孢杆菌sp, ISTC1 pre-cultured磅和接种250毫升厄伦美厄烧瓶在有氧条件下,100毫升的MM在30°C和150 rpm与% 72 h和补充葡萄糖浓度(0.25、0.50和1.00),pH值范围(4、7和10)和收获三个不同的时间段(1日第3,第5天)按实验设计。基于前面的,不断重复实验菌株,选择三个变量的范围和水平。PHA的重量和生物质,作为回应,PHA优先。PHA的重量和生物量计算正如前面部分中描述的方法(PHA)的分析。

Box-Behnken设计和统计分析:葡萄糖浓度的优化,完美的收获时间和pH值最大的PHA和生物质产量芽孢杆菌sp.使用Box-Behnken设计完成(bdd)的响应面方法(RSM)设计专家的帮助下10 (Stat -缓解Inc .,明尼阿波利斯,美国)。一组17个实验来评估三个变量的影响即,%葡萄糖浓度、pH值和收割时期,每个都有三个不同的浓度水平低(1)、中(0)和高(+ 1)在两个反应,PHA的重量和生物量均以g (g)每100毫升的文化。实验设计矩阵来源于Box-Behnken模型编码的最小,媒介和最大水平的三个变量及其实际值选择不同实验集17所示表1。bdd模型预测最优条件可以表示一个二阶多项式方程的形式为佛还允许:Y =βo +Σβi^x我+Σβij^x我^xj +Σβii^xii2 +ὲ,βo、βiβij拦截的回归系数,分别不同因素之间的线性和交互。Y是预测的反应;^x我和^x编码单元和ὲj是独立的因素是随机误差项15,16]。方差分析(方差分析)是用来确定统计参数。回归系数(R2)计算,找出模型的拟合优度。条款和方程的意义模型评估使用野生。三维响应面图得到可视化的个体和互动影响因素对两个响应如图所示。每个因素的水平是最大响应生成优化利用数值优化期望函数。实验(一式两份)条件和预测模型的验证是检查通过比较结果与模型预测值。

表1:盒子-Behnken设计流程优化的独立变量。

因素1:葡萄糖浓缩的。(%)。

因子2 b:时间(天)

因素3 c:pH值

结果和讨论

鉴定的菌株16 s rDNA序列分析

在目前的研究中,菌株分离palaeoproterozoic大理石岩石的变质沈积物的Aravali超群,拉贾斯坦邦,印度为孤立的油质的细菌PHA生产。菌株(C1)显示更高的光学密度选择16 s rDNA测序。爆炸产生的序列进入核苷酸搜索程序的国家生物技术信息中心获取系统发育密切相关序列表明相似的隔离芽孢杆菌sp。一对明智对齐选择最接近的匹配和种系发生树是使用大型6.1见解,阐明微生物群落。16 s rRNA基因测序已经非常有用的用于描述细菌的成分图1显示了应变C1的种系发生树显示亲缘芽孢杆菌sp。发现ISTC1,芽孢杆菌sp,是一个嗜中温细菌,因为它显示重要的代谢活动的温度范围25-37°C。

PHA生产菌株的选择

一个孤立的菌株芽孢杆菌sp。ISTC1(基因银行加入number-KT948966)隔绝大理石的岩石palaeoproterozoic变质沈积物Aravali超级集团的拉贾斯坦邦,用于筛选和研究MM PHA生产介质(pH值7.5)补充0.5%葡萄糖作为碳源和孵化在有氧条件下30°C和150 rpm好几天了。PHA和脂肪酸的生物合成或脂质进行通过一个共同的中间,(R) - 3-hydroxyacyl辅酶a,造成β-oxidation [17]。研究了指导生产微生物的新陈代谢PHA通过脂肪酸途径(18]。芽孢杆菌sp.革兰氏阳性细菌在肠杆菌科,商业已经用于生产各种酶、生物表面活性剂,生物塑料,抗氧化剂19]显示大约50%的细胞干重积累PHB sp.这个类。在这些工作的基础上,一些结果的正方向,我们进行选择芽孢杆菌ISTC1 sp。

筛选菌株的PHA生产

荧光显微镜的可视化PHA生产:尼罗红荧光显微镜用于所选菌株的筛选PHA和脂质积累在560 nm和590 nm)激发和发射波长,分别。尼罗红染色和低熔点琼脂固定细菌细胞被发现显示出强烈的荧光在毫米72 h孵化后以0.5%葡萄糖作为碳源。菌株表现出荧光图2一个使用尼罗红染色,这是进一步进行,PHA分析。尼罗红(9-diethylamino-5H苯并[a] phenoxazine-5-one)是一种亲脂性的荧光染料,常用于检测的PHA和脂质含量微生物如细菌、微藻(20.]。细菌合成和储存PHA和脂质作为不溶性夹杂物作为储备食品材料在其细胞的存在丰富的碳源和营养限制条件,尤其是氮、抑制PHA的生产。绑定的尼罗红与这些细菌细胞内脂质和聚合物颗粒给特定波长的荧光。因此,脂质颗粒在菌株的存在证实了尼罗红荧光。

PHA积累Spectrofluorometric分析:Spectrofluorometric监测芽孢杆菌sp。ISTC1文化MM,是用尼罗红染色PHA和脂质积累了8天。细菌培养的同时增长测量也由使用分光光度计测量吸光度在600海里。图2 b显示了荧光在575 nm和590 nm和生长曲线。最大荧光观察细菌生长为575 nm,第三天达到1天内固定相。在荧光逐渐下降伴随着增长大幅下降后第三天。较小的荧光观察在590 nm比575海里。从结果可以推断,张力显示最大PHA和脂质积累72 h。有一个快速下降,细菌生长在批文化中消耗的碳源。在这样饥饿条件下,PHA作为碳和能源储备和迅速氧化,延缓细胞成分的降解,从而增加应变生存在不利条件下(21]。这可能解释了逐渐下降荧光相比大幅下降,细菌生长后第三天的孵化。尼罗红是一种异染性的染料和显示橙红色荧光在疏水环境。染料是一种常用的重要染色检测细胞内的脂质和PHA的激发波长488 nm和发射光谱从570到595海里22]。最初的逐步检测这两个波长的荧光随时间可能与细胞的渗透性尼罗红染色以及细菌细胞内的脂质和聚合物颗粒大小(23]。

确认分析PHA生产

PHA的gc - ms分析和脂质:的原位transesterified样本芽孢杆菌sp。ISTC1, gc - ms概要描述PHA的存在,3-hydroxyvalerate 16.35 (RT)和脂肪酸甲基酯(饥饿),如棕榈酸甲酯、戊酸,Cyclopentaneundecanoic酸甲酯,13-Docosenoic酸甲酯、二十烷酸甲酯在细胞。结果也证实细菌生产3 - hydroxyvalerate、单体的单元的聚(3 - hydroxyvalerate) (PHV)这是一个non-PHB介质均聚物链长(mcl-PHA)。有几个生产报告的PHB的细菌。,3 - hydroxybutanoic酸提供刚度,3-hydroxypentanoic酸促进灵活地聚合物的分水岭,这是由碳和氧的原子。PHV也已被证明能够形成solution-grown单晶具有独特的水晶和层状结构24的芽孢杆菌周效磺胺-乙胺嘧啶(图4)。

PHA通过红外分析:非破坏性的衰减全反射傅立叶变换红外进行了己烷沉淀PHA样本。官能团的分配中所示表3和4是根据先前的报道(14,25,26]。观察到的红外吸收3420.17 cm - 1是由于羟基的伸缩振动地聚合物链。特征峰在2955.15 cm - 1和2923.97 cm - 1分别分配给非对称甲基(CH3)和非对称CH2的横向单体的链。激烈的峰值为2855.32 cm - 1由于对称甲基和可能是由于构象障碍发生在结晶过程中(27]。观察到的吸收带为1742.11 cm - 1据报道PHA标记乐队已经分配给羰基伸缩振动的(C = O)酯键。观察到的乐队在1659.11和1459.39 cm - 1被分配到细菌细胞内的伸展振动酰胺(-CO-N) I和II,分别。吸收1376.163 cm - 1和1260.32 cm - 1被分配到终端甲基组和非对称C-O-C伸缩振动。几个吸收波段观测从1167.72 cm - 1到619.137 cm - 1是分配给切断和碳碳伸缩振动。因此,沉淀材料建立了PHA的峰值。

表2:PHA的重量和生物量每100毫升文化(g)之前和之后的优化。

TEM观察细菌细胞内的PHA颗粒:透射电子显微镜研究执行控制和72 h培养细胞显示更高的PHA积累72 h的细菌细胞内颗粒样品。结果进一步证实PHA的生产压力。类似的图像的可视化PHA颗粒内的细菌细胞已被证明,2,28]。有涂层的磷脂和蛋白质单层对这些颗粒和相关的蛋白质参与颗粒的形成和PHA合成和降解的。

RSM流程优化:响应面方法(RSM)是用于流程优化。Box-Behnken设计(bdd),一种RSM被选为创建二次响应模型。二次方程被用来画三个因素之间的关系(葡萄糖、时间和pH值)和两个反应(PHA和生物质生产)。回归方程的系数计算和数据拟合二阶多项式方程的重量PHA和生物量在g每100毫升的文化。编码方程得到盒子——Behnken设计(bdd)重量的PHA和生物量芽孢杆菌sp.如下软件给出建议:

PHA(毫克/ 100毫升)= + 79.61 + 4.59×9.60×7.55×B + C + + 14.58×ab -公元前AC + 7.63×3.71×20.86×a2 - 18.18×b2 - 28.45×C2…方程(1)

生物质(g / 100 ml) = 0.003 + 0.16 + 4.375 e - e - 003×6.591×A + B + 0.011×C + 4.727 e - 0.003×ab - 1.121 - e - 003×AC + 1.000 e -公元前003×0.015×-0.017×a2 - 0.017×B2 C2………。方程(2)

统计分析

个人因素的作用及其双重交互响应显示通过对比因素系数的方程。积极的系数值表明个人或双互动因素积极影响响应,而负系数值表明,降低反应测试范围的因素。在方程式的系数值。(1)和(2)表明PHA的重量增加,增加在所有三个factors-Glucose,持续时间和pH值但生物量降低,增加葡萄糖的重量,持续时间增加而增加第三个参数博士联合互动的葡萄糖浓度和pH值有一个负面影响PHA的重量和生物量,而集体效应的pH值和时间,和葡萄糖浓度和时间积极和消极的影响分别PHA和生物反应。方差分析(方差分析)是用于定义模型的充分性。模型的f值为163.17的重量PHA和63.93的生物量芽孢杆菌sp。ISTC1意味着模型具有重要意义。发生的几率更大的f值由于噪音只有0.01%。“缺乏适合F值“体重的11.26和3.50分别PHA和生物量,意味着缺乏合适的相对于纯错误并不重要。R2系数提供了总额的比例变化的响应预测的模型,证明令人满意的调整二次模型的实验数据。高R2值接近1比R2与调整和合理的协议是必要的。Adeq精密”措施的重量分别PHA和生物量,表明一个适当的信号。这个模型可以用来导航的设计空间的模型。变异系数(CV)的比例是标准估计误差的平均值响应。它描述了模型的可复制性。一个模型通常被认为是可再生的,如果它CV %不大于10。 The values of CV % are 5.39 and 2.16 for weight of PHA and biomass respectively. So, the reproducibility of the model is confirmed by the fact that both the values are less than 10.

互动的影响因素对PHA和生物量的重量

三维图形反应生成的模型方程的基础上研究的互动影响三个因素对两个反应。响应面图PHA的重量和生物质所示图5。这些情节描述任意两个因素的相对影响,同时保持恒定的第三个因素。发现在PHA的重量的情况下,效率增加,pH值8之后,进一步增加在pH值下降时显示后中间的葡萄糖浓度增加有下降(图5 b)。然而,对于生物质,有酸性pH值,有一个急剧减少,但增加葡萄糖的浓度,有一个边际生物量下降(图5 e),这个数字显示时间的交互影响和葡萄糖浓度在PHA的重量和显示值中间点附近有最积极的影响有一个小平面度更高的浓度。根据图5 f、互动效果的持续时间和葡萄糖浓度生物质产量几乎与PHA相似。然而,最大生物量是观察到一个中间时间虽然有生物量随着葡萄糖浓度逐渐下降。时间随着pH值的影响显示中间值作为最佳的反应。PHA的重量和生物量最大值在中间时间而有8 (pH值之上和之下的急剧下降图5、5 c, 5 d和5 e)。因此,这些情节表明,pH值起着非常重要的作用在高反应生成葡萄糖浓度有温和的影响。轻微的碱性pH值,近3天时间和中间葡萄糖浓度对PHA的重量和生物量都有积极作用。结果,因此,确认PHA生产芽孢杆菌ISTC1 sp。

验证结果

验证实验与数值优化水平的实验变量进行了以确认方程的适用性。(1)和(2)最大响应代(表2)。优化条件的预测软件最大的PHA和生物质生产0.6771%葡萄糖浓度、持续时间和p H 7.67702和3.6223天的预测生产PHA和生物量分别为0.08244 g和0.1653 g / 100毫升文化分别在0.943愿望。PHA的重量和生物量达到验证试验在预测条件后发现每100毫升0.08119 g和0.1675 g文化分别。因此,验证实验的结果建立预测模型的准确性。PHA和生物量的重量(每100毫升文化)优化之前,最初的实验条件为0.5%葡萄糖pH值7.5后3天分别是0.0511和0.1456 g。因此,优化后的葡萄糖浓度、时间、pH值、生产PHA和生物量的增加几乎60% (0.081 g)和15% (0.167 g)分别为每100毫升的文化。革兰氏阴性细菌,贪铜菌吊钩虫拿、产碱杆菌属弦和重组大肠杆菌,已被用于生产PHA在工业规模,然而,革兰氏阳性细菌,芽孢杆菌megateriumSW1-2,可以使用廉价的原材料PHA用于生物医学应用(29日]。芽孢杆菌种虫害已报告积累9至67%(细胞干重)的PHA当生长在不同的衬底(30.]。Steinbuchel et al。29日生产的PHV)首次报道色素细菌violaceum。菌株被发现产生2.48克每100毫升PHV从300 L规模馈料式发酵罐(31日]。福井等。32]报道生产PHV 0.002 g / 100毫升干重)的重组R。eutrophaPHB-4,然而,一个油腻的细菌,沙雷氏菌属sp, ISTD04被发现产生0.082克PHV每100毫升细胞干重(14]。在另一项研究中,生产均聚物聚(3-hydroxyvalerate) (PHV)重组气单胞菌属hydrophila应变4 ak4摇动烧瓶报道是每100毫升0.27 g细胞干重的33]。生物量和PHA生产的模型是足够足够的描绘从高F值(分别为63.93和163.17)和无关紧要的缺乏合适的概率(F = 3.50和F = 4.37)。此外,决定系数(R2)被关闭团结、生物量和PHA生产分别为0.9697和0.9821。这表明该模型解释分别约为96.97和98.21%的变化反应。三维响应面和等高线图2 d描绘了生物量的变化和PHA生产作为交互的函数的变量(图5)。从这个图得出提高C / N比和磷酸盐浓度导致了生物质生产的崛起作为时间的函数。

表3:山峰在傅立叶变换红外光谱以及相应的注释。

表4:gc - ms数据表PHA和饥饿。

关于PHA生产、椭圆轮廓图的性质表明,在三个变量的交互作用在聚合物积累产生重大影响。PHA生产的芽孢杆菌sp。ISTDC1,细胞干重的49%,通过使用低浓度的葡萄糖(34]。为了降低整体成本,PHA高生产率和高收益是必需的;因此,在本研究中采用优化流程,降低成本。在早期的研究中,PHA生产增强是由于相互作用葡萄糖与硫酸铵b . megateriumOU303A, B .仙人掌SPV和B。thuringienesisIAM12077,而在b . megateriumNCIM和b . megateriumSRKP-3 PHA生产没有增加(29日]。尽管如此,PHV由芽孢杆菌sp。ISTC1在这项研究是比不上一些先前的报道在其他细菌,但只使用矿物PHV媒体的优化生产碳源浓度较低的像葡萄糖使找到重要的PHA生产颗粒在细菌细胞,进一步可以收获以低成本生产生物塑料和其他复合材料。

结论

目前的工作参与生产和优化的均聚物聚(3-hydroxyvalerate) (PHV),制程- PHA的一种芽孢杆菌sp。气结果证实3 - Hydroxyvalerate的生产,这是一个单体PHV,芽孢杆菌sp。ISTC1培养在矿物媒体补充葡萄糖作为碳源。PHA生产增长60%后,优化了成功应用的RSM Box-Behnken设计增强PHA生产流程优化。

确认

作者感谢科技部(DST)和大学拨款委员会(UGC),新德里,印度政府,提供研究奖学金。我们感谢马丹Kumar他的慷慨帮助和支持Pooja Ghosh博士在实验工作和为她在RSM数据分析指导。我们还要感谢Ajai Kumar博士Manoj普拉塔普辛格博士和Gajendra赛先进的仪器研究设施,贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学和新德里对全球大气环流模型,红外光谱和透射电镜分析,分别。

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